專利名稱：錳離子診斷/測定試劑盒及錳離子濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定錳離子濃 度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
錳作為一種微量元素在人體中是不可或缺的必需成分，同時也是對人體有毒 的物質(zhì)。在自然狀態(tài)下，以兩價、三價和四價的形式存在，氧化程度越低，毒 性越高。通常錳有八種不同的氧化狀態(tài)。錳的生物學(xué)意義是作為人體中輔助因
子有多種多樣的功能。然而，在許多酶激活反應(yīng)中，Mr產(chǎn)和Mg^可互相替代。 常用石墨爐原子吸收分光光度測定法、原子發(fā)射ICP-OES。中子激發(fā)分析 (NAA)是最好的方法，但僅能在一些條件好的實驗室才能測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定錳離子 濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的錳離子診斷/測定試劑盒, 采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行錳離 子濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明錳離子濃度測定方法原理如下
草酸+氧草酸氧化酶/Mn^二氧化碳+過氧化氫 還原型輔酶+核糖-5-磷酸+ 二氧化碳磷酸葡糖酸脫氫酶磷酸葡糖酸+輔酶
這種方法應(yīng)用需要錳離子激化活性的草酸氧化酶(oxalate oxidase; EC 1.2.3.4)酶(偶)聯(lián)磷酸葡糖酸脫氫酶(phosphogluconate dehydrogenase; EC 1丄1.44)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。草酸氧化酶的激活程度與錳離子濃度成正比。 錳離子激化活性下的草酸氧化酶酶解草酸反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳，再通過(偶)聯(lián) 合磷酸葡糖酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化 成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸 光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算錳離子的濃 度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明錳離子診斷/測定試劑較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L
磷酸葡糖酸脫氫酶 10000 U/L
草酸 15mmol/L 核糖-5-磷酸 9 mmol/L
本發(fā)明的錳離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫氫酶、草酸、 核糖-5-磷酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、核糖-5-磷酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫氫酶。 還原型輔酶、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫氫酶、草酸、核糖-5-磷酸在試劑1 或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、核糖-5-磷酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸葡糖酸脫氫酶。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶。
還原型輔酶、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫氫酶、草酸、核糖-5-磷酸在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定錳離子濃度的方法，其還原型輔酶 可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實施例一本實施例的錳離子診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
草酸氧化酶 10000 U/L
磷酸葡糖酸脫氫酶 10000 U/L
草酸 15 mmol/L
核糖-5-磷酸 9 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，
加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8
±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測錳離子樣品與試劑的體積
比例為1/25，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測
時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。 實施例二
本實施例的錳離子診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
草酸 15mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L
10000 U/L
10000U/L
核糖-5-磷酸 9 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 草酸氧化酶 磷酸葡糖酸脫氫酶 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度1.8 土0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測錳離子樣品與試劑1、試 劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約l分 鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。 實施例三
本實施例的錳離子診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
15 mmol/L 9 mmol/L
核糖-5-磷酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100 mmol/L穩(wěn)定劑
500 mmol/L
磷酸葡糖酸脫氫酶
10000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲院一鹽酸緩沖液
100mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
草酸氧化酶
10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定錳離子濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10 分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測錳 離子樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng) (下降反應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到 本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器 得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.02;吸光度時間 反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線下降；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)9 mmol/L; 試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重復(fù)性) 的變異系數(shù)(CV)《3%;試劑的靈敏度可達(dá)O.l ± 0.05 AA/min/U L;試劑 在2—8'C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形 范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子濃度測定方法，其方法原理如下草酸+氧草酸氧化酶/Mn2+二氧化碳+過氧化氫還原型輔酶+核糖-5-磷酸+二氧化碳磷酸葡糖酸脫氫酶 磷酸葡糖酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出錳離子的濃度大小結(jié)果。
2. —種錳離子診斷/測定試劑盒，主要成分包括.-緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 草酸氧化酶20-500 mmol/L1-4000 mmol/L0.1-0.35 mmol/L1000——80000 U/L核糖-5-磷酸1000——80000 U/L1- 50mmol/L1- 50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫氫酶、草酸、 核糖-5-磷酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫氫酶、草酸、 核糖-5-磷酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、 核糖-5-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫 氫酶組成。還原型輔酶、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫氫酶、草酸、核糖-5-磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫氫酶、草酸、核糖-5-磷酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酸、 核糖-5-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸葡糖酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶組成。還原型輔酶、草酸氧化酶、磷 酸葡糖酸脫氫酶、草酸、核糖-5-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可 以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 14000 mmol/L或0.1°/。-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用需要錳離子激化活性的草酸氧化酶的酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定錳離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、草酸、核糖-5-磷酸、草酸氧化酶、磷酸葡糖酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620078SQ20081012287
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司