專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分枝桿菌藥敏檢測領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏 檢測試劑盒及其檢測方法。
(二)
背景技術(shù)：
作為一種古老的傳染病，結(jié)核病的疫情在全球呈上升趨勢。據(jù)WT0估計， 目前全世界約有20億人感染結(jié)核桿菌，每年有800萬新發(fā)病例和300萬人的 死亡。在我國，根據(jù)2000年第四次全國結(jié)核病調(diào)查估算，全國約有5. 5億結(jié) 核病例，將近全國人口的一半。我國目前結(jié)核病的形式嚴峻。盡快建立先進的 診斷技術(shù)和治療措施，是一個緊迫的任務(wù)。不僅關(guān)系到千萬人身心健康，也是 關(guān)系到國民生計和國家經(jīng)濟發(fā)展的重要問題。
當前各醫(yī)院及醫(yī)療機構(gòu)在治療結(jié)核病的過程中仍然沿用傳統(tǒng)的方法即從 病灶部位或痰中分離活的菌體，分離培養(yǎng)進行純化，挑取純化的細菌進行藥敏 實驗。由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢一般需20-30天左右，而藥敏實驗同樣需要 20-30天，整個藥敏試驗需要2-3個月才能得到結(jié)果，這樣就嚴重影響病人的 及時正確用藥。臨床醫(yī)生往往為了減輕病人的痛苦，在沒有藥敏結(jié)果的情況下 憑經(jīng)驗先給病人用藥，這就帶有很大的盲目性，這也是當前結(jié)核桿菌耐藥率非 常高而且結(jié)核病的死亡率高的主要原因，嚴重影響人們的健康。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒及其檢測 方法，能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)核分枝桿菌藥敏性的快速檢測。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒，包含有標本處理試劑、分離純化 試劑、藥敏培養(yǎng)試劑、細胞活性檢測試劑，其中所述的細胞活性檢測試劑為alamar blue指示劑。
所述的分離純化試劑包括納米免疫磁性微珠，免疫磁性微珠上包被有結(jié)核 分枝桿菌特異性的膜抗體。
所述的標本處理試劑是氫氧化鈉和半胱氨酸， 一般氫氧化鈉的質(zhì)量濃度為4%。
所述的藥敏培養(yǎng)試劑包括培養(yǎng)基、選擇劑、結(jié)核分支桿菌生長因子、抗結(jié) 核分支桿菌用一線及二線抗生素，抗生素分為低濃度和高濃度兩種，同時設(shè)有 空白對照。
以上所述的標本處理試劑、分離純化試劑、藥每文培養(yǎng)試劑、alamar blue 指示劑都可以直接購買市售產(chǎn)品得到。
本發(fā)明還提供了一種所述結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒的檢測方法， 具體如下先用標本處理試劑處理標本使之液化，然后利用納米免疫磁性微珠 富集純化標本，之后將免疫磁性微珠加入藥敏培養(yǎng)試劑中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)試劑 中加入濃度為8-12%的細胞活性指示劑alamarblue，培養(yǎng)溫度為35-3rC的條 件下培養(yǎng)48-72h;然后利用分光光度計、熒光檢測儀或目測方法進行檢測。
本發(fā)明旨在通過alamar blue細胞活性指示劑的加入來實現(xiàn)快速檢測培養(yǎng) 液顏色的變化，進而推算結(jié)核分支桿菌的抗生素敏感情況， 一般藥敏培養(yǎng)三天 后即可觀察到藥敏培養(yǎng)液的變化。其原理如下將結(jié)核分枝桿菌在不同藥物濃 度下培養(yǎng)，同時向培養(yǎng)基里添加細胞代謝指示劑即alamarblue指示劑，在結(jié)核 分支桿菌對抗體不敏感的情況下，細胞代謝旺盛，細胞內(nèi)NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN和MDH/NAD的比值升高，處于還原環(huán)境。4聶入細月包內(nèi)的 染料被這些代謝中間體及細胞色素類還原后釋放到細胞外并溶于培養(yǎng)基中，使 培養(yǎng)基從無熒光的靛青藍變成有熒光的粉紅色。最后用普通分光光度計或熒光 光度計進行檢測或目視，吸光度和熒光強度與活性細胞數(shù)有關(guān)。將檢測結(jié)果與 空白對照孔比較，來判斷該結(jié)核分支桿菌對該藥物的敏感情況。
目測液體培養(yǎng)液的顏色，如果培養(yǎng)液的顏色與空白對照的顏色接近即培養(yǎng) 液由紫藍色變?yōu)榈奂t色說明該株結(jié)核分支桿菌耐藥，如果培養(yǎng)液的顏色無變 化則說明對抗生素壽丈感；用分光光度計檢測培養(yǎng)液的吸光度，如果培養(yǎng)液的吸 光度與空白對照的接近說明該抹結(jié)核分支桿菌耐藥，如果培養(yǎng)液的吸光度比空
白對照的大則說明對抗生素敏感；用焚光檢測儀檢測培養(yǎng)液的萸光強度，如果 培養(yǎng)液的熒光強度與空白對照的接近說明該抹結(jié)核分支桿菌耐藥，如果培養(yǎng)液 的熒光強度比空白對照的小則說明對抗生素敏感。
本發(fā)明進一步通過免疫磁珠的吸附作用分離和純化結(jié)核分支桿菌，將富集 的病人標本直接加入藥敏培養(yǎng)試劑里，然后進行藥敏試驗，通過免疫磁珠的富 集純化作用，基本上可將傳統(tǒng)的分離純化時間由20-30天縮短為1-2天。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，有以下優(yōu)點
采用本發(fā)明的試劑盒及結(jié)果分析方法可較傳統(tǒng)的方法在陽性檢出率上有 很大提高，在得出結(jié)果時間上大大提前，整個試驗在3天內(nèi)能夠得出結(jié)果。
具體實施例方式
以下以具體實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護范圍不限于
此
實施例1
本發(fā)明所用試劑盒，包含有標本處理試劑、分離純化試劑、藥敏培養(yǎng)試劑、細 胞活性檢測試劑。其中標本處理試劑為4。/。的氫氧化鈉和N-乙酰-L-半胱氨酸； 所述的分離純化試劑為包被有結(jié)核分支桿菌的特異性膜抗體的納米免疫磁性 微珠；所述的藥敏培養(yǎng)試劑為7H9培養(yǎng)基，其中含有抗結(jié)核分支桿菌用抗生素 鏈霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星，抗生素分為低濃度和高濃 度兩種，同時設(shè)有空白對照。所述的細胞活性檢測試劑為alamarblue指示劑。 檢測過程如下將結(jié)核分支桿菌的特異性膜抗體包被在納米免疫磁性微珠上備 用。取一份鏡鑒陽性的病人痰標本，用標本處理試劑(4y。的氫氧化鈉和N-乙酰 -L-半胱氨酸)處理使得液化后，加入特異性的免疫磁性微珠，充分攪動使得 結(jié)核分支桿菌全部結(jié)合在免疫磁珠上，收集免疫磁珠，得到富集和純化的結(jié)核 分支桿菌，用無菌的生理鹽水洗滌》茲珠三遍除去雜菌；用加樣槍等量吸取免疫 磁珠100ul加入各藥敏孔中，同時設(shè)兩孔不含抗生素的空白對照孔，向培養(yǎng)孔 中添加含10% (wt%) alamar blue的結(jié)核分支桿菌選擇性培養(yǎng)基7H9培養(yǎng)基，
培養(yǎng)基中含有甘油、胎牛血清及無機鹽等生長因子和抑制雜菌的抑菌劑。3rc
培養(yǎng)48小時。觀察或檢測培養(yǎng)結(jié)果，并與空白對照孔進行比較。結(jié)果如下
藥敏孔
空白孔鏈霉素利福平異煙肼乙胺丁醇左氧氟沙星 顏色 粉紅色 藍色 藍色 粉紅色 藍色 藍色 藥敏結(jié)果 敏感 敏感 耐藥 敏感 敏感
權(quán)利要求
1. 一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒，包含有標本處理試劑、分離純化試劑、藥敏培養(yǎng)試劑、細胞活性檢測試劑，其特征在于所述的細胞活性檢測試劑為alamar blue指示劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒，其特征在于所述的 分離純化試劑包括納米免疫磁性微珠，免疫磁性微珠上包被有結(jié)核分枝桿菌特 異性的膜抗體。
3. 如權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒，其特征在于所述的 標本處理試劑是氫氧化鈉和半胱氨酸。
4. 如權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌快速藥敏^r測試劑盒，其特征在于所述的 藥敏培養(yǎng)試劑包括培養(yǎng)基、選擇劑、結(jié)核分支桿菌生長因子、抗結(jié)核分支桿菌 用一線及二線抗生素，抗生素分為低濃度和高濃度兩種，同時設(shè)有空白對照。
5. 如權(quán)利要求l-4之一所述結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒的檢測方法，其 特征在于先用標本處理試劑處理標本使之液化，然后利用納米免疫磁性微珠富 集純化標本，之后將免疫磁性微珠加入藥敏培養(yǎng)試劑中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)試劑中 加入濃度為8-12%的細胞活性指示劑alamarblue,培養(yǎng)溫度為35-37"C的條件 下培養(yǎng)48-72h;然后利用分光光度計、熒光檢測儀或目測方法進行檢測。
6. 如權(quán)利要求5所述結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于所述的標本處理試劑為氬氧化鈉和半胱氨酸。
7. 如權(quán)利要求5所述結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于所述藥敏培養(yǎng)試劑為7H9培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒及其檢測方法。所述結(jié)核分枝桿菌快速藥敏檢測試劑盒包含有標本處理試劑、分離純化試劑、藥敏培養(yǎng)試劑、細胞活性檢測試劑，其中細胞活性檢測試劑為alamar blue指示劑。采用本發(fā)明的試劑盒及結(jié)果分析方法可較傳統(tǒng)的方法在陽性檢出率上有很大提高，在得出結(jié)果時間上大大提前，整個試驗在3天內(nèi)能夠得出結(jié)果。
文檔編號G01N21/00GK101377495SQ20081014134
公開日2009年3月4日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日
發(fā)明者付光宇, 吳學煒, 斌 婁, 胡英會, 苗蘭芳, 陸影楠 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司