專利名稱：一種量子點標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測倍他米松的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種量子點標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測倍他米松的方法，屬于免疫檢測 方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
倍他米松(Betamethasone, BET)屬人工合成類糖皮質(zhì)激素，化學(xué)名稱為16a 一甲基一ll卩，17a， 21—三羥基一9a—氟孕甾一1， 4—二烯一3， 20二酮。具有 抗過敏、抗炎和影響糖代謝的作用，常被用于治療家畜的炎癥反應(yīng)、免疫性疾 病、牛的酮病和羊妊娠毒血癥等。地賽米松還常被用作生長促進劑，增加家畜 的飼料攝入量從而使其達(dá)到增重的目的。然而，經(jīng)毒理學(xué)試驗證明，該藥物具 有致突變性、蓄積毒性，ADI值為0.000015mg/kgbw/day。若隨意在詞料中添加 該藥物，蓄積的藥物通過食物鏈進入人體，將造成巨大的危害。為此許多國家將 此類藥物列入禁用藥物名單。當(dāng)今國際上常用的倍他米松殘留的檢測方法有-薄層色譜(TLC)、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等，但這些儀器分析方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，對檢材 的要求也比較高，需要經(jīng)過復(fù)雜的樣品前處理才能進行。國外早已經(jīng)開展了對 糖皮質(zhì)激素分析方法的研究，常用的方法為酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)或稱為免 疫酶定量分析法(正MA)。這類方法是將包被原包被酶標(biāo)板，加入藥物及抗藥 物抗體，再加入酶標(biāo)二抗，即檢測抗體，最后加入底物顯色， 一定時間后，用 酶標(biāo)儀檢測某一特定波長的吸光度值，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品含量計算樣品中待測藥 物的濃度，此操作繁瑣，費時。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供量子點標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測倍他米松的方 法，該方法具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、操作簡單的量子點標(biāo)記的熒 光免疫檢測法，用于倍他米松殘留的快速檢測。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種量子點標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測倍他米松的 方法，將包被原直接包被在酶標(biāo)板的微孔中，加入倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣 品形成抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合體，用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體 發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強度，與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求出待測樣品中倍他米松的濃度;
(一)用變性牛血清蛋白dBSA包裹發(fā)綠光的QD5卯標(biāo)記抗倍他米松多克 隆抗體
(1) BSA變性將16.5mg BSA溶于lOmL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4,室溫下 反應(yīng)lh, 60-80。C下加熱20min分解過量的NaBH4， BSA變性，二硫鍵打開成-SH, 控制最終的dBSA水溶液的濃度為5 X 1(T5M;
(2) 變性BSA包裹量子點dBSA-QDs: 將dBSA和量子點鏑化鉻CdTe按摩爾比l : 1混合，60-80。C水浴加熱15min，
室溫下保持兩天，使包裹完全；
(3) 變性BSA包裹量子點偶聯(lián)抗體
將5^11>1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC 0.056M與5pL硫代N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS O.IM混合10s后，加入至25pL dBSA-QDs 2X 1()-5M 中，變性BSA包裹的量子點活化15min，加入7.6pL倍他米松抗體Ab， 6.3mg/mL， 反應(yīng)物摩爾比控制為dBSA-QDs: Ab: EDC: sulfo-NHS=l:l:560:1000，室溫下反 應(yīng)4h，得到量子點標(biāo)記的倍他米松抗體，室溫下反應(yīng)4h，得到量子點標(biāo)記的倍 他米松抗體，反應(yīng)液中抗體的濃度為1.15mg/mL，用0.1。/。明膠的含吐溫的pH 7.4、 0.01M磷酸鹽緩沖液作抗體稀釋液稀釋1000倍待用；
(二) 抗原的包被
用倍他米松與卵血清白蛋白偶連體作為包被原，用pH9.6、 0.05M碳酸鹽緩 沖液作為包被緩沖液，用包被緩沖液將倍他米松包被原稀釋至l-20pg/mL作為 包被液，在酶標(biāo)板的每孔中加100(iL包被液，4'C冰箱過夜，用含NaC18.5g/L、 pH 7.2-7.4、 1Ommol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，按200&/孔加0.1%明膠進行封閉；
(三) 抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合體的形成 在封閉后的酶標(biāo)板孔中加入倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品50|aL ，稀釋的量
子點標(biāo)記的倍他米松抗體50^iL，37'C孵育lh，抗原與倍他米松藥物競爭抗體， 部分抗體與抗原形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物，用含NaC18.5g/L、 pH 7.2-7.4、 1Ommol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，去掉非特異性吸附；
(四) 定量熒光檢測 用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強度，
激發(fā)波長430nm;發(fā)射波長590nm，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求出待測樣品中倍 他米松的濃度。
所說的抗體是指用變性BSA包裹量子點標(biāo)記的抗倍他米松的多克隆抗體； 量子點是指能夠發(fā)射熒光的納米粒子，其核心部分為CdTe。
所說的包被是利用常規(guī)的方法將倍他米松的包被原(倍他米松-OVA偶聯(lián)物) 直接固定在酶標(biāo)板微孔中。
所說的抗原-抗體復(fù)合體的形成是加入倍他米松抗體后，抗原與藥物競爭 抗體，通過抗原與抗體的特異性結(jié)合形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物。
所說的熒光強度的檢測是用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-檢測抗體二層夾心發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強度，通常樣品中藥物濃度越大，被抗體捕獲 的藥物量越多，與包被原結(jié)合的抗體越少，則測得的熒光強度值越小。
上述的待測藥物為倍他米松(BET)，相應(yīng)的抗體應(yīng)為特異性抗倍他米松的 多克隆抗體。
本發(fā)明的有益效果
(1) 本法操作簡單，不需加顯色物質(zhì)就能檢測待測樣品中倍他米松的含量， 即通過抗原-抗體免疫復(fù)合物的熒光強度，間接檢測待測樣品中倍他米松的濃度 值，無論操作還是反應(yīng)均只需一步就可完成。
(2) 本法用于標(biāo)記抗體的量子點與傳統(tǒng)熒光相比，發(fā)射的熒光強度更強，
且熒光穩(wěn)定時間長。


圖l用量子點標(biāo)記的間接競爭熒光免疫法檢測倍他米松的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施方式
實施例1
(一) 用變性牛血清蛋白(dBSA)包裹發(fā)綠光的QD590標(biāo)記抗倍他米松多 克隆抗體
(1) BSA變性
將16.5mg BSA溶于lOmL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4,室溫下 反應(yīng)lh, 60-80。C下加熱20min分解過量的NaBH4， BSA變性，二硫鍵打開成-SH, 最終的dBSA水溶液的濃度為5 X 10—5M。
(2) 變性BSA包裹量子點(dBSA-QDs): 將dBSA和量子點鏑化鉻(CdTe)按一定的摩爾比(1:1)混合，60-80°C
水浴加熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全。
(3) 變性BSA包裹量子點偶聯(lián)抗體
將5pL l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC(0.056M)與5pL硫代 N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS(0.1M)混合10s后，加入至25|iL dBSA-QDs (2X 1(T5M)中，變性BSA包裹的量子點活化15min，加入7.6fjL倍他米松抗體(Ab， 6.3mg/mL)。反應(yīng)物摩爾比為dBSA-QDs: Ab: EDC: sulfo-NHS=l:l:560:1000。 室溫下反應(yīng)4h，得到量子點標(biāo)記的倍他米松抗體。溫下反應(yīng)4h，得到量子點標(biāo) 記的地塞米松抗體。反應(yīng)液中抗體的濃度為1.15mg/mL，用抗體稀釋液(0.1% 明膠的含吐溫的磷酸鹽緩沖液pH7.4， 0.01M)稀釋1000倍待用。
(二) 抗原的包被
用倍他米松與卵血清白蛋白偶連體作為包被原，用碳酸鹽緩沖液(pH9.6， 0.05M)作為包被緩沖液，用包被緩沖液將倍他米松包被原稀釋至l-20pg/mL作 為包被液，在酶標(biāo)板的每孔中加10(HiL包被液,4'C冰箱過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS，10mmol/L、 pH 7.2-7.4、含NaC18.5g/L)洗三次，按200pL/孔加0.1%明
膠進行封閉。
(三) 抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合體的形成 在封閉后的酶標(biāo)板孔中加入倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品50pL，稀釋的量
子點標(biāo)記的倍他米松抗體50pL， 37"C孵育lh，抗原與倍他米松藥物競爭抗體， 部分抗體與抗原形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物，用磷酸鹽緩沖液(PBS， 10mmol/L、 pH 7.2-7.4、含NaC18.5g/L)洗三次，去掉非特異性吸附。
(四) 定量熒光檢測 量子點標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測法的測定原理是通過檢測結(jié)合到酶標(biāo)
板微孔上的抗原-抗體二元免疫復(fù)合物的熒光強度來實現(xiàn)對倍他米松的檢測。可 與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比求出樣品中倍他米松的濃度。結(jié)合到酶標(biāo)板微孔上的量子點標(biāo) 記的檢測抗體數(shù)量不同，產(chǎn)生的熒光強度不同，通常樣品中藥物濃度越大，被 抗體捕獲的藥物量越多，與包被原結(jié)合的抗體越少，則測得的熒光強度值越小。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，將已知倍他米松含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液配置成由低到高8種不同濃 度(0.1ng/mL， 0.5ng/mL， 1 ng/mL， 5 ng/mL， 10ng/mL， 25 ng/mL， 50ng/mL， 100ng/mL)，用與待測樣本相同的方法，重復(fù)(二)(三)步驟的操作，測定某 種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的熒光強度(激發(fā)波長430nm;發(fā)射波長590nm)，以 倍他米松濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖l。 實施例2添加回收實驗
(1) 樣品的提取凈化在2g雞肉靡樣本中加入10mL乙膨水(7:3)的混 合溶液，渦旋混合lmin，超聲波超聲30min， 2000X g離心10min，吸取2.5mL 上層液于干凈的玻璃管中，加入4mL正己垸和lmL 二氯甲烷脫脂，渦旋混合 lmin使三相分離，吸取lmL中間相(對應(yīng)于0.2g樣品)于干凈的試管中；50°C， 緩慢的N2流吹干，用0.2mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(含10%甲醇的含吐溫-20的磷酸鹽 緩沖液PBST)溶解殘留物，作為試樣供分析。
(2) 在2g空白的雞肉樣本中添加倍他米松標(biāo)準(zhǔn)品液，使其濃度為lng/g 、 5ng/g、 10ng/g、 20 ng/g，各濃度分別制備樣品五份，按上述的前處理方法進行 提取后分析。結(jié)果見表l?？梢钥闯?，雞肉樣品中的回收率在64.4% 79.5%之間。 該分析方法重復(fù)性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于7.14 %。
表1添加回收率的測定
0.69 0.60 0.66 0.630.64 64.4±7.14
3.56 3.42 3.75 3.61
3.46 71.2±5,34
7.517.127.557.637.31 74.2±4.09
16.15 15.69 15.42 15.81 16.43 79.5±3.3權(quán)利要求
1.一種量子點標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測倍他米松的方法，其特征在于將包被原直接包被在酶標(biāo)板的微孔中，加入倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品形成抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合體，用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強度，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求出待測樣品中倍他米松的濃度；(一)用變性牛血清蛋白dBSA包裹發(fā)綠光的QD590標(biāo)記抗倍他米松多克隆抗體(1)BSA變性將16.5mg BSA溶于10mL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4，室溫下反應(yīng)1h，60-80℃下加熱20min分解過量的NaBH4，BSA變性，二硫鍵打開成-SH，控制最終的dBSA水溶液的濃度為5×10-5M；(2)變性BSA包裹量子點dBSA-QDs將dBSA和量子點鏑化鉻CdTe按摩爾比1∶1混合，60-80℃水浴加熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全；(3)變性BSA包裹量子點偶聯(lián)抗體將5μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC 0.056M與5μL硫代N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS 0.1M混合10s后，加入至25μL dBSA-QDs 2×10-5M中，變性BSA包裹的量子點活化15min，加入7.6μL倍他米松抗體Ab，6.3mg/mL，反應(yīng)物摩爾比控制為dBSA-QDs∶Ab∶EDC∶sulfo-NHS＝1∶1∶560∶1000，室溫下反應(yīng)4h，得到量子點標(biāo)記的倍他米松抗體，室溫下反應(yīng)4h，得到量子點標(biāo)記的倍他米松抗體，反應(yīng)液中抗體的濃度為1.15mg/mL，用0.1％明膠的含吐溫的pH 7.4、0.01M磷酸鹽緩沖液作抗體稀釋液稀釋1000倍待用；(二)抗原的包被用倍他米松與卵血清白蛋白偶連體作為包被原，用pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，用包被緩沖液將倍他米松包被原稀釋至1-20μg/mL作為包被液，在酶標(biāo)板的每孔中加100μL包被液，4℃冰箱過夜，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，按200μL/孔加0.1％明膠進行封閉；(三)抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合體的形成在封閉后的酶標(biāo)板孔中加入倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品50μL，稀釋的量子點標(biāo)記的倍他米松抗體50μL，37℃孵育1h，抗原與倍他米松藥物競爭抗體，部分抗體與抗原形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，去掉非特異性吸附；(四)定量熒光檢測用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強度，激發(fā)波長430nm；發(fā)射波長590nm，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求出待測樣品中倍他米松的濃度。
全文摘要
一種量子點標(biāo)記的間接競爭熒光免疫檢測倍他米松的方法，屬于免疫檢測方法技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用于標(biāo)記抗體的量子點為QD590，將包被原直接包被在酶標(biāo)板的微孔中，加入倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品形成抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合體，用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強度，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液對比求出待測樣品中倍他米松的濃度。本發(fā)明不需加顯色物質(zhì)就能檢測待測樣品中倍他米松的含量，即通過抗原-抗體免疫復(fù)合物的熒光強度，間接檢測待測樣品中倍他米松的濃度值，無論操作還是反應(yīng)均只需一步就可完成；本方法用于標(biāo)記抗體的量子點與傳統(tǒng)熒光相比，發(fā)射的熒光強度更強，且熒光穩(wěn)定時間長。
文檔編號G01N33/543GK101308146SQ20081012352
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者彭池方, 胥傳來, 媛 袁, 謝會玲, 郝曉蕾, 偉 陳 申請人:江南大學(xué)