專(zhuān)利名稱(chēng)：與腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用的制作方法
與腫,移細(xì)胞特異性結(jié)合的多皿其JOT駄領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物工程與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及禾,噬菌體展示技術(shù)篩選能與腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞 表面抗原特異性結(jié)合的多肽，具體地說(shuō)，^Zffl原創(chuàng)中瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)M^差異鵬隨機(jī)12肽噬 菌體際文庫(kù)，得到可以用作腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的特異12月游列。 背景駄腫瘤細(xì)l^人原有部位侵入淋巴管、血管或體腔，遷徙到它處而繼續(xù)生長(zhǎng)，形成與原發(fā)瘤同樣 類(lèi)型的腫瘤，稱(chēng)為轉(zhuǎn)移[楊光華等《病理學(xué)》(第適)，人民衛(wèi)生出版社，2001年，P87)。從肝7jC平發(fā)測(cè)中瘤細(xì)臓面各種肝的非正常駄，對(duì)于鑒另鵬瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展有重要意 義，VEGFR (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體)在很多惡性癌細(xì)胞，如惡14fF癌細(xì)胞和頭頸部扁平上皮癌 細(xì)胞的表面高表達(dá)(鄧靖宇，何生，等.VEGF在肝癌中的作用，世界華人消化雜志，2004， 12(2) :454-458);內(nèi)源血凝集素在對(duì)肺部有高轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤細(xì)胞表面含量較高[Raz ^ Meromsky L， Lotan R，等.內(nèi)源;驢素在正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞表面的差異就， Cancer Researcia986年7月，46 (7) :3667-3672]。,細(xì)胞表面W有可能作為腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的標(biāo)志物，在腫瘤診斷、判 后、轉(zhuǎn)歸和iWr療效以及高危人群隨訪觀察等方面，具W^的實(shí)用價(jià)值c現(xiàn)有,體展示技術(shù)通常，純化了的蛋白進(jìn)filf選，得到與該蛋白特異結(jié)合的寡肽或抗體。
礎(chǔ)上我們運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)對(duì)細(xì)胞表面!)!^進(jìn)行 ， fflil^種方法可以得到對(duì)細(xì)胞表 面特異結(jié)合的寡肽好。我們的方案克服了以往細(xì)胞篩選中的一些問(wèn)題，主要是細(xì)胞表面成分復(fù) 雜而戰(zhàn)知，細(xì)胞篩選糊辨異性默，背景值高，而且轉(zhuǎn)移與一瞎移腫瘤細(xì)胞間細(xì)胞表面差異 小。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)，的，不足，,一種與腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽 及其鵬c因?yàn)橼吋?xì)胞的表面有大量的糖類(lèi)、蛋白靴原成分與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，所以它們是潛在糊中 瘤標(biāo)志物。本發(fā)明應(yīng)用原創(chuàng)中瘤細(xì)胞和腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)鵬，鵬菌體文庫(kù)進(jìn)行差異離從而獲得 能與腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)l^系特異性結(jié)合的12肽。本發(fā)明自SW480 (原創(chuàng)中瘤細(xì)皿)和SW620 (腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)皿)差異 噬菌體月婢， 獲得選擇性鵬合腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞的12肽，其錢(qián),列如下 Leu-PrO"Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-PrO"Pro 。在f機(jī)移細(xì)鵬MCF7 (ATCC臓號(hào)HTB—22)和T47D (ATCC臓號(hào)HTB—133)， 以及高轉(zhuǎn)移細(xì)M MD—MB—231 (ATCC皿號(hào)HTB—26)和MD—MB—435 (ATCC保藏號(hào) HTB—129)等4個(gè)細(xì)胞系中，證實(shí)了上述12肽與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。本發(fā)明的有 ^是本發(fā)明提供的12肽可以用作腫瘤轉(zhuǎn)移診斷的標(biāo)志物，并可作為開(kāi)發(fā) 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的前體。


圖1.是噬菌體展示中各輪對(duì)SW620細(xì)胞牛寺異性結(jié)合噬菌體的回收率，圖2.體過(guò)四輪篩選得至啲,體以及原始庫(kù)噬菌粘SW620和SW480細(xì)胞結(jié)合能力的比較，圖3.是105個(gè)噬菌,克隆均與SW480和SW620細(xì)胞以及空白孔作ELISA檢測(cè)，圖4.是測(cè)序后得到的表達(dá)四種多肽的噬菌體對(duì)SW480、 SW620、 MCF7、 T47D、 MD—MB—231和MD一MB—435的結(jié)合能力，圖5.歡U痕i微檢測(cè)12 M腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞SW620運(yùn)動(dòng)能力的影響。實(shí)施例l: ^1四,選獲得能與SW620細(xì)胞表面選擇性結(jié)合的重組HW體 第一輪將RPMI1640培養(yǎng)S^末(Gibico公司)10.4g，碳MiL鈉2.0g溶于800ml雙蒸水中， 力口入10ml lmol/LHEPES溶液，再用雙蒸7jC將總柳定容到1000ml， 0.22(jm濾鵬濾除菌后4°C 保存；^hM培養(yǎng)基中力口入胎牛血清(FBS，購(gòu)自天津血液病研頓)和青霉素- 素 :，使 其含量分別超U 10°/通1%, 4'C保存;將戰(zhàn)@#基2ml加入到6孑L板的每一個(gè)孔中，接入SW620細(xì)胞(ATCC 號(hào)CCL-228),使細(xì)胞密度為106個(gè)/孔，在化碳細(xì)胞培^中培養(yǎng)約48 小時(shí)；棄去培養(yǎng)基，細(xì)鵬lxPBS洗滌(10xPBS:氯化鈉肌0g，氯化鉀2,0g，磷體二鈉14.4g， 磷酸二氫鈉2.48，溶于800ml去離子水中，調(diào)pH輕7.4，再用去離子水定容至1升。lxPBS: 將戰(zhàn)10xPBS用去離子水糖10倍，{頓 121 。C下高壓滅菌20併中)；加5ml封閉液(含 10mg/ml BSA的PBS)室翻睜育1小時(shí)；與此同時(shí)，將1X1011原始文庫(kù)噬菌體(隨機(jī)12肽M13 噬菌體展示文庫(kù)試劑盒，購(gòu)自New England Biolabs公司)加入到2ml封閉液中，4'C封閉1小時(shí)； 棄去i^lffl胞孔中的封閉液，將封閉好的麟#^液加入到孔中，室翻睜育2小時(shí)；棄去孔中噬 菌鵬液，力口入PBST(含0.1% Tween的PBS )洗10次，PBS洗兩次，然后加入lml M液(O. 2mol/L Glycine-Cl，pH 2.2)，洗脫10併中；取出上清，立即加入150^1中和液(lmol/LTris-Cl,pH9. 0); 取5(^1 tt噬菌體，用瓊脂4M法測(cè)定滴度(具#^"法見(jiàn)本實(shí)施例的后部)；同時(shí)將噬菌體加入 培養(yǎng)到對(duì)數(shù)中期的規(guī)桿菌ER2738中[F， lacf1 A(lacZ)M15 pioA+B+ zzf::Tn10 (Tef)/fhuA2 supE thi A(lac-proAB) A(hsdMS-mcrB)5 (rk"imTMcrBC)菌株保存在含50%甘油的LB培養(yǎng)基中，存于一70 。C]， 250轉(zhuǎn)/射中，37。C培養(yǎng)擴(kuò)增4. 5小時(shí)；擴(kuò)增產(chǎn)物10000轉(zhuǎn)/射中離心10射中；將80%的上 清吸到新的離心管中，加入1/6上清體積的PEG溶液，4'C沉淀過(guò)夜；10000轉(zhuǎn)/射中離心15粥中， 棄上清；用20(^1 PBS重懸沉淀，10000轉(zhuǎn)/辦中離心5胸(除去剩鄉(xiāng)菌沉淀)，上清轉(zhuǎn)移到 新的0，5mL離心管中，這就是擴(kuò)增了的噬菌體。用瓊脂4M法測(cè)定噬菌,度。第二輪分別將SW480 (ATCC臓號(hào)CCL-228)和SW620細(xì)胞以106細(xì)^/孑匕鋪到6孑L板 中，培養(yǎng)2天；按照第一輪的方法加入第一輪擴(kuò)增的噬菌體(滴度約為1X1010)，與SW480細(xì)胞 結(jié)合，室 育1小時(shí)；取出孔中噬菌鵬液，加入到另一個(gè)SW480孔中，室翻睜育l小時(shí)；取 出第二個(gè)SW480細(xì)胞i歸孔中的,條液，加入到SW620孔中，室翻桴育2小時(shí)； ，擴(kuò)增 等步驟與第一輪完全相同；用同樣方法進(jìn)行第三輪和第四輪篩選，每一輪篩i^f用的噬菌體數(shù)量 約為1X1010。瓊脂觀法測(cè)定滴度的具體織接種 桿菌ER2738單 到5ml含有鹽酸四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至ODeoo約為0.5; 取一只^W3ml上層固體LB培養(yǎng)基(含有0.7%瓊月謝的13培養(yǎng)基)的體，置于沸7K浴中加熱至完全融化，再置于45。C水浴中保溫；取10^1待測(cè)噬菌鵬液，在lxPBS中進(jìn)行10倍系列稀 釋?zhuān)链蠹s10^1,鵬液中含有100個(gè),體；取200W^M桿菌ER2738培鎌，在i歸液 中力口入10Ml糖好的噬菌鵬液，輕輕振蕩混勻后^^溫下靜置5辦中；將加有噬菌體的鄉(xiāng)桿 菌培^J口入至'J戰(zhàn)45i:保溫的3ml固體LB培養(yǎng)基中，混勻后倒在37。C預(yù)保溫的IPTG/X-gal 平社，待戰(zhàn)固體LB培養(yǎng)基完全凝固后，將平板倒置于37'C培鎌中培糊夜。第二天檢查平板，對(duì)平肚的藍(lán)色噬0^琎^i十?dāng)?shù)，再相iSZi頓以稀釋度，就得到原噬菌體 溶液中每10pl戶(hù)膽的噬菌體pfU (噬斑形fiP^位)M。結(jié)果進(jìn)行4輪富集篩選，每輪對(duì)從SW620細(xì)臓面M^下來(lái)的,體量與加入B鶴體的量 的比值逐漸升高，實(shí)現(xiàn)了特異性的富集(見(jiàn)表l)。表l中四輪的Mft/加入量用圖l表示。 圖l中回收率= 的噬菌體*/加入的曖菌體量，Y軸的單位是X10"6。表l fimSW620特異性結(jié)合的噬菌體輪數(shù)(pfil)加入噬菌體量 (pfii)回收率(X10力第一輪1.1X1051.1X10111第J3.2X1041. 1X10103第三輪6.0X1051. 1X101055第四輪8.9X1051. 1X101080實(shí)施例2:噬菌體對(duì)SW480和SW620結(jié)合能力的測(cè)定SW480和SW620分別以106細(xì)醇孔鋪到6孑L板中，在二氧化碳細(xì)胞培鎌中37。C培養(yǎng)約48 小時(shí)(培養(yǎng)基用RPMI1640， 10%FBS， 1%青霉素-鏈霉素艦)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌，加A^寸 閉液(含10mg/mlBSA的PBS)室翻浮育l小時(shí)；同時(shí)，將IX 1()UpfU第四輪擴(kuò)增得到麟體加 入到2ml封閉液中，4'C封閉1小時(shí);，棄去細(xì)胞培養(yǎng) L中封閉液，向SW480和SW620孔中各加 入2ml封閉好的噬菌體(滴度約為1X1011 )，室翻瞎育2小時(shí)；棄去,體，PBST (含0.1% Tween 的PBS)洗滌10次，再用PBS洗滌兩次，艦，觀i淀各自的滴度；原始文庫(kù)噬菌體作對(duì)照，也 同時(shí)進(jìn)行Jd^^。第四輪得到的噬菌體混合庫(kù)與SW620結(jié)合能力較原始Hm體庫(kù)提高了 IOO倍， 第四輪得到的噬菌體混合庫(kù)與SW620結(jié)合能力是其與SW480結(jié)合的100倍，即第四輪得到的噬結(jié)合，見(jiàn)圖2。圖2中。表示從SW480細(xì)|&± 下來(lái)的噬菌體數(shù)； □表示從SW620細(xì)Hi:W^下來(lái)的噬菌體數(shù)； l:^^對(duì)照，翻原始文庫(kù)噬菌體分別加入SW620和SW480中； 2:表示用第四輪擴(kuò)增的噬菌體分別加入SW620和SW480中。實(shí)施例3:單克隆的噬菌體的分離制備隨lnj陬105個(gè)篩選4輪后的單克隆噬菌體，加AP樹(shù)數(shù)中期的鄉(xiāng)桿菌ER2738中，37°C， 搖床(250轉(zhuǎn)/併中)培養(yǎng)4. 5 5小時(shí)；擴(kuò)增,10000轉(zhuǎn)/溯離心10溯，^Jl清加入1/6 ^!R的PEG/NaCl溶液，4'C沉^3l夜；10000轉(zhuǎn)/倂中離心15倂中，棄上清；用200^1 PBS重懸 沉淀，10000轉(zhuǎn)/併中離心5射中，除去剩余細(xì)菌沉淀；用瓊脂ftM法測(cè)^i:清液中的M,度， 加入等mR甘油，保存于一20°C。用105 ，菌,克隆對(duì)，細(xì)胞SW480或SW620進(jìn)行ELISA檢測(cè)。在96孑L板中分別力口 入105SW480或SW620細(xì)lfi/ L，培養(yǎng)兩天后每孔中加入200pl封閉液[5X(w/v)BSA溶于PBS]， 封閉l小時(shí)；加入單克隆噬菌體1><101()，敏L50pl，孵育2小時(shí)；PBST洗滌5次，用HRP-抗 M13抗體(Phannacia Biotech公司)檢測(cè)結(jié)合的噬菌體顆粒，四錢(qián)聯(lián)苯胺(TMB)為底物，顯 色約5辦中，力口入100^1 H2S04中止反應(yīng)。測(cè)定450nm的光吸收值。幾乎所有噬菌脾克隆均表 現(xiàn)出對(duì)SW620細(xì)胞的高結(jié)合性，同時(shí)對(duì)SW480細(xì)胞的結(jié)合性較低，見(jiàn)圖3。圖3中橫坐標(biāo)標(biāo)不同的麟脾克隆，m^標(biāo)表示平均凈吸光值；□標(biāo)SW620孔的平均凈吸光值；■ ^SW480孔的平均凈吸光值。圖3中^h噬菌,克隆均與SW480和SW620細(xì)胞以及空白孑L結(jié)合。洗滌后，用辣M:氧 化物臓M13抗體及其底物1MB對(duì)針孑US行ELISA反應(yīng)，并檢測(cè)J OD450。 SW620或SW480 所在孔的OD45o值減去對(duì)應(yīng)的空白孔OD45o值，得到其艦光值。對(duì)針克Ha行了兩組檢測(cè)， 圖上 為兩組檢測(cè)的平均值。實(shí)施例4:噬菌體基因組單鏈DNA的提取和12月，列的獲得PEG沉淀的,^m舒200|il碘化鈉緩沖液(10mmol/LTris-HCl， pH8.0， 1 mmol/LEDTA， 4mol/LNal，室溫避光jC存)中，力口入500W ^zK乙醇，室翻睜育10辦中，10000轉(zhuǎn)/倂中離心10 射中，棄上清，用70%乙,沉淀，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，重懸沉淀于30 l去 離子水中。以_96 gIII引物(5，"CCCTCATAGTrAGCGTAACO"3，， New England Biolabs隨機(jī) 十二肽,體展示文庫(kù)產(chǎn)品)觀!l序。測(cè)序結(jié)果用Prime Primier斷特!譯，得至哆鵬列。有4 種不同測(cè)序結(jié)果，所以對(duì)應(yīng)4種不同的12月訴列。它們是-Leu-Pro-Trp"Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro (1)Ser-Pra-Trp"Ser-Glu-Pro-Ala-Tyr-Tyr-Leu-Ala-Pro (2 )Val-Pro-Tn>Met-Glu-PrO"Ala-Tyr-Gln-Aig-Phe-Leu(3)Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Aig-Pro (4)實(shí)施例5:對(duì)12tt34行多重tmiSS^:b ^^aBlalW猴施例4f泰l酌4個(gè)12ttmffi,瀏，發(fā)現(xiàn)12月游列(1) (2) (3) 的相似性很高，它們的高度保守的序列是Pro-TrpOd-Glu-Pro-X2-Tyr,其中&和X2 ^f樣ftf可氨 基酸，該保守序列對(duì)維持12肽的結(jié)構(gòu)和功S誕關(guān)鍵作用。實(shí)施例6:對(duì)^S細(xì)lfiiS行ELISA測(cè)定在96孑L板中分別加入l()5sW480或SW620細(xì)IS/孔，培養(yǎng)兩天；5X104MCF7， T47D， MD— MB—231或MD—MB—435細(xì)lfi/孔，培f天。每孔中加入200^1封閉液[5% (w/v)BSA溶于PBS], 封閉1小時(shí)。加入單個(gè)克隆的噬菌體1X1010 50^1/孔，孵育2小時(shí)。PBST洗滌5次后用HRP-抗M13抗體(PhamiaciaBiotech公司)檢測(cè)結(jié)合的麟體顆粒，四氨基麟胺(1MB)為底物， 顯色約5射中，加入100^1 H2S04中l(wèi)bS應(yīng)。領(lǐng)啶450nm的光吸收值。替艦照為對(duì)各細(xì)胞系均 沒(méi)有特異性的原始文庫(kù)Ht0體。測(cè)序得到的四種多肽對(duì)多種高轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞有高結(jié)合，而對(duì)多種i鵬移/不轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞結(jié)合很弱。進(jìn)一頻實(shí)本發(fā)明的12月游列對(duì)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的特 異結(jié)合具有廣i皆性，見(jiàn)圖4。圖4中 邁^^,多肽1噬菌體對(duì)各種細(xì)胞系的結(jié)合□ ^^ii多肽2噬菌體對(duì)各種細(xì),的結(jié)合■ ^^,多肽3噬菌體對(duì)各種細(xì)J^的結(jié)合H表示,多肽4噬菌體對(duì)各種細(xì)iam的結(jié)合□，原始文庫(kù)噬菌體對(duì)各種細(xì)皿的結(jié)合 實(shí)施例7:劃痕^i正明12月i^f腫瘤細(xì)皿動(dòng)能力的影響在24孑版#^孔的底面作標(biāo)己(如用賴(lài)什字， 點(diǎn)和十字可用于后續(xù)微中的定位比較， 赫用記號(hào)筆作禾斜己定位)。在24孑L板的齡孔中分另咖入3X1()5SW620細(xì)胞，培養(yǎng)2—3超 形成的單細(xì)鵬驢90—100%針孔的底面積。用黃色吸絲在單層細(xì)!Tbl定位點(diǎn)劃直線劃 痕。用培養(yǎng)難輕洗去劃掉的細(xì)胞。敏L加入107超多肽1的噬菌體，這種噬菌體就的12肽 序列為L(zhǎng)eu-Pro-Trpiys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pra。加107對(duì)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞沒(méi)有特異性結(jié)合的 原始庫(kù),體作為對(duì)照。用 清培養(yǎng)基(培養(yǎng)基用RPMI1640， 1%青霉素-鏈霉素 )培養(yǎng)， 并在O、 5和24小,照(圖像放大倍數(shù)為40)。以24孑L鵬的fei己將同一個(gè)孔不同時(shí)間點(diǎn)的圖 像錢(qián)，觀察腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，證明這種12肽在體外可以抑制離移月中瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力， 見(jiàn)圖5。圖5中上面一行g(shù)向SW620細(xì)胞中力口入原始文庫(kù)噬菌體，TM—行圖^^示向SW620中加入了特異結(jié)合轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的噬菌體，糊n^的時(shí)間^^帳后不同的拍照時(shí)間。SEQUENCE LISTING<藩南開(kāi)大學(xué)〈120〉與腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多船其細(xì)<歸4〈210〉 1〈211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 A!i^列〈220〉〈221〉 PEPTIDE〈222〉 (1)..(12) <223>〈400〉 1Leu Pro Tip Lys Glu Pro Tyr Tyr Leu Met Pro Pro1 5 10〈210〉 2〈211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 AX序列 〈220〉〈221〉 PEPTIDE〈222〉 (1)..(12) 〈223〉〈400〉 2Ser Pro Tip Ser Glu Pro Ala Tyr Tyr Leu Ala Pro1 5 10<210〉 3〈211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 AI)^列〈220〉〈221〉 PEPTIDE〈222〉 (1)..(12) 〈223〉〈400〉 3Val Pro Trp Met Glu Pro Ala Trp Gin Aig Phe Leu1 5 10〈210〉 4<211〉 12〈212〉 PRT〈213〉 AX/^列 〈220〉〈221〉 PEPTIDE 〈222〉 (1)..(12) 〈223〉〈400〉 4Ser Val Ser Val Gly Nfct Lys Pro Ser Pro Aig Pro1 5 10
權(quán)利要求
1.與腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，其氨基酸序列如下Leu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro。
2. 權(quán)利要求l戶(hù)艦的多肽在制備檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移試劑中的鵬。
3. 權(quán)利要求l戶(hù)做的多肽在開(kāi)發(fā)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的細(xì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及與腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明所述與腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合的多肽的氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Pro-Trp-Lys-Glu-Pro-Tyr-Tyr-Leu-Met-Pro-Pro。該多肽具有與腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的特性。因此，該多肽可以用作腫瘤轉(zhuǎn)移診斷的標(biāo)志物，并可應(yīng)用于開(kāi)發(fā)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的前體。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101319008SQ20081012863
公開(kāi)日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2005年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月27日
發(fā)明者張宏愷, 張翠竹, 曹又佳, 鑫 李 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)