專利名稱：：一種同時篩查多種重大傳染病的免疫層析試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種免疫層析試劑盒，具體地說，是涉及一種通過單次實驗即可實現(xiàn)艾滋、乙肝、丙肝、梅毒這四種重大傳染病中的三到四項同時篩查的免疫層析試劑盒。
背景技術(shù)：
：由于傳染病的蔓延，在體檢、獻(xiàn)血、輸血、手術(shù)前對傳染病檢測是必需的。目前傳染最廣泛，危害最大的幾種傳染病有艾滋、乙肝、丙肝、梅毒。乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒(HCV)抗體(anti-HCV)、艾滋病毒(HIV)抗體(anti-HIV)和P24抗原(HIVP24Ag)、梅毒螺旋體(TP)抗體(anti-TP)艮卩HBV、HCV、HIV、TP檢觀U，是目前傳染病篩查的主要項目。目前，檢測以上傳染病最常用的方法是免疫檢測，此方法以抗原-抗體的特異性識別為基礎(chǔ)，包括傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和近來興起的膠體法兩種。膠體法分為免疫層析和免疫滲濾兩種方式，其中以免疫層析法最為方便、快捷。我國有40%左右的人感染過HBV，其中約有10%的人攜帶HBsAg，快速準(zhǔn)確地檢測和普査HBsAg，對于乙型肝炎的預(yù)防、診斷和治療，具有極大的實用價值，HBsAg檢測一般采用的是雙抗體夾心法檢測。丙型肝炎是波及全球的傳染病，在輸血后的肝炎中，80-90%是丙型肝炎，在散發(fā)的非甲非乙肝炎中有50%以上是丙型肝炎，在肝炎的慢性化和肝硬化的發(fā)病過程中起著重要作用。間接法檢測HCV抗體(anti-HCV)是目前丙型肝炎篩査的主要方式。目前免疫檢測HIV的主流方式是雙抗原夾心法檢測HIV抗體(anti-fflV)，屬于fflV第三代檢測方法。正在逐步發(fā)展的是第四代檢測方法，它在第三代檢測方法的基礎(chǔ)上加入了HIVP24抗原檢測(雙抗體夾心法)，可以縮短檢測的窗口期。梅毒是一種傳播廣泛的性病，免疫學(xué)檢測梅毒主要采用的方式是雙抗原夾心法檢測TP抗體(anti-TP)。免疫層析法是上世紀(jì)九十年代興起的一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體/抗原先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素膜加樣端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體/抗原的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原/抗體即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。公開號為CN1409111A的中國專利文獻(xiàn)中曾提出一種"一種能同時檢測多種與疾病有關(guān)的抗原、抗體的裝置"，該裝置可以聯(lián)合檢測幾種傳染病，但是它采用的檢測手段是免疫滲濾法，操作步驟多，檢測時間長，不夠方便、快捷。公開號為CN1373365A的中國專利文獻(xiàn)中曾提出一種"血庫采血傳染病檢測蛋白質(zhì)芯片"，該芯片可以聯(lián)合檢測HBV、HCV、HIV、TP這四個項目，但是它的操作步驟多，檢測時間長，不夠方便、快捷，另外該方法沒有考慮到HIVP24Ag的檢測，致使檢測的窗口期較長，在檢測剛感染不久的病毒攜帶者血清時，由于此時anti-HIV還未產(chǎn)生，容易導(dǎo)致檢測的假陰性。公開號為CN1140090A的中國專利文獻(xiàn)中曾提出一種"人類免疫缺陷病毒丙肝病毒抗體聯(lián)合診斷試劑的制備方法"，它可以聯(lián)合檢測HIV和HCV兩種傳染病，但采用的是ELISA法，操作時間長，達(dá)不到快速診斷的要求。公開號為CN1305109A的中國專利文獻(xiàn)中曾提出一種"對艾滋病與丙型肝炎病毒抗體的聯(lián)合快速檢測方法"，此專利雖然可以聯(lián)合檢測HIV和HCV，但是采用的原理是間接法，比夾心法的特異性差。公開號為CN1627073A的中國專利文獻(xiàn)中曾提出一種"梅毒抗體與乙型肝炎表面抗原膠體金法聯(lián)合檢測試劑"，該試劑可以聯(lián)合快速檢測TP和HBV，但是未顧及到HIV和HCV。另夕卜，這種聯(lián)檢方式存在的缺陷就是為了保證試劑盒的特異性，就不能把膠體金用量調(diào)高，但是由于要同時檢測兩個項目，所以HIV和HCV各占一半的膠體金，這樣導(dǎo)致的結(jié)果是，每個項目的靈敏度比單獨(dú)檢測時低一半，在實際應(yīng)用時，會存在靈敏度偏低的問題。目前，還沒有能夠同時同時篩査HBV、HCV、HIV、TP這四種傳染病的免疫層析試劑盒問世，其主要原因在于還沒有解決幾個項目聯(lián)合檢測時，靈敏度不如單獨(dú)檢測的難題。因此，在體檢、獻(xiàn)血、輸血、手術(shù)前以及家體自檢等篩査時，需要多項分開檢測，不夠方便、快捷，從而導(dǎo)致檢測時間長，效率低，成本高，浪費(fèi)人力物力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種通過單次實驗即可實現(xiàn)艾滋、乙肝、丙肝、梅毒的三到四項重大傳染病同時篩查的免疫層析試劑盒，具有方便、快捷的優(yōu)勢，可以節(jié)省檢測時間，提高效率，降低成本，節(jié)約人力物力，可以提早檢測HIVP24抗體，縮短HIV感染的窗口期。本發(fā)明還提供一種通過單次實驗即可實現(xiàn)anti-HCV、anti-HIV/HIVP24Ag、anti-TP或者HBsAg、anti-HIV/HIVP24Ag、anti-TP或者HBsAg、anti-HCV、anti-TP或者HBsAg、anti-HCV、anti-HIV/HIVP24Ag同時篩査的免疫層析試劑盒。本發(fā)明還提供一種通過單次實驗即可實現(xiàn)HBsAg、anti-HCV、anti-HIV/HIVP24Ag、anti-TP四項同時篩査的免疫層析試劑盒。為了解決上面所說的多項目同時檢測時，靈敏度比不上單項檢測的問題，本發(fā)明采用了改進(jìn)的膠體金制備技術(shù)，將膠體金的顆粒大小從普通的2040nm提高到8090nm，從而保證了檢測的靈敏度。本發(fā)明試劑盒的制備、檢測方案如下(l)包被在固相載體上包被預(yù)先稀釋成工作濃度的針對HBsAg單克隆抗體、HCV抗原、HIV抗原和HIVP24單克隆抗體、TP抗原中的三到四項，以及質(zhì)控線抗體。(2)標(biāo)記將HBsAg單克隆抗體、HCV抗原、fflV抗原和HIVP24標(biāo)記抗體、TP抗原中的三到四項與標(biāo)記物標(biāo)記之后，分別與標(biāo)記好的對照線抗體以合適比例混合，浸泡玻璃纖維，干燥。(3)組裝PVC膠板，把包被好的NC膜，和玻璃纖維以及其它輔助材料，按照免疫層析試劑盒的一般組裝方法進(jìn)行組裝，用切條機(jī)切成試紙條。(4)檢測加入待測標(biāo)本，判定結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)選方案本發(fā)明所用的免疫層析固相載體，優(yōu)選硝酸纖維素濾膜(NC膜)。本發(fā)明的HIV檢測，優(yōu)選為fflV第四代檢測法，是基于anti-HIV檢測加上P24抗原檢測。本發(fā)明的HCV抗原、HIV抗原、TP抗原，優(yōu)選為基因工程重組抗原。本發(fā)明的針對HBsAg和fflVP24Ag單克隆抗體，優(yōu)選為鼠抗HBsAg和P24抗原單克隆抗體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，包被方式為每個檢測項目分開，例如，所有檢測項目在同一NC膜上分開劃線，最后在一個試紙條組裝。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方案中，包被方式為每個檢測項目分開，例如，每個檢測項目分開在不同的NC膜上劃線，每個項目分開布局組裝。在再一個優(yōu)選方案中，所有檢測項目的包被抗原/抗體混合，然后劃線，檢測線只有一條。本發(fā)明所用的標(biāo)記物，包括膠體金屬、分散型染料和染料標(biāo)記的微球、乳膠，進(jìn)一步優(yōu)選為膠體金、膠體銀、膠體硒，更進(jìn)一歩優(yōu)選膠體金。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方案中，免疫層析標(biāo)記物為乳膠。本發(fā)明的最優(yōu)方案是U)包被用劃膜儀在硝酸纖維素濾膜(NC膜)上劃預(yù)先稀釋成工作濃度的針對HBsAg單克隆抗體、HCV抗原、HIV抗原以及HIVP24Ag的單抗、TP抗原以及羊抗兔IgG抗體，共六條線。(2)標(biāo)記將HBsAg單克隆抗體、HCV抗原、HIV抗原以及HIVP24Ag的標(biāo)記抗體、TP抗原、兔IgG抗體分別與膠體金標(biāo)記之后，以合適比例混合。(3)組裝按照免疫層析試劑盒的一般組裝方法進(jìn)行，切成試紙條。(4)檢測加入待測標(biāo)本，在20分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下，①僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條帶，在HBV、HCV、HIV、TP各自測試區(qū)內(nèi)無條帶出現(xiàn)，為陰性(-);②兩條或兩條以上條帶出現(xiàn)，其中一條位于質(zhì)控區(qū)，其它條帶位于HBV、HCV、fflV、TP各自測試區(qū)，分別對應(yīng)HBV、HCV、HIV、TP陽性(+)，在HIV監(jiān)測區(qū)，當(dāng)HIV抗體或者HIVP24抗原有一項以上陽性時，可確定為陽性(+);③質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)條帶，表明不正確的操作過程或檢測卡己變質(zhì)損壞。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的試紙條重新測試。本發(fā)明的另一最優(yōu)方案是(1)包被用劃膜儀在四條硝酸纖維素濾膜(NC膜)上劃預(yù)先稀釋成工作濃度的針對HBsAg單克隆抗體、HCV抗原、HIV抗原以及HIVP24Ag單克隆抗體、TP抗原，以及各自的質(zhì)控線抗體。(2)標(biāo)記將HBsAg單克隆抗體、HCV抗原、HIV抗原以及HIVP24Ag標(biāo)記抗體、TP抗原分別與膠體金標(biāo)記之后，以合適比例與已經(jīng)標(biāo)記上膠體金的兔IgG抗體，浸泡玻璃纖維，冷凍干燥。(3)組裝PVC膠板，把HBV、HCV、HIV、TP每個項目的NC膜，和玻璃纖維以及其它輔助材料，按照免疫層析試劑盒的一般組裝方法進(jìn)行組裝，用切條機(jī)切成試紙條。把HBV、HCV、HIV、TP四種試紙條的加樣端圍放在一起，另外一端(吸水紙端)發(fā)散性排列成扇形或者圓形。(4)檢測在加樣端加入待測標(biāo)本，在20分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下，①在HBV、HCV、HIV、TP各自測試區(qū)內(nèi)無條帶出現(xiàn)，僅各自質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條帶，為陰性(-);②某項目檢測線出現(xiàn)條帶，對照線也出現(xiàn)條帶，可確定為該項目陽性(+);③某一試紙條的質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)條帶，表明不正確的操作過程或檢測卡已變質(zhì)損壞。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的試紙條重新測試。本發(fā)明的再一最優(yōu)方案是(1)包被用劃膜儀在一條硝酸纖維素濾膜(NC膜)上劃預(yù)先稀釋成工作濃度的針對HBsAg單克隆抗體、HCV抗原、HIV抗原以及HIVP24Ag單克隆抗體、TP抗原，以及羊抗兔IgG抗體。(2)標(biāo)記將HBsAg單克隆抗體、HCV抗原、HIV抗原以及HIVP24Ag第二單克隆抗體、TP抗原分別與膠體金標(biāo)記之后，以合適比例與已經(jīng)標(biāo)記上膠體金的兔IgG抗體，浸泡玻璃纖維，冷凍干燥。(3)組裝PVC膠板，把包被好的NC膜，和玻璃纖維以及其它輔助材料，按照免疫層析試劑盒的一般組裝方法進(jìn)行組裝，用切條機(jī)切成試紙條。(4)檢測在加樣端加入待測標(biāo)本，在20分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下，①測試區(qū)內(nèi)無條帶出現(xiàn)，自質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條帶，為陰性(-);②有兩條帶出現(xiàn)，其中一條位于質(zhì)控區(qū)，另一條帶位于檢測區(qū)，可確定為陽性(+)，③質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)條帶，表明不正確的操作過程或檢測卡己變質(zhì)損壞。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的試紙條重新測試。本發(fā)明的優(yōu)點以及創(chuàng)新性在于1、多個項目聯(lián)合免疫層析法快速檢測，方便、快捷；2、加入了HIVP24Ag檢測，縮短HIV檢測的窗口期；3、可以用一條試紙篩査幾種傳染病，節(jié)省試劑盒成本；4、加大膠體金的顆粒，使聯(lián)檢時的靈敏度可以和單項檢測的靈敏度相當(dāng)。本發(fā)明的目的、特征及優(yōu)點將結(jié)合實施例，作進(jìn)一步詳細(xì)闡述。應(yīng)當(dāng)理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍，實施例中未注明具體條件之處，通常按照免疫層析法診斷的常規(guī)實驗條件，或者試紙條生產(chǎn)廠家推薦的方法進(jìn)行，在此不必贅述。具體實施例方式實施例1抗原抗體的包被將HBsAg單克隆抗體、HCV抗原、fflV抗原以及HIVP24單克隆抗體、TP抗原分別稀釋到合適濃度，用劃膜儀劃到NC膜上，即為HBV、HCV、HIV(包括HIVP24Ag)、TP五條檢測線。將質(zhì)控線抗體羊抗兔IgG抗體稀釋到最適濃度用劃膜儀劃到NC膜上，即為對照線。將劃好的NC膜置于37度恒溫箱中干燥半小時。實施例2膠體金的準(zhǔn)備取100ml超純水于500ml圓底燒瓶中，放到加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入lml1%氯金酸(美國Sigma-Aldrich公司)的水溶液，沸騰后加入0.5ml1%的檸檬酸鈉(美國Sigma-Aldrich公司)，繼續(xù)加熱IO分鐘后放置自然冷卻，即為膠體金。實施例3膠體金-標(biāo)記物的制備取10mlHBsAg單克隆抗體裝入透析袋中，對10mMPBSPH7.4緩沖液透析8小時，其間每1小時換一次緩沖液。取10ml膠體金，用0.2MK2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金的pH至67，加入200ugHBsAg單克隆抗體，繼續(xù)攪拌510分鐘。在上述混合液中加入0.5ml2MBSA溶液，繼續(xù)攪拌5分鐘。將上述混合液裝入合適的離心管中。5000rpm離心IO分鐘，吸出上清，將沉淀收集至一合適容器；對上清再用10000rpm離心15分鐘，重復(fù)第一次離心的操作；對上清再用12000rpm離心30分鐘，棄掉上清，將三次離心的沉淀收集到同一離心管中，用膠體金稀釋液定容至lml，于-4'C冰箱中保存。HCV抗原、fflV抗原以及P24Ag單克隆抗體、TP抗原、質(zhì)控抗體的膠體金標(biāo)記物也按照上述方法進(jìn)行。實施例4金標(biāo)試紙條的組裝將標(biāo)記好的上述標(biāo)記物按照恰當(dāng)?shù)谋壤旌?，浸泡玻璃纖維，冷凍干燥。以PVC膠板作為載體，依次貼上加樣墊玻璃纖維、預(yù)浸泡金標(biāo)標(biāo)記物的凍干玻璃纖維、預(yù)包被抗原和抗體的NC膜、吸水紙，剪掉多余部分，用切條機(jī)切成所需寬度的條，此即為組裝好的金標(biāo)試紙條。對照試紙條將HBV、HCV、HIV、TP的各自試紙條，按照一般操作方式組裝成為普通的單項檢測條，作為本發(fā)明試劑盒的檢測對照。實施例5金標(biāo)試紙條的檢測將組裝好的本發(fā)明金標(biāo)試紙條，與普通的單項檢測條在相同條件下，同時檢測標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控標(biāo)本，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>備注-為陰性，+為弱陽性，++為中陽性，+++為強(qiáng)陽性。另外，取20份HBsAg陽性血清，以及20份陰性血清，用本發(fā)明的聯(lián)合篩選試劑盒，跟普通的HbsAg單項檢測條，兩種方法同時檢測對比，結(jié)果二者陰陽反應(yīng)一致，并且所有陽性血清靈敏度無明顯差異。本發(fā)明的聯(lián)合篩查試劑盒和HCV、TP、HIV普通的單項檢測條也采用上述類似的方法比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的聯(lián)合篩査試劑盒和普通的單項檢測條，其靈敏度基本符合。本發(fā)明的試劑盒可以簡單、方便的應(yīng)用于免疫檢測領(lǐng)域，具有方便、快捷的優(yōu)勢，可以節(jié)省檢測時間，提高效率，降低成本，節(jié)約人力物力，并且可以提早檢測HIVP24Ag抗原，縮短HIV檢測的窗口期。權(quán)利要求1.一種免疫層析試劑盒，其特征在于該試劑盒通過單次實驗即可實現(xiàn)HBsAg、anti-HCV、anti-HIV/HIVP24Ag、anti-TP的任意三到四項重大傳染病的同時篩查。2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫層析試劑盒，其特征在于通過單次實驗即可實現(xiàn)anti-HCV、anti-fflV/HIVP24Ag、anti-TP或者HBsAg、anti-HIV/HIVP24Ag、anti-TP或者HBsAg、anti-HCV、anti-TP或者HBsAg、anti-HCV、anti-HIV/HIVP24Ag的同時篩查。3.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫層析試劑盒，其特征在于通過單次實驗即可實現(xiàn)HBsAg、anti-HCV、anti-HIV/HIVP24Ag、anti-TP的同時篩查。4.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫層析試劑盒，其特征在于所用的標(biāo)記物包括膠體金屬、分散型染料和染料標(biāo)記的微球、乳膠。5.根據(jù)權(quán)利要求4的免疫層析試劑盒，其特征在于所述的膠體金屬為膠體金、膠體銀、膠體硒。6.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫層析試劑盒，其特征在于所采用的方式是所有檢測項目合成一個檢測線。7.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫層析試劑盒，其特征在于所采用的方式是每個檢測項目在同一產(chǎn)品的不同位置分開劃線。8.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫層析試劑盒，其特征在于所采用的方式是每個檢測項目在不同的支持物，分開布局。全文摘要一種通過單次實驗即可實現(xiàn)艾滋、乙肝、丙肝、梅毒這四種重大傳染病中的三到四項同時篩查的免疫層析試劑盒。將膠體金的顆粒直徑從普通的20～40nm提高到80～90nm，因此提高了金顆粒的靈敏度。包被方式為每個檢測項目分開，例如，所有檢測項目在同一NC膜上分開劃線，最后在同一個試紙條組裝。或者，包被方式為每個檢測項目分開，例如，每個檢測項目分開在不同的NC膜上劃線，每個項目分開布局組裝。再者，所有檢測項目的包被抗原/抗體混合，然后劃線，檢測線只有一條。可應(yīng)用于體檢、獻(xiàn)血、輸血、手術(shù)前的篩查等方面，可以節(jié)省檢測時間，提高效率，并且可以提早檢測HIVP24抗原，縮短HIV檢測的窗口期。文檔編號G01N33/571GK101373187SQ20081014201公開日2009年2月25日申請日期2008年8月25日優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日發(fā)明者何志強(qiáng),婧孫,孫興寶,鵬崔,菲曹,李泓彥,洋胡,鵬胡申請人:深圳市菲鵬生物股份有限公司