專利名稱：：一種檢測(cè)炔諾酮的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)炔諾酮的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
：炔諾酮是一種甾類同化激素，其結(jié)構(gòu)式如圖l所示，被大量用于促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)。但是，研究表明炔諾酮有明顯的致癌性，人食用了含有這類藥物的畜禽產(chǎn)品也容易被致癌。歐美等國(guó)家已相繼禁止或嚴(yán)格禁止使用炔諾酮。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件中規(guī)定，動(dòng)物源性食品中炔諾酮的殘留限量為不得檢出。因此，在實(shí)踐中，需要一種精確度、靈敏度高的檢測(cè)炔諾酮方法。目前，動(dòng)物組織中炔諾酮?dú)埩袅康某Ｒ?guī)檢測(cè)方法主要有液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)、高效液相色譜(HPLC)等，但是這些方法存在著儀器設(shè)備復(fù)雜、檢測(cè)過(guò)程繁瑣和對(duì)檢驗(yàn)人員的技能要求高的缺點(diǎn)，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的篩查，推廣應(yīng)用受到限制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)炔諾酮的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)炔諾酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括炔諾酮半抗原和炔諾酮的特異性抗體；所述特異性抗體為所述炔諾酮的多克隆抗體或單克隆抗體；所述炔諾酮半抗原的結(jié)構(gòu)式如下其中，所述炔諾酮半抗原和炔諾酮的特異性抗體可以以下述任一種形式存在:1)將所述炔諾酮半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到炔諾酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，將其作為包被原，所述特異性抗體進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物；2)所述特異性抗體為包被原，所述炔諾酮半抗原進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物。所述試劑盒還可以既包括炔諾酮半抗原和炔諾酮的特異性抗體又包括抗抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；其中，所述炔諾酮半抗原和抗抗體可以以下述任一種形式存在1)將所述炔諾酮半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到炔諾酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，將其作為包被原，所述抗抗體進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物；2)所述抗抗體為包被原，所述炔諾酮半抗原進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物。所述炔諾酮多克隆抗體或炔諾酮單克隆抗體，均是以炔諾酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白可為甲狀腺蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、兔血清蛋白、血藍(lán)蛋白、纖維蛋白原或卵清蛋白等。所述單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCC2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3分泌產(chǎn)生的抗體。所述炔諾酮多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體。為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還可包括炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。其中，所述濃縮洗滌液可為含有0.7%-1.4%吐溫-80、0.02-0.05%硫柳汞防腐劑、pH值為6.4-6.8、0.05-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液可為含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.l-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分所述酶標(biāo)記中所用的標(biāo)記酶可為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶；當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液可為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色液B液可為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液可為l-2mol/L硫酸或鹽酸溶液；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，顯色劑可為硝基磷酸鹽緩沖液，終止液可為l-2mol/L氫氧化鈉溶液。所述濃縮洗滌液具體可為含有1.0%吐溫-80、0.03%硫柳汞防腐劑，pH值為6.8、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液具體可為含有4%卵清蛋白、pH值為6.8、0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液；所述底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，所述底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為2mol/L的鹽酸；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。本發(fā)明中，在洗滌液中加入一定量吐溫-80和硫柳汞的作用在于吐溫-80會(huì)減少抗體的非特異性吸附，還能對(duì)蛋白起到一定的保護(hù)作用；則硫柳汞在溶液中能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)溶液的穩(wěn)定性起到一個(gè)保護(hù)作用。所述抗抗體進(jìn)行酶標(biāo)記的方法是采用過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到酶標(biāo)抗抗體；所述過(guò)碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2:1。本發(fā)明的該改良的過(guò)碘酸鈉法省略了封閉酶上氨基的步驟，節(jié)省了時(shí)間，又降低了辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。炔諾酮是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。因此將炔諾酮通過(guò)琥珀酸酐法合成炔諾酮半抗原，這樣突出了炔諾酮分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)，使制備的炔諾酮抗體對(duì)炔諾酮的特異性很高。將炔諾酮半抗原與人血清白蛋白采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原，其中，炔諾酮半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過(guò)低或過(guò)高都對(duì)免疫不利，炔諾酮半抗原與人血清白蛋白的結(jié)合摩爾比為14-16:l比較合適。在制備包被原時(shí)，炔諾酮半抗原與所述載體蛋白的摩爾配比為15:l比較合適。制作包被有包被原的酶標(biāo)板時(shí)，所用的包被緩沖液可以為pH值為6.2-6.6、0.lmol/L檸檬酸緩沖液；所用的封閉液可以為含有5-10%馬血清、10%酪蛋白、0.1-0.2。/。的明膠和pH值為6.2-7.4、0.2raol/L磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)炔諾酮的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)炔諾酮的方法，包括以下步驟1)樣品前處理，樣品的前處理主要是為了更精密的提取樣品中的目標(biāo)物，從而用于后續(xù)的檢測(cè)。當(dāng)所述樣品為動(dòng)物組織時(shí)，樣品前處理方法如下向每2.0g動(dòng)物組織勻漿物，加入6-9ml乙腈-O.05-0.15M氫氧化鈉溶液，再加入0.5-1.0ml含有0.3-0.4M二水合亞硝基鐵氰化鈉和0.9-1.2M硫酸鋅的溶液，混勻，再以3000g以上的速度室溫離心5-15min，取上清液，干燥，再用0.8-1.2ml上述任一所述濃縮復(fù)溶液充分混勻，再進(jìn)行3-5倍稀釋，取稀釋液進(jìn)行分析；當(dāng)所述樣品為飼料時(shí)，樣品前處理方法如下向每1.0g飼料樣品勻漿物中，加入8-llml乙腈-0.05-0.15M氫氧化鈉溶液，混勻，以3000g以上的速度室溫離心5-15min，取上層清液0.3-0.8ml，加入0.4-0.6ml0.05-0.15M氫氧化鈉溶液，混勻，加入4.5-5.5ml氯仿，混勻，再以3000g以上的速度室溫離心5-15min，取下層清液l-2ml，干燥，再用l-2ml上述任一所述濃縮復(fù)溶液充分混勻，再進(jìn)行3-5倍稀釋，取稀釋液進(jìn)行分析；2)利用上述任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)1)中所述稀釋液。由保藏號(hào)為CGMCC2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3分泌產(chǎn)生的炔諾酮的單克隆抗體屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。保藏號(hào)為CGMCC2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的檢測(cè)炔諾酮的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)樣品中炔諾酮的殘留量。本試劑盒中采用高特異性的炔諾酮單克隆抗體，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本試劑盒具有特異性高、靈敏度高、精密度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)；本試劑盒的主要試劑都采用工作液形式，使用方便，成本低廉。用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)炔諾酮的方法，操作簡(jiǎn)便，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的步驟，縮短了檢測(cè)的時(shí)間，對(duì)樣品的前處理要求低，能同時(shí)快速檢測(cè)大批量樣品。因此，利用本發(fā)明酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本的定性和定量篩査，將在炔諾酮的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。圖1為炔諾酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖2為炔諾酮半抗原的合成圖。圖3為以炔諾酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原、酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記物的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品曲線圖。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例l、以炔諾酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原、酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記物的試劑盒的制備及使用一、以炔諾酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原、酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記物的試劑盒的檢測(cè)原理如下當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上的包被原為炔諾酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液，再加入炔諾酮特異性抗體，樣本中殘留的炔諾酮藥物與酶標(biāo)板上炔諾酮偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)炔諾酮特異性抗體，再加入酶標(biāo)抗抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與炔諾酮藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中炔諾酮的殘留含量。二、以炔諾酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原、酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記物的酶聯(lián)免疫試劑盒一般可以包括如下1、包被有包被原(包被原為炔諾酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物)的酶標(biāo)板包被原的濃度可以為0.08-0.12l^g/ml;2、酶標(biāo)抗抗體工作液酶標(biāo)二抗為用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；酶標(biāo)二抗的稀釋液為含3-5%(質(zhì)量百分含量)卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.1-0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液；酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1:500。3、炔諾酮特異性抗體工作液可以為炔諾酮多克隆抗體工作液或炔諾酮單克隆抗體工作液；用稀釋液將炔諾酮特異性抗體稀釋3000倍，得到特異性抗體工作液，所述稀釋液為含有2.5%(質(zhì)量百分含量)人血清白蛋白和0.004%(質(zhì)量百分含量)疊氮化鈉、pH值為7.2、1.Omol/L的磷酸鹽緩沖液。4、炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品(北京賽福菜博科技有限公司)溶液6瓶，濃度分別為0化/L，0.llVL，0.3Pg/L，0.9Pg/L，2.7Pg/L，8.lPg/L;配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.l-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲或過(guò)氧化氫，7nil/瓶，l瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺，7ml/瓶，1瓶。6、終止液l-2mol/L鹽酸或硫酸；7、濃縮洗滌液含有0.7%-1.4%吐溫-80、0.02-0.05%硫柳汞防腐劑、pH值為6.4-6.8、0.05-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；40ml/瓶，1瓶；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。8、濃縮復(fù)溶液含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；50ml/瓶，l瓶；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。三、以炔諾酮半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為包被原、酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記物的酶聯(lián)免疫試劑盒的具體組成及其制備(一)組成1、包被有包被原(包被原為炔諾酮半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物)的酶標(biāo)板;包被原的濃度為0.1Cmg/ml;。2、酶標(biāo)抗抗體工作液用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；酶標(biāo)二抗的稀釋液為含有4%卵清蛋白、pH值為6.8、0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液，酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1:500，所述百分含量為質(zhì)量百分含量。3、炔諾酮單克隆抗體工作液炔諾酮單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCC2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3分泌產(chǎn)生的；炔諾酮單克隆抗體工作液是按照以下方法制備的用稀釋液將炔諾酮單克隆抗體稀釋3000倍，得到單抗工作液，所述稀釋液為含有2.5%(質(zhì)量百分含量)人血清白蛋白和0.004%(質(zhì)量百分含量)疊氮化鈉、pH值為7.2、1.Omol/L的磷酸鹽緩沖液。4、炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品(北京賽福菜博科技有限公司)溶液6瓶，濃度分別為0Pg/L，0.1Pg/L，0.3Pg/L，0.叫g(shù)/L，2.7Pg/L，8.lPg/L;配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為含有4%卵清蛋白、pH值為6.8、0.lmol/L磷酸鹽緩沖液。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，7ml/瓶，1瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺，7ml/瓶，1瓶。6、終止液2mol/L鹽酸。7、濃縮洗滌液含有1.0%吐溫-80、0.03%硫柳汞防腐劑，pH值為6.8、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；40ml/瓶，l瓶；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。8、濃縮復(fù)溶液含有4%卵清蛋白、pH值為6.8、0.lmol/L磷酸鹽緩沖液；50ral/瓶，1瓶。(二)制備1、包被有炔諾酮半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板的制備(1)炔諾酮半抗原的制備稱取10g炔諾酮和2.5g琥珀酸酐放入50ml圓底燒瓶中，向其中加無(wú)水吡啶至完全溶解，7(TC加熱攪拌反應(yīng)24h;反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾去溶劑，殘余物用丙酮洗滌5次，用乙酸乙酯-正己垸使其結(jié)晶，得到炔諾酮半抗原(圖2)。(2)包被原的制備將炔諾酮半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到包被原。包被原的制備過(guò)程取6mg步驟(1)得到的炔諾酮半抗原，用O.lmlDMF溶解，冷卻至1(TC，加2ml氯甲酸異丁酯，1(TC攪拌反應(yīng)30分鐘，得到溶液I;將30mg牛血清白蛋白用2ml50mmol/L的Na2C03溶液溶解，得到溶液II;將溶液I與溶液II混合，1(TC反應(yīng)4小時(shí)，然后4"過(guò)夜，用0.01mol/L磷酸緩沖液透析2天，得到炔諾酮包被原。(3)包被有包被原的酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將包被原稀釋成0.08-0.12Pg/ral，每孔加入IOOW，37"C溫育2h，再4"C過(guò)夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200W封閉液，37'C溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。包被緩沖液為pH值為6.4的0.lmol/L檸檬酸緩沖液。封閉液為含有8%馬血清、10%酪蛋白、0.2%明膠，pH值為7.1、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。2、炔諾酮單克隆抗體的制備(1)免疫原合成炔諾酮是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。免疫原的制備過(guò)程取6mg炔諾酮半抗原用0.lmlDMF溶解，冷卻至l(TC，加2ml氯甲酸異丁酯，1(TC攪拌反應(yīng)30分鐘，得到溶液I;將60tng人血清白蛋白用2ml50mmol/L的Na2C03溶液溶解，得到溶液II;將溶液I與溶液II混合，l(TC反應(yīng)4小時(shí)，然后4。C過(guò)夜，用0.01mol/L磷酸緩沖液透析2天。(2)制備單克隆抗體a.動(dòng)物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100Pg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。b.細(xì)胞融合和克隆化小鼠血清測(cè)定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按7:1(數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直到得到能穩(wěn)定分泌炔諾酮單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將該細(xì)胞株命名為對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3，該細(xì)胞株己于2008年06月04日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2546。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將炔諾酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3用凍存液制成1X109個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37t:水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化可以通過(guò)如下兩種方法制備單抗方法l:將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射炔諾酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X107個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，得到單克隆抗體，-20'C保存。方法2:增量培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞CGMCCNo.2546置于pH為7.4、0.2%碳酸氫鈉、1640+20%小牛血清培養(yǎng)基中，在37C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-2(TC保存。3、多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以炔諾酮抗原與人血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg體重，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫IO天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，用硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。4、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備過(guò)程羊抗鼠抗抗體購(gòu)自北京博奧森公司，貨號(hào)bse-0296G。羊抗兔抗抗體購(gòu)自北京博奧森公司，貨號(hào)bse-0295G。(2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備將抗抗體與辣根過(guò)氧化物酶(服P)采用改良后的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過(guò)碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4:1;由于辣根過(guò)氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，這樣活化的辣根過(guò)氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體。本發(fā)明利用改良的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行了抗體的酶標(biāo)，其省去了氨基的封閉過(guò)程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。降低了辣根過(guò)氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2:1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)便，對(duì)酶的活性的損失減少。四、樣品中炔諾酮的檢測(cè)本發(fā)明試劑盒可以用于檢測(cè)動(dòng)物組織(如豬肌肉、雞肝臟、魚(yú)、蟲(chóng)下)和飼料中的炔諾酮。1、樣品前處理(1)動(dòng)物組織樣品的前處理方法每2.0g動(dòng)物組織勻漿物中，加入7ral乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液，再加入0.5ml含有0.36M二水合亞硝基鐵氰化鈉和1M硫酸鋅的水溶液，用振蕩器振蕩10min，再以3000g以上的速度室溫離心10min，取上清液，于5(TC-6(TC氮?dú)饬飨麓蹈?，加入lml上述復(fù)溶液充分混勻，再進(jìn)行5倍稀釋，取樣進(jìn)行分析；(2)飼料樣品前處理方法每1.0g飼料樣品勻漿物中，加入10ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液，振蕩器振蕩5min，3000g以上，室溫離心5min，取上層清液0.5ml，加入0.5ml0.1M氫氧化鈉溶液，渦動(dòng)20s，加入5ml氯仿，振蕩5min，3000g以上，室溫離心5min，取下層清液lml至潔凈的容器中，于5(TC6(TC氮?dú)饬飨麓蹈?，取lml復(fù)溶液復(fù)溶干燥殘留物，把得到的樣本液與復(fù)溶液按l:4體積比進(jìn)行稀釋，渦動(dòng)混勻，取樣分析。2、用試劑盒檢測(cè)向包被有炔諾酮半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板微孔中加入炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50W，再加入炔諾酮單克隆抗體工作液50W，用蓋板模封板，37。C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250W洗滌液，30s后倒出孔內(nèi)液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100W，37。C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，重復(fù)洗板步驟，每孔加入底物顯色液A液過(guò)氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，37'C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液硫酸輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定在450皿處，測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。3、檢測(cè)結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100%，得到百分吸光度值。B百分吸光度值(％)=-^-xioo%公式中B為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B。為0Pg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值。以炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度(Pg/L)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖3)。用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出炔諾酮的殘留量。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需1.5小時(shí)可以完成。五、試劑盒靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度和保存期檢測(cè)(一)標(biāo)準(zhǔn)品精密度檢測(cè)從實(shí)施例1中步驟三中不同時(shí)間段制備的不同批次(01批、02批、03批)的試劑盒中各抽取10個(gè)試劑盒，從每個(gè)試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定0.9Pg/L炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值(OD值)，計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表l所示，表明，所有檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的變異系數(shù)在5.7%-12.7%之間，符合精密度小于或等于20%的規(guī)定.表l、標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)性試驗(yàn)(CV%)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(二)樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)1、樣品精密度檢測(cè)分別向不含炔諾酮的肌肉、肝臟、魚(yú)、蝦樣本中添加終濃度為4Pg/kg的炔諾酮，向不含炔諾酮的飼料中添加終濃度為10(Hig/kg的炔諾酮，再分別按照實(shí)施例l中所述方法進(jìn)行樣品前處理。從實(shí)施例l中步驟三中所述的不同時(shí)間段制備的三個(gè)批次的試劑盒(Ol批、03、06批)中各抽取3個(gè)試劑盒，進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果如表2-6所示(各表中的數(shù)值為5次重復(fù)的平均值)。結(jié)果表明肌肉、肝臟、魚(yú)、蝦、飼料樣本的變異系數(shù)均在5.9%-16.0%之間，符合了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)200517號(hào)附件2試劑盒備案參考評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)中第四點(diǎn)精密度標(biāo)準(zhǔn)。表2、肌肉樣本可重復(fù)性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3、肝臟樣本可重復(fù)性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4、魚(yú)樣本可重復(fù)性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表6、飼料樣本可重復(fù)性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、樣本準(zhǔn)確度試驗(yàn)向不含有炔諾酮的肌肉、肝臟、魚(yú)、蝦組織中分別添加炔諾酮，使炔諾酮的終濃度分別為5Pg/kg、10Pg/kg，向不含有炔諾酮的飼料組織中添加炔諾酮，使炔諾酮的終濃度分別為100Pg/kg、200Pg/kg，然后按照實(shí)施例1中所述的樣本前處理方法進(jìn)行處理；再用實(shí)施例1中步驟三中所述的試劑盒檢測(cè)組織或詞料中的炔諾酮，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度(準(zhǔn)確度=實(shí)測(cè)值/添加值)。結(jié)果如表7所示。結(jié)果表明肌肉樣本添加回收率在68.9%-94.7%之間，肝臟樣本的添加回收率在76.9%-98.6%之間，魚(yú)樣本添加回收率在80.6%-94.7%之間，蝦樣本添加回收率在68.7%-98.6%之間，飼料樣本的添加回收率在81.6%-105.9%之間。表7、試劑盒的準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(三)交叉反應(yīng)率試驗(yàn)選擇與炔諾酮有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的9種藥物測(cè)定交叉反應(yīng)率。通過(guò)各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計(jì)算步驟三中試劑盒對(duì)其它藥物的交叉反應(yīng)率。試劑盒對(duì)于炔諾酮交叉反應(yīng)率越大，則其對(duì)該藥物檢測(cè)的特異性就越好。重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。交叉反應(yīng)率(％)=(引起50%抑制炔諾酮的濃度/引起50%抑制的炔諾酮類似<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果如表8所示，表明，本發(fā)明試劑盒對(duì)炔諾酮和炔諾孕酮的特異性好，即本發(fā)明試劑盒可以檢測(cè)炔諾酮、炔諾孕酮。(四)試劑盒保存期試驗(yàn)試劑盒保存條件為2-8'C，經(jīng)過(guò)6個(gè)月的測(cè)定，步驟三中試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、炔諾酮添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運(yùn)輸和使用過(guò)程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37'C保存條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。因此，本發(fā)明試劑盒可以在2-8"C至少可以保存6個(gè)月以上。(五)試劑盒的最低檢測(cè)限取不含炔諾酮的陰性動(dòng)物組織樣本，用實(shí)施例1步驟三中所制試劑盒分別進(jìn)行20次檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為試劑盒的最低檢測(cè)限。表9、陰性豬肉樣本測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Pg/kg<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表9可知，本發(fā)明所研制的試劑盒最低檢測(cè)限為0.97Pg/kg。實(shí)施例2、用于檢測(cè)炔諾酮的試劑盒還可以有如下幾種一、包被原為特異性抗體，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)炔諾酮半抗原的試劑盒(一)本試劑盒的工作原理為當(dāng)在微孔條上預(yù)包被炔諾酮特異性抗體時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記炔諾酮半抗原溶液。樣本中的炔諾酮或炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)包被在酶標(biāo)板上的炔諾酮特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中炔諾酮的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中炔諾酮的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，通過(guò)與系列濃度的炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較粗略判斷樣本中炔諾酮的濃度范圍。(二)本試劑盒的組成為(1)包被有包被原的酶標(biāo)板包被原為炔諾酮單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCCNo.2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3分泌產(chǎn)生；包被原的濃度可以為O.08-0.12Pg/ml。(2)酶標(biāo)記物酶標(biāo)炔諾酮半抗原工作液；標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶。(3)炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品(北京賽福菜博科技有限公司)溶液6瓶，濃度分別為0^/L，0.lPg/L，0.3Pg/L，0.9Pg/L，2.7Pg/L，8.lPg/L;配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液。(4)底物顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過(guò)氧化氫，顯色液B液為鄰苯二胺。(5)終止液為l-2mol/L硫酸溶液。(6)濃縮洗滌液含有O.7%-1.4%吐溫-80、0.02-0.05%硫柳汞防腐劑、pH值為6.4-6.8、0.05-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；40ml/瓶，l瓶；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(7)濃縮復(fù)溶液含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；50ml/瓶，l瓶；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。二、包被原為炔諾酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物、酶標(biāo)記物為酶標(biāo)炔諾酮特異性抗體的試劑盒(一)工作原理當(dāng)在微孔條上預(yù)包被炔諾酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)炔諾酮特異性抗體溶液。樣本中的炔諾酮或炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)板上包被的炔諾酮半抗原競(jìng)爭(zhēng)炔諾酮特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中炔諾酮的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中炔諾酮的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，通過(guò)與系列濃度炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較粗略判斷樣本中炔諾酮的濃度范圍。(二)本試劑盒的組成(1)包被有包被原的酶標(biāo)板包被原為炔諾酮半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物。(2)酶標(biāo)記物酶標(biāo)特異性抗體工作液，標(biāo)記酶為堿性磷酸酶；特異性抗體是單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCCNo.2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3分泌產(chǎn)生。(3)炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品(北京賽福菜博科技有限公司)溶液6瓶，濃度分別為0^/L，0.1Pg/L，0.3Pg/L，0.9Pg/L，2.7Pg/L，8.lPg/L;配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液。(4)顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液(4-硝基酚磷酸鹽緩沖液)。(5)終止液為l2mol/L氫氧化鈉溶液。(6)濃縮洗滌液含有O.7%-1.4%吐溫-80、0.02-0.05%硫柳汞防腐劑、pH值為6.4-6.8、0.05-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；40ml/瓶，l瓶；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(7)濃縮復(fù)溶液含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；50ml/瓶，l瓶；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。三、包被原為抗抗體，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)炔諾酮半抗原(一)工作原理當(dāng)在微孔條上預(yù)包被抗抗體時(shí)，加入炔諾酮特異性抗體孵育后，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入酶標(biāo)炔諾酮半抗原溶液。樣本中的炔諾酮或炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)炔諾酮半抗原競(jìng)爭(zhēng)炔諾酮特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光度值與樣本中炔諾酮的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中炔諾酮的含量。同時(shí)也可根據(jù)酶標(biāo)板上的顏色深淺，通過(guò)與系列濃度炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較粗略判斷樣本中炔諾酮的濃度范圍。(二)試劑盒組成如下(1)包被有包被原的酶標(biāo)板包被原為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；包被原的濃度可以為0.08-0.12Pg/ml。(2)酶標(biāo)記物辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的炔諾酮半抗原；(3)特異性抗體工作液?jiǎn)慰寺】贵w由保藏號(hào)為CGMCCNo.2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3分泌產(chǎn)生。(4)炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品(北京賽福菜博科技有限公司)溶液:6瓶，濃度分別為0^/L，O.llVL，0.3Pg/L，0.9Pg/L，2.7Pg/L，8.Wg/L;配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.l-0.2raol/L磷酸鹽緩沖液。(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲或過(guò)氧化氫，7ml/瓶，l瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺，7ml/瓶，1瓶。(6)濃縮洗滌液含有O.7%-1.4%吐溫-80、0.02-0.05%硫柳汞防腐劑、pH值為6.4-6.8、0.05-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；40ml/瓶，l瓶；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(7)濃縮復(fù)溶液含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；50ml/瓶，l瓶；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。(8)終止液終止液為12mol/L硫酸或鹽酸溶液。權(quán)利要求1、一種檢測(cè)炔諾酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括炔諾酮半抗原和炔諾酮的特異性抗體；所述特異性抗體為所述炔諾酮的多克隆抗體或單克隆抗體；所述炔諾酮半抗原的結(jié)構(gòu)式如下2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述炔諾酮半抗原和炔諾酮的特異性抗體以下述任一種形式存在1)將所述炔諾酮半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到炔諾酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，將其作為包被原，所述特異性抗體進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物；2)所述特異性抗體為包被原，所述炔諾酮半抗原進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括抗抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；所述炔諾酮半抗原和抗抗體以下述任一種形式存在1)將所述炔諾酮半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到炔諾酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，將其作為包被原，所述抗抗體進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物；2)所述抗抗體為包被原，所述炔諾酮半抗原進(jìn)行酶標(biāo)記后作為酶標(biāo)記物。4、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的試劑盒，其特征在于所述單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCCNo.2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3分泌產(chǎn)生的抗體。5、根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液；所述濃縮洗滌液為含有O.7%-1.4%吐溫-80、0.02-0.05°/。硫柳汞防腐劑、pH值為6.4-6.8、0.05-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為含有3-5%卵清蛋白、pH值為6.5-7.2、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。6、根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記中所用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶；當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為l-2mol/L硫酸或鹽酸溶液；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，顯色劑為硝基磷酸鹽緩沖液，終止液為1-2mol/L氫氧化鈉溶液。7、根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為含有l(wèi).0%吐溫-80、0.03%硫柳汞防腐劑，pH值為6.8、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為含有4%卵清蛋白、pH值為6.8、0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液；所述底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，所述底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為2mol/L的鹽酸。8、根據(jù)權(quán)利要求l-7中任一所述的試劑盒，其特征在于所述抗抗體進(jìn)行酶標(biāo)記的方法是采用過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到酶標(biāo)抗抗體；所述過(guò)碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2:1。9、一種檢測(cè)炔諾酮的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當(dāng)所述樣品為動(dòng)物組織時(shí)，樣品前處理方法如下向每2.0g動(dòng)物組織勻漿物，加入6-9ml乙腈-O.05-0.15M氫氧化鈉溶液，再加入0.5-1.0ml含有0.3-0.4M二水合亞硝基鐵氰化鈉和0.9-1.2M硫酸鋅的溶液，混勻，再以3000g以上的速度室溫離心5-15min，取上清液，干燥，再用0.8-1.2ml權(quán)利要求5-7中任一所述濃縮復(fù)溶液充分混勻，再進(jìn)行3-5倍稀釋，取稀釋液進(jìn)行分析；當(dāng)所述樣品為飼料時(shí)，樣品前處理方法如下向每1.0g飼料樣品勻漿物中，加入8-llml乙腈-0.05-0.15M氫氧化鈉溶液，混勻，以3000g以上的速度室溫離心5-15min，取上層清液0.3-0.8ml，加入0.4-0.6ml0.05-0.15M氫氧化鈉溶液，混勻，加入4.5-5.5ral氯仿，混勻，再以3000g以上的速度室溫離心5-15min，取下層清液卜2ml，干燥，再用l-2ml權(quán)利要求5-7中任一所述濃縮復(fù)溶液充分混勻，再進(jìn)行3-5倍稀釋，取稀釋液進(jìn)行分析；2)利用權(quán)利要求1一8中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)1)中所述稀釋液。10、由保藏號(hào)為CGMCCNo.2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3分泌產(chǎn)生的炔諾酮的單克隆抗體，或保藏號(hào)為CGMCCNo.2546的對(duì)炔諾酮藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-2-3。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)炔諾酮的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)炔諾酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括炔諾酮半抗原和炔諾酮的特異性抗體；所述特異性抗體為所述炔諾酮的多克隆抗體或單克隆抗體。本試劑盒中采用高特異性的炔諾酮單克隆抗體，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本試劑盒具有特異性高、靈敏度高、精密度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)；本試劑盒的主要試劑都采用工作液形式，使用方便，成本低廉。文檔編號(hào)G01N33/535GK101358965SQ20081011844公開(kāi)日2009年2月4日申請(qǐng)日期2008年8月22日優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日發(fā)明者萬(wàn)宇平,何方洋,馮才偉,馮才茂,汪善良,沈建忠,羅曉琴,趙正苗,陳煒玲申請(qǐng)人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司