專利名稱：：用分光光度計(jì)測(cè)定糖化酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化學(xué)分析領(lǐng)域，具體涉及一種用分光光度計(jì)測(cè)定糖化酶活力的方法。
背景技術(shù)：
：葡萄糖淀粉酶(GlucoamylaseEC3.2.1.3)又稱y-淀粉酶，簡(jiǎn)稱糖化酶。主要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等絲狀真菌和酵母中，同時(shí)也存在于人的唾液、動(dòng)物胰腺及細(xì)菌中。已報(bào)道的產(chǎn)糖化酶真菌微生物有23個(gè)屬35個(gè)種，細(xì)菌有3屬3種，用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株主要是黑曲霉。糖化酶是一種外切型糖苷酶，從淀粉的非還原性末端依次水解a-l，4糖苷鍵，切下一個(gè)個(gè)葡萄糖單元，并像P-淀粉酶一樣，使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化，形成p-D-葡萄糖。對(duì)于支鏈淀粉，當(dāng)遇到分支點(diǎn)時(shí)，它也可以水解a-l，6糖苷鍵，由此將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖.糖化酶也能微弱水解a-l，3連接的碳鏈，它一般都能將淀粉百分之百地水解生成葡萄糖，因此被廣泛地應(yīng)用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有機(jī)酸、甘油、淀粉糖等工業(yè)中，是我國(guó)產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。但是，測(cè)定糖化酶活性的條件各不相同，我國(guó)大多采用終濃度1-1.6%可溶性淀粉為底物，加入酶液后于pH4.5-4.8，40-50'C反應(yīng)一定時(shí)間，用次碘酸鹽法測(cè)定還原糖含量，以每小時(shí)生成lmg葡萄糖所需的酶量，稱為一個(gè)單位。美國(guó)Miles公司糖化酶DIAZYME采用4。/。淀粉為底物于pH值4.2，60'C反應(yīng)lh用Schoorl法測(cè)定所生成葡萄糖的量，以lh生成lg還原糖作為l個(gè)單位(DU)。日本常用SP單位表示糖化酶活性，使用1.1%可溶性淀粉為底物，于pH4.8，55t:反應(yīng)lh,用Lane-Eynon法定量還原糖，以每小時(shí)生成10mg葡萄糖所需酶量為l個(gè)單位。所有這些檢測(cè)方法不僅速度慢，而且操作繁瑣，對(duì)生產(chǎn)糖化酶過程中的在線測(cè)量十分不利，不能及時(shí)地指導(dǎo)生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有測(cè)定糖化酶活性方法中存在的測(cè)量速度慢，操作繁瑣的缺點(diǎn)，提供一種測(cè)量速度快，操作方便的用分光光度計(jì)測(cè)定糖化酶活力的方法。本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的用分光光度計(jì)測(cè)定糖化酶活力的方法，它是按以下步驟進(jìn)行的(O梯度樣品的制作稱取已知酶活的液體糖化酶，定容配制成濃度為0.0020~0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5個(gè)比色管，分別加入20~30mL質(zhì)量濃度為1.5~2.5%的淀粉溶液和38mLpH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，分別加入0~2mL的蒸餾水后搖勻4(TC水浴預(yù)熱5-10min;5個(gè)試管中蒸餾水的添加量呈梯度變化，向上述比色管中分別加入不同稀釋倍數(shù)的糖化酶溶液，開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)2535min，分別向每個(gè)比色管中添加0.2~0.5mL質(zhì)量濃度為20~25%的NaOH溶液，搖勻，迅速用水冷卻，終止酶反應(yīng)；(2)梯度樣品吸光度的測(cè)定分別吸取步驟(1)得到的反應(yīng)液稀釋20倍，取0.5~2mL稀釋的反應(yīng)液到試管中，加入相同體積量的3，5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴35min，在波長(zhǎng)在520nm，測(cè)定各個(gè)溶液的吸光度，以酶活為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到函數(shù)方程；(3)待測(cè)糖化液的制備稱取0.5-1.5g糖化酶樣品，于500mL容量瓶中用pH為4.6的乙酸一乙酸鈉緩沖溶液稀釋定容，于比色管中加入2030mL質(zhì)量濃度為1.5~2.5%的淀粉溶液和38mLpH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，4(TC水浴預(yù)熱510min;加入待測(cè)糖化酶溶液1.5~2.5mL，開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)2535min，向比色管中添加0.20.5mL質(zhì)量濃度為2025。/。的NaOH溶液，搖勻，迅速用水冷卻，終止酶反應(yīng)；(4)空白液制備于比色管中加入20~30mL質(zhì)量濃度為1.5~2.5%的淀粉溶液和38mLpH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，4(TC水浴預(yù)熱510min;向比色管中添加0.2-.5質(zhì)量濃度為20~25%的NaOH溶液，加入1.5~2.5mL待測(cè)糖化酶溶液，搖勻，迅速用水冷卻；(5)酶活力的測(cè)定分別吸取5mL糖化液和5mL空白液，用蒸餾水稀釋20倍定容至刻度，然后分別取0051.5mL糖化液、空白液于兩個(gè)試管中，各加相同體積量的3，5-二硝基水楊酸溶液，共同沸水浴35min，在520nm處比色，記錄吸光度；(6)測(cè)出樣品吸光度后，帶入步驟(2)得到的函數(shù)方程得到對(duì)應(yīng)的糖化酶活力。所用的3，5-二硝基水楊酸溶液的制備方法如下(1)甲液溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2mL10。/。氫氧化鈉中，并稀釋至69mL,在此溶液中加入6.9g亞硫酸氫鈉；(2)乙液稱取255g酒石酸鈉，加到300mL10%氫氧化鈉中，再加入880mLl%3，5-二硝基水楊酸溶液；(3)將甲液與乙液相混合即得黃色試劑，貯于棕色試劑瓶中，在室溫下，放置710天以后使用。本發(fā)明方法的測(cè)定原理如下一定量的淀粉經(jīng)糖化酶水解為葡萄糖，用酶活量越高，反應(yīng)液還原糖越多，利用3，5-二硝基水楊酸(DNS)與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度和酶活力呈正比例關(guān)系，利用分光光度計(jì)比色可以知道樣品中的酶活力。由于3，5-二硝基水楊酸與還原糖顯色反應(yīng)靈敏度高，利用分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)，可以快速測(cè)量糖化酶酶活，另外該方法操作簡(jiǎn)便，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。圖l是實(shí)施例l中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2是實(shí)施例2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖3是實(shí)施例3中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。實(shí)施例l本發(fā)明方法的測(cè)定原理如下一定量的淀粉經(jīng)糖化酶水解為葡萄糖，用酶活量越高，反應(yīng)液還原糖越多，利用3，5-二硝基水楊酸(DNS)與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度和酶活力呈正比例關(guān)系，利用分光光度計(jì)比色可以知道樣品中的酶活力。糖化酶水解淀粉反應(yīng)如下(C6H10O5)n+nH20=nC6H12063，5-二硝基水楊酸(DNS)與還原糖的反應(yīng)如下(p〇OH沸水浴^^OH+C6H1206-^I+CeH^黃色棕紅色在520nm處，3-氨基-5-硝基水楊酸有強(qiáng)吸收，以空白為0點(diǎn)，以確定吸光度。1.材料與試劑HH-S24數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市大地自動(dòng)化儀器四廠721可見光分光光度計(jì)上海箐華科技儀器有限公司BS/BT124s分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司糖化酶(酶活132600irg")河南瑞馳生物科技有限公司生產(chǎn)化學(xué)試劑均為分析純2.試劑的配制2.1O.lmol丄-1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6):稱取6.7g乙酸鈉(CH3COONa*3H20)，吸取冰乙酸2.6mL,用蒸餾水溶解定容至lOOOmL,上述緩沖溶液應(yīng)以酸度計(jì)校正pH值。2.220X氫氧化鈉溶液:稱取20g分析純氫氧化鈉，用蒸餾水溶解定容至100mL。2.32X可溶性淀粉溶液:稱取可溶性淀粉2.00g，然后用少量蒸餾水調(diào)勻，徐徐傾入已沸的蒸餾水中，煮沸至透明，冷卻，用蒸餾水定容至100mL,此溶液需當(dāng)天配制。注:可溶性淀粉應(yīng)符合HG3-3095質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。2.4DNS溶液的配制(1)甲液溶解6.9克結(jié)晶酚于15.2毫升10%氫氧化鈉中，并稀釋至69毫升，在此溶液中加入6.9克亞硫酸氫鈉。(2)乙液稱取255克酒石酸鈉，加到300毫升10%氫氧化鈉中，再加入880毫升1°/。3,5-二硝基水楊酸溶液。(3)將甲液與乙液相混合即得黃色試劑，貯于棕色試劑瓶中。在室溫下，放置710天以后使用。3.測(cè)定方法(1)梯度樣品的制作在分析天平準(zhǔn)確稱取1.3g已知酶活132600irg"液體糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取6個(gè)50mL的比色管，分別加25mL2%的淀粉溶液，5mL0.1mol丄"乙酸-乙酸鈉緩沖液，用微量移液管取2mL、1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、OmL蒸餾水，搖勻。40。C水浴鍋中恒溫預(yù)熱5min。依次加入OmL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2mL稀釋的液體糖化酶到比色管中，立即計(jì)時(shí)，反應(yīng)30min。分別向每個(gè)比色管中添加0.2mL20%NaOH，迅速用水冷卻，終至酶反應(yīng)。(2)梯度樣品吸光度的測(cè)定分別吸取5mL反應(yīng)液，用蒸餾水定容到100mL，然后取0.5mL稀釋的反應(yīng)液到試管中，加入0.5mLDNS，沸水浴3min。分別向試管中加入8mL蒸餾水，用lcm比色皿，以O(shè)mL稀釋糖化酶為O.OO的試劑溶液調(diào)整分光光度計(jì)的零點(diǎn)，在波長(zhǎng)在520nm，測(cè)定各比色管中溶液的吸光度，記錄吸光度，結(jié)果見表l。以酶活為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖l。表l.不同酶活力的吸光度稀釋酶液/mL蒸餾水/mL酶活力/Xl()4uDNS/mL0D52O00200.5010.41.63.5860.50.10720.81.27.1720.50.2491.20.810.7580.50.34241.60.414.340.50.44952.0017.930.50.535(3)待測(cè)酶液的制備稱取lg樣品，于500mL的容量瓶中，用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6)稀釋定容至刻度。吸取25mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力卩5mL0.1mol丄"乙酸-乙酸鈉緩沖液，于4(TC水浴預(yù)熱5min。準(zhǔn)確加入待測(cè)酶液2mL，搖勻，立即計(jì)時(shí)，于4(TC水浴鍋保溫糖化30min，迅速加入0.2mL20n/。NaOH溶液，搖勻，迅速用水冷卻，終至酶解反應(yīng)。(4)空白液的制備吸取25mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力B5mL8O.lmol七"乙酸-乙酸鈉緩沖液，于4(TC水浴鍋中預(yù)熱5min,再保溫30min，迅速加入0.2mL20。/。NaOH溶液，力卩2mL待測(cè)酶液，搖勻，迅速用水冷卻。(5)酶活力的測(cè)定吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸餾水定容至刻度，吸取5mL空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸餾水定容至刻度。然后分別取甲、乙容量瓶稀釋液0.5mL到甲(糖化液)、乙(空白液)兩試管中，各加入0.5mLDNS,共同沸水浴3min。分別向試管中加入8mL蒸餾水，在520nm處比色，記錄吸光度。(6)測(cè)出樣品吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的糖化酶活力。4.計(jì)算4.1lg酶液在40'C、pH4.6的條件下，lh分解可溶性淀粉產(chǎn)生lmg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。由不同的酶活力測(cè)的吸光度，做出直線，如圖l。得到函數(shù)式Y(jié)=0.0309-X式中x—酶活力(l(^u/g)Y—吸光度測(cè)出樣品的吸光度就可以通過公式把酶活力計(jì)算出來。4.2加標(biāo)回收用13.2xl0Au/g標(biāo)準(zhǔn)酶液向樣品中加lg標(biāo)準(zhǔn)酶液，溶液，連續(xù)平行測(cè)量4次，測(cè)量結(jié)果見表2。表2糖化酶酶活回收率測(cè)量結(jié)果樣品含量10411加標(biāo)后含量10V加標(biāo)量10411回收率12.32615.33613.298.5%2.2851557513.2100%2.38415.28413.297.7%42.21415.27413.298.9%平均98.775%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)0.957%根據(jù)表2結(jié)果，用分光光度法測(cè)定糖化酶酶活加標(biāo)回收率可保證在95.0%~105.0%范圍之間內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.957%，完全符合分析方法中的規(guī)定。3.3對(duì)照實(shí)驗(yàn)取13.2xl(yWg標(biāo)準(zhǔn)酶液lg，分別用分光光度計(jì)法和碘量法進(jìn)行測(cè)量糖化酶酶活力，測(cè)量結(jié)果見表3。碘量法測(cè)量糖化酶酶活力按GB8276-87進(jìn)行測(cè)定。表3分光光度計(jì)法與碘量t法實(shí)驗(yàn)對(duì)照實(shí)驗(yàn)分光光度計(jì)法10411碘量法10、i13.18713.232213.14513.023313.24313.221平均13.19213.158實(shí)驗(yàn)表明，分光光度計(jì)法與碘量法的精度相差不大，但分光光度計(jì)法比碘量法步驟簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，易于應(yīng)用在糖化酶企業(yè)的在線檢測(cè)。實(shí)施例21.材料與試劑HH-S24數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市大地自動(dòng)化儀器四廠721可見光分光光度計(jì)上海箐華科技儀器有限公司BS/BT124s分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司糖化酶(酶活132600irg")河南瑞馳生物科技有限公司生產(chǎn)化學(xué)試劑均為分析純2.試劑的配制2.1O.lmol.U1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6):稱取6.7g乙酸鈉(CH3COONa.3H20)，吸取冰乙酸2.6mL,用蒸餾水溶解定容至lOOOmL,上述緩沖溶液應(yīng)以酸度計(jì)校正pH值。2.225X氫氧化鈉溶液:稱取25g分析純氫氧化鈉，用蒸餾水溶解定容至100mL。2.31.5X可溶性淀粉溶液:稱取可溶性淀粉1.50g，然后用少量蒸餾水調(diào)勻,徐徐傾入已沸的蒸餾水中，煮沸至透明，冷卻，用蒸餾水定容至100mL，此溶液需當(dāng)天配制。注:可溶性淀粉應(yīng)符合HG3-3095質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。2.4DNS溶液的配制(1)甲液溶解6.9克結(jié)晶酚于15.2毫升10%氫氧化鈉中，并稀釋至69毫升，在此溶液中加入6.9克亞硫酸氫鈉。(2)乙液稱取255克酒石酸鈉，加到300毫升10%氫氧化鈉中，再加入880毫升1%3，5-二硝基水楊酸溶液。10(3)將甲液與乙液相混合即得黃色試劑，貯于棕色試劑瓶中。在室溫下，放置710天以后使用。3.測(cè)定方法(1)梯度樣品的制作在分析天平準(zhǔn)確稱取1.5g已知酶活132600irg"液體糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取5個(gè)50mL的比色管，分別加20mL2%的淀粉溶液，3mL乙酸-乙酸鈉緩沖液，用微量移液管取1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、OmL、蒸餾水，搖勻。4(TC水浴鍋中恒溫預(yù)熱10min。依次加入OmL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、稀釋的液體糖化酶到比色管中，立即計(jì)時(shí)，反應(yīng)25min。分別向每個(gè)比色管中添加0.5mL25%NaOH，迅速用水冷卻，終至酶反應(yīng)。(2)梯度樣品吸光度的測(cè)定分別吸取5mL反應(yīng)液，用蒸餾水定容到100mL，然后取2mL稀釋的反應(yīng)液到試管中，加入2mLDNS，沸水浴4min。分別向試管中加入10mL蒸餾水，用lcm比色皿，以O(shè)mL稀釋糖化酶為O.OO的試劑溶液調(diào)整分光光度計(jì)的零點(diǎn)，在波長(zhǎng)在20nm，測(cè)定各比色管中溶液的吸光度，記錄吸光度，結(jié)果見表4。以酶活為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。表4.不同酶活力的吸光度稀釋酶液/mL蒸餾水/mL酶活力/X10"411DNS/mL00200.5010.51.53.3530.50.10321.01.07.9870.50.2531.50.510.580.50.34042.0014.340.50.447(3)待測(cè)酶液的制備稱取0.5g樣品，于500mL的容量瓶中，用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6)稀釋定容至刻度。吸取20mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力口3mL0.1mol丄"乙酸-乙酸鈉緩沖液，于40。C水浴預(yù)熱10min。準(zhǔn)確加入待測(cè)酶液2mL，搖勻，立即計(jì)時(shí)，于4(TC水浴鍋保溫糖化25min，迅速加入0.5L20。/。NaOH溶液，搖勻，迅速用水冷卻，終至酶解反應(yīng)。(4)空白液的制備吸取20mll.5。/。的淀粉溶液置入50mL比色管中，加3mL0.1mol丄"乙酸-乙酸鈉緩沖液，于4(TC水浴鍋中預(yù)熱5min，再保溫30min，迅速加入0.5L20。/。NaOH溶液，加2mL待測(cè)酶液，搖勻，迅速用水冷卻。(5)酶活力的測(cè)定吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸餾水定容至刻度，吸取5mL空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸餾水定容至刻度。然后分別取甲、乙容量瓶稀釋液0.5mL到甲(糖化液)、乙(空白液)兩試管中，各加入0.5mLDNS，共同沸水浴3min。分別向試管中加入8mL蒸餾水，在520nm處比色，記錄吸光度。(6)測(cè)出樣品吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的糖化酶活力。4.計(jì)算4.1lg酶液在4(TC、pH4.6的條件下，lh分解可溶性淀粉產(chǎn)生lmg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。由不同的酶活力測(cè)的吸光度，做出直線，如圖2。得到函數(shù)式Y(jié)-0.0309-X式中X—酶活力(10Vg)Y—吸光度測(cè)出樣品的吸光度就可以通過公式把酶活力計(jì)算出來。4.2加標(biāo)回收用13.2xl(Ai/g標(biāo)準(zhǔn)酶液向樣品中加lg標(biāo)準(zhǔn)酶液，溶液，連續(xù)平行測(cè)量4次，測(cè)量結(jié)果見表2。表5糖化酶酶活回收率測(cè)量結(jié)果樣品含量10、加標(biāo)后含量10411加標(biāo)量10411回收率12.30515.35213.298.8%22.19615.47213.2100.5%32.29615.39813.299.3%42.31215.40313.299.2%平均99.5%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)0.733%根據(jù)表2結(jié)果，用分光光度法測(cè)定糖化酶酶活加標(biāo)回收率可保證在95.0%105.0%范圍之間內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.733%，完全符合分析方法中的規(guī)定。3.3對(duì)照實(shí)驗(yàn)取13.2xl0Au/g標(biāo)準(zhǔn)酶液lg，分別用分光光度計(jì)法和碘量法進(jìn)行觀懂糖化酶酶活力，測(cè)量結(jié)果見表3。碘量法測(cè)量糖化酶酶活力按GB8276-87進(jìn)行測(cè)定。表6分光光度計(jì)法與碘量法實(shí)驗(yàn)對(duì)照<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)驗(yàn)表明，分光光度計(jì)法與碘量法的精度相差不大，但分光光度計(jì)法比碘量法步驟簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，易于應(yīng)用在糖化酶企業(yè)的在線檢測(cè)。實(shí)施例32.材料與試劑HH-S^數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市大地自動(dòng)化儀器四廠721可見光分光光度計(jì)上海箐華科技儀器有限公司BS/BT124s分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司糖化酶(酶活132600uf1)河南瑞馳生物科技有限公司生產(chǎn)化學(xué)試劑均為分析純2.試劑的配制2.1O.lmol丄-1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6):稱取6.7g乙酸鈉(CH3COONa.3H20)，吸取冰乙酸2.6mL，用蒸餾水溶解定容至lOOOmL,上述緩沖溶液應(yīng)以酸度計(jì)校正pH值。2.223X氫氧化鈉溶液:稱取23g分析純氫氧化鈉，用蒸餾水溶解定容至lOOmLo2.32.5X可溶性淀粉溶液:稱取可溶性淀粉2.50g，然后用少量蒸餾水調(diào)勻，徐徐傾入已沸的蒸餾水中，煮沸至透明，冷卻，用蒸餾水定容至100mL，此溶液需當(dāng)天配制。注:可溶性淀粉應(yīng)符合HG3-3095質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。2.4DNS溶液的配制(O甲液溶解6.9克結(jié)晶酚于15.2毫升10%氫氧化鈉中，并稀釋至69毫升，在此溶液中加入6.9克亞硫酸氫鈉。(2)乙液稱取255克酒石酸鈉，加到300毫升10%氫氧化鈉中，再加入880毫升1%3，5-二硝基水楊酸溶液。(3)將甲液與乙液相混合即得黃色試劑，貯于棕色試劑瓶中。在室溫下，放置7-10天以后使用。3.測(cè)定方法(1)梯度樣品的制作在分析天平準(zhǔn)確稱取l.Og已知酶活132600irg"液體糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取6個(gè)50mL的比色管，分別加30mL2°/。的淀粉溶液，8mL0.1mol丄"乙酸-乙酸鈉緩沖液，用微量移液管取2mL、1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、OmL蒸餾水，搖勻。4(TC水浴鍋中恒溫預(yù)熱8min。依次加入0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2mL稀釋的液體糖化酶到比色管中，立即計(jì)時(shí)，反應(yīng)35min。分別向每個(gè)比色管中添加0.3mL25%NaOH,迅速用水冷卻，終至酶反應(yīng)。(2)梯度樣品吸光度的測(cè)定分別吸取5mL反應(yīng)液，用蒸餾水定容到lOOmL,然后取1.5mL稀釋的反應(yīng)液到試管中，加入1.5mLDNS，沸水浴3min。分別向試管中加入8mL蒸餾水，用lcm比色皿，以O(shè)mL稀釋糖化酶為O.OO的試劑溶液調(diào)整分光光度計(jì)的零點(diǎn)，在波長(zhǎng)在520nm，測(cè)定各比色管中溶液的吸光度，記錄吸光度，結(jié)果見表7。以酶活為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。表7.不同酶活力的吸光度稀釋酶液/raL蒸餾水/mL酶活力/Xl(T411DNS/mL0D5M00200.5010.41.63.5860.50.10720.81.27.6200.50.25031.20.810.7580.50.34441.60.414.1200.50.44552.0017.8540.50.535(3)待測(cè)酶液的制備稱取1.5g樣品，于500mL的容量瓶中，用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6)稀釋定容至刻度。吸取30mL2W的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力B8mL0.1mol七"乙酸-乙酸鈉緩沖液，于4(TC水浴預(yù)熱5min。準(zhǔn)確加入待測(cè)酶液2mL，搖勻，立即計(jì)時(shí)，于40。C水浴鍋保溫糖化30min，迅速加入0.2mL20。/。NaOH溶液，搖勻，迅速用水冷卻，終至酶解反應(yīng)。14(4)空白液的制備吸取30mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力n8mL0.1mol七"乙酸-乙酸鈉緩沖液，于4(TC水浴鍋中預(yù)熱5min，再保溫30min，迅速加入0.3mL20。/。NaOH溶液，力卩2mL待測(cè)酶液，搖勻，迅速用水冷卻。(5)酶活力的測(cè)定吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸餾水定容至刻度，吸取5Mlp空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸餾水定容至刻度。然后分別取甲、乙容量瓶稀釋液0.5mL到甲(糖化液)、乙(空白液)兩試管中，各加入0.5mLDNS，共同沸水浴3min。分別向試管中加入8mL蒸餾水，在520nm處比色，記錄吸光度。(6)測(cè)出樣品吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上査出對(duì)應(yīng)的糖化酶活力。4.計(jì)算4.1lg酶液在4(TC、pH4.6的條件下，lh分解可溶性淀粉產(chǎn)生lmg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。由不同的酶活力測(cè)的吸光度，做出直線，如圖3。得到函數(shù)式Y(jié)-0.031-X式中X—酶活力(l(Ai/g)Y—吸光度測(cè)出樣品的吸光度就可以通過公式把酶活力計(jì)算出來。4.2加標(biāo)回收用13.2xl(Ai/g標(biāo)準(zhǔn)酶液向樣品中加lg標(biāo)準(zhǔn)酶液，溶液，連續(xù)平行測(cè)量4次，測(cè)量結(jié)果見表8。表8糖化酶酶活回收率測(cè)量結(jié)果樣品含量10411加標(biāo)后含量i(Ai加標(biāo)量10411回收率12.30515.29513.298.41%2.21415.45813.2100.33%32.38415.27413.297.65%42.29615.35213.298.91%平均98.825%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)0.795%根據(jù)表2結(jié)果，用分光光度法測(cè)定糖化酶酶活加標(biāo)回收率可保證在95.0%105.0%范圍之間內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.823%，完全符合分析方法中的規(guī)定。3.3對(duì)照實(shí)驗(yàn)取13.2xl(Ai/g標(biāo)準(zhǔn)酶液lg，分別用分光光度計(jì)法和碘量法進(jìn)行測(cè)量糖化酶酶活力，測(cè)量結(jié)果見表9。碘量法測(cè)量糖化酶酶活力按B8276-87進(jìn)行測(cè)定。表9分光光度計(jì)法與碘量法實(shí)驗(yàn)對(duì)照<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)驗(yàn)表明，分光光度計(jì)法與碘量法的精度相差不大，但分光光度計(jì)法比碘量法步驟簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，易于應(yīng)用在糖化酶企業(yè)的在線檢測(cè)。權(quán)利要求1.一種用分光光度計(jì)測(cè)定糖化酶活力的方法，其特征在于它是按以下步驟進(jìn)行的(1)梯度樣品的制作稱取已知酶活的液體糖化酶，定容配制成濃度為0.0020～0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5個(gè)比色管，分別加入20～30mL質(zhì)量濃度為1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mLpH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，分別加入0～2mL的蒸餾水后搖勻40℃水浴預(yù)熱5～10min；5個(gè)試管中蒸餾水的添加量呈梯度變化，向上述比色管中分別加入糖化酶溶液，開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)25～35min，分別向每個(gè)比色管中添加0.2～0.5mL質(zhì)量濃度為20～25％的NaOH溶液，搖勻，迅速用水冷卻，終止酶反應(yīng)；(2)梯度樣品吸光度的測(cè)定分別吸取步驟(1)得到的反應(yīng)液稀釋20倍，取0.5～2mL稀釋的反應(yīng)液到試管中，加入相同體積量的3，5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴3～5min，在波長(zhǎng)在520nm，測(cè)定各個(gè)溶液的吸光度，以酶活為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到函數(shù)方程；(3)待測(cè)糖化液的制備稱取0.5～1.5g糖化酶樣品，于500mL容量瓶中用pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液稀釋定容，于比色管中加入20～30mL質(zhì)量濃度為1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mLpH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，40℃水浴預(yù)熱5～10min；加入待測(cè)糖化酶溶液1.5～2.5mL，開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)25～35min，向比色管中添加0.2～0.5mL質(zhì)量濃度為20～25％的NaOH溶液，搖勻，迅速用水冷卻，終止酶反應(yīng)；(4)空白液制備于比色管中加入20～30mL質(zhì)量濃度為1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mLpH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液，40℃水浴預(yù)熱5～10min；向比色管中添加0.2～0.5mL質(zhì)量濃度為20～25％的NaOH溶液，加入1.5～2.5mL待測(cè)糖化酶溶液，搖勻，迅速用水冷卻；(5)酶活力的測(cè)定分別吸取5mL糖化液和5mL空白液，用蒸餾水稀釋20倍定容至刻度，然后分別取0.05～1.5mL糖化液、空白液于兩個(gè)試管中，各加相同體積量的3，5-二硝基水楊酸溶液，共同沸水浴3～5min，在520nm處比色，記錄吸光度；(6)測(cè)出樣品吸光度后，帶入步驟(2)得到的函數(shù)方程得到對(duì)應(yīng)的糖化酶活力。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的用分光光度計(jì)測(cè)定糖化酶活力的方法，其特征在于所用的3，5-二硝基水楊酸溶液的制備方法如下(1)甲液溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2mL10。/。氫氧化鈉中，并稀釋至69mL，在此溶液中加入6.9g亞硫酸氫鈉；(2)乙液稱取255g酒石酸鈉，加到300mL10%氫氧化鈉中，再加入880mLl%3，5-二硝基水楊酸溶液；(3)將甲液與乙液相混合即得黃色試劑，貯于棕色試劑瓶中，在室溫下，放置710天以后使用。全文摘要一種用分光光度計(jì)測(cè)定糖化酶活力的方法，屬于生物化學(xué)分析領(lǐng)域。用分光光度計(jì)來測(cè)量由糖化酶水解淀粉產(chǎn)生的葡萄糖與3，5-二硝基水楊酸反應(yīng)對(duì)波長(zhǎng)為520nm光的吸收，來確定糖化酶酶活。該方法包括梯度樣品的制作、梯度樣品吸光度的測(cè)定、待測(cè)糖化液的制備、空白液制備、酶活力的測(cè)定。此方法簡(jiǎn)單，快速，靈敏度高，準(zhǔn)確及時(shí)地指導(dǎo)糖化酶工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)G01N33/50GK101676719SQ20081014140公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年9月19日優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日發(fā)明者崔躍遠(yuǎn),張志剛,馬歌麗,魏泉增申請(qǐng)人:河南瑞馳生物科技有限公司