專利名稱：無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機磷(磷酸根)濃度測定方法
無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機磷(磷酸根)濃度
測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及瀾定 無機碟(磷酸根)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態(tài)平衡，血 中鈣、磷濃度之間有一定關(guān)系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿中[鈣]磷3濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿鈣磷濃度的乘積為35—— 40。當(dāng)二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，>70時，可發(fā)生轉(zhuǎn) 移性鈣化。當(dāng)乘積<35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，彩響成 骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D,甲狀旁 腺激素及降辨素的調(diào)節(jié)。
由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分析稱酸鹽陰 離子(H2P04"， HP042')。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結(jié)合法， 酶法，同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法等。決定性方 法是同位素稀釋質(zhì)譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機磷的常規(guī)方法是比色 法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學(xué)濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離子 型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩(wěn)定的 還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇 基苯基醚(TritonX-100)最理想。
4磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合物， 方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做標 本空白，否則結(jié)果偏高。
酶法測定無機磷是發(fā)展趨勢，其優(yōu)點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下的中性范 圍內(nèi)是穩(wěn)定的，可用于常規(guī)樣品的自動化分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原 型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機磷(磷酸根)濃度的方法， 同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，采 用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行無機磷(磷 酸根)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明無機磷(磷酸根)濃度測定方法原理如下
磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水 腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶/&+腺苷三磷酸+
丙酮酸
丙酮酸+還原型輔酶乳酸脫氫酶乳酸+輔酶 這種方法應(yīng)用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4丄1.31)酶(偶)聯(lián)丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase; EC 2.7丄40)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase; EC 1丄1.27; EC 1丄1.28; EC 1丄2.3)酶促反應(yīng)比色法。磷酸烯 醇式丙酮酸羧化酶酶解無機磷(磷酸根)反應(yīng)產(chǎn)生磷酸烯醇式丙酮酸，再通過(偶) 聯(lián)合丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰) 氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算無機磷(磷 酸根)的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是 單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒
較為理想
緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
丙酮酸激酶
乳酸脫氫酶
草酰乙酸
腺苷二磷酸
氯化鉀
10Ommol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L 12 mmol/L 9 mmol/L 3 mmol/L
本發(fā)明的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、 乳酸脫氫酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化鉀。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化鉀。 試劑2
沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶。還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶、草酰乙酸、 腺苷二磷酸、氯化鉀在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化鉀。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶、草酰乙酸、
腺苷二磷酸、氯化鉀在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是 干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定無機磷(磷酸根)濃度的方法，其還 原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH巾的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例j
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50Ommol/L 還原型輔酶 0.25 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
丙酮酸激酶 8000 U/L乳酸脫氫酶 草酰乙酸 腺苷二磷酸 氯化鉀
10000U/L 12 mmol/L 9 mmol/L 3 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加 入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右， 檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。 實施例二
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 草酰乙酸 腺苷二磷酸
氯化鉀 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 12 mmol/L 9 mmol/L 3 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
丙酮酸激酶
乳酸脫氫酶
6000 U/L 8000 U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8
±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與試
劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大
約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，
檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
實施例三
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
還原型輔酶 草酰乙酸 腺苷二磷酸 氯化鉀
試劑2
三(羧甲基) 穩(wěn)定劑 丙酮酸激酶 乳酸脫氫酶
10Ommol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 12 mmol/L 9 mmol/L 3 mmol/L
:基甲垸一鹽酸緩沖液
100 mmol/L 500 mmol/L 8000U/L 10000 U/L試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定無機磷(磷酸根)濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng) 時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測無機磷(磷酸根)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本 發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得 出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001;吸光度時間反 應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(RX).99)線形范圍可達16mmol/L; 試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的 變異系數(shù)(CV) 《3%;試劑的靈敏度可達0.011 ± 0.006 AA/mmol/L;試劑在 2—8"C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍 寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機磷(磷酸根)濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶/K+ 腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+還原型輔酶 乳酸脫氫酶 乳酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶丙酮酸激酶乳酸脫氫酶草酰乙酸腺苷二磷酸氯化鉀 試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外， 試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、乳 酸脫氫酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化鉀組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、乳 酸脫氫酶、草酰乙酸、腺苷一磷酸、氯化鉀組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化鉀組成；試劑2，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶組成。還原 型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶、草酰乙酸、腺 苷二磷酸、氯化鉀在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、乳 酸脫氫酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化鉀組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化鉀組成；試劑2，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷 酸烯醇式丙酮酸羧化酶組成。還原型輔酶、磷酸烯醇式內(nèi)酮酸羧化酶、丙酮酸 激酶、乳酸脫氫酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化鉀在試劑l、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia )、廿油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定無機磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸、氯化鉀、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620150SQ200810124220
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司