專利名稱：：用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。
背景技術(shù)：
：系統(tǒng)性紅斑狼疫(systemiclupuserythematosus,SLE)是一累及全身多個(gè)系統(tǒng)的自身免疫性疾病，自從糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑被用于治療SLE后，患者的預(yù)后雖已經(jīng)有明顯改善，但總的來說該病治療現(xiàn)狀仍不容過分樂觀，仍有約15%的患者在發(fā)病5年內(nèi)死亡或出現(xiàn)腎功能衰竭，同時(shí)復(fù)發(fā)也是治療過程中面臨著的一個(gè)嚴(yán)峻問題。SLE是自身免疫性疾病的原型，臨床上可累及多種臟器或系統(tǒng)。SLE組織損傷主要是由于免疫復(fù)合物沉積于相應(yīng)的組織而引起。臨床疾病譜很廣，具有緩解和惡化交替發(fā)生的特征。為了更好的治療和控制SLE，有必要及時(shí)而有效的判斷SLE的疾病活動(dòng)性和損傷情況。需要尋找一種能反應(yīng)疾病當(dāng)時(shí)的活動(dòng)情況的生物標(biāo)志物，這種標(biāo)志,物還應(yīng)該具有疾病特異性，對(duì)治療后的變化敏感，能預(yù)測疾病的轉(zhuǎn)歸。單一的標(biāo)志物可能不能滿足所有這些要求，因此需要聯(lián)合使用不同標(biāo)志物用于監(jiān)測疾病發(fā)生過程中的不同分子事件。人類血清中存在數(shù)千種多肽，它們當(dāng)中的絕大多數(shù)被認(rèn)為是由內(nèi)源性蛋白降解酶部分分解較大分子量蛋白質(zhì)所得的片段，這些多肽確切的性質(zhì)還沒有被解析。但是，研究表明這些多肽所組成的復(fù)雜的集合(肽組學(xué))能夠作為一種新穎和成熟的預(yù)測方法來判斷整個(gè)機(jī)體的生物學(xué)事件。一旦紅斑狼瘡臨床癥狀出現(xiàn)后，對(duì)SLE做出迅速診斷和適當(dāng)治療仍然是內(nèi)科醫(yī)生的巨大挑戰(zhàn)。因此，需要尋找新的具有更高敏感性和特異性的狼瘡診斷標(biāo)志物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，其可以高靈敏度、特意性檢測出系統(tǒng)性紅斑狼瘡。本發(fā)明采用一種新的技術(shù)平臺(tái)(Clinprot)，該平臺(tái)使用了以反向磁珠為基礎(chǔ)的樣品處理和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0FMS)分析。首先根據(jù)SLEDAI-2000評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)把系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病人分為活動(dòng)期和穩(wěn)定期兩組，并選取類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組，收集血液、準(zhǔn)備血清，以反向磁珠為基礎(chǔ)進(jìn)行樣品處理，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析儀進(jìn)行MALDI-T0FMS檢測，得到數(shù)據(jù)后用Cli叩rotoolsSoftware2.1軟件進(jìn)行分析，建立四組樣本的血清蛋白指紋圖譜，分析并篩選到差異性多肽，利用差異性多肽建立并驗(yàn)證疾病相關(guān)的高敏感性和高特異性的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。根據(jù)各蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比m/z及其蛋白質(zhì)波峰強(qiáng)度系數(shù)Arb.U建立了系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及正常人間鑒別的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，所說的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和波峰強(qiáng)度系數(shù)Arb.U分別為m/z二3192.34，Arb.U《8.47;m/z=9289.29，Arb.U《15.56;m/z=4267.96,Arb.U《1.91;m/z二2952.17，Arb.U《13.47;m/z=2660.7，Arb.U》33.04;m/z=3263,03，Arb.U《15.52;m/z=1778.75，Arb.U》1.93;m/z二5904.74，Arb.U《66.26;其中系統(tǒng)性紅斑狼疫患者與正常人鑒別的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型由m/z=3192.34，Arb.U《8.47;m/z=9289.29，Arb.U《15.56;m/z=4267.96，Arb.U《1.91;m/z二2952.17，Arb.U《13.47繪制而成;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者與正常人鑒別的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型由m/z=2660.7，Arb.U>33.04;m/z=3263.03，Arb.U《15.52;m/z二1778.75，Arb.U>1.93;m/z=5904.74，Arb.U《66.26繪制而成。所述軟件為Cli叩rotoolsSoftware2.1。其鑒別系統(tǒng)性紅斑狼瘡與正常人的識(shí)別率為92.36%，預(yù)測能力為90.27%;其鑒別類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與正常人的識(shí)別率為100%，預(yù)測能力為87.88%。利用該蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，可用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷，對(duì)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床診斷及病情了解具有重要的意義，并為從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度探討SLE的發(fā)病機(jī)制及早期診斷提供新思路和新依據(jù)。本發(fā)明采用的Clinprot技術(shù)平臺(tái)使用了以反向磁珠為基礎(chǔ)的樣品處理和MALDI-TOFMS分析，磁珠捕獲待分析物比芯片表面捕獲更靈敏，因?yàn)榍蛐挝⒘＞哂懈蟮慕Y(jié)合表面，因此比小直徑的芯片的結(jié)合容積更大。它能夠同時(shí)檢測血清中的大量多肽。這種技術(shù)平臺(tái)具有高敏感性和分辨率，它能夠在一滴血清中檢測到分子量范圍為800-15000Da的超過400多種多肽，用此方法建立的用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型具有高靈敏性和特意性。自動(dòng)化液體處理機(jī)械臂的應(yīng)用保證了這種技術(shù)的高通量和重復(fù)性。圖l是本發(fā)明技術(shù)路線圖。具體實(shí)施方式1材料1.1主要儀器"紅蓋"真空采血管有限公司Z4M條碼打印機(jī)GenesisFreedom100液體機(jī)械臂自動(dòng)化用槍頭長磁體(2.75X0.25X0.125英寸)圓盤磁體(直徑0.25英寸，厚度0.25英寸)定制分裝管架定制側(cè)向磁架定制底部磁架模板IIIPCR非裙邊板廣州陽普醫(yī)療用品Zebra技術(shù)公司丁ec肌公司丁6can公司K&D磁性材料公司Forcefield公司USA科學(xué)公司模板mpcr半裙邊板振蕩器PCR冷卻器起始裝置AutoflexMALDI-T0F質(zhì)譜儀Bruker384-點(diǎn)MALDI耙板Gemini軟件FlexControl軟件FlexAnalysis軟件1.2主要試劑a-氰_4-羥基苯丙烯酸多肽內(nèi)標(biāo)及蛋白內(nèi)標(biāo)人工合成多肽3897細(xì)胞色素CDynabeadsWCX乙氰三氟乙酸(TFA)人血清Milli-Q水系統(tǒng)10XPBS異丙醇USA科學(xué)公司Barnstead/Thermolyne公司USA科學(xué)公司Bruker公司Bruker公司丁ec肌公司Bruker公司Bruker公司Agilent公司Bruker公司Sigma公百JSigma公司Dyrml公司Burdick&Jachkson公司Piere公司Sigma公司USFilter公司Bio-Rad公司J.T.Baker公司1.3樣本系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SystemicLupusErythematosus，SLE)患者50例，均為女性，年齡1454歲(中位年齡35歲)，均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ARA)1982年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)SLEDAI-2000評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)把SLE病人分為活動(dòng)期(SLEDAI>8)和穩(wěn)定期(SLEDA工《8)兩組，所有病例均在增加糖皮質(zhì)激素用量或加用環(huán)磷酰胺之前取血。另外，選擇25例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis,RA)患者，均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇性別和年齡相配的健康志愿者24名作為對(duì)照組。2操作步驟2.1收集血液和準(zhǔn)備血清收集靜脈血到真空采血管。緩慢顛倒采血管5次，使促凝劑與血液充分混合，室溫條件下垂直放置采血管1小時(shí)使血液凝固。冰上放置采血管，2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行下一步。室溫條件下，2000g，離心10分鐘。EP管貼上與樣品對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽。用移液器將上層血清轉(zhuǎn)移到已貼好標(biāo)簽的EP管，每管lml，這種裝好血清的EP管就是"血清樣品來源管"。立即將所有血清樣品保存在-80。C，避免反復(fù)凍融。血清樣品需放置干冰上運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)室。2.2為血清樣品來源管編碼將所有樣品信息輸入到實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)。每次提交樣品信息時(shí)，原始樣品管的條形碼標(biāo)簽將自動(dòng)生成。將樣品與標(biāo)簽一樣排序以使后續(xù)處理更容易。在給樣品管貼標(biāo)簽的同時(shí)生成并確認(rèn)樣品管清單。在給樣品管貼標(biāo)簽時(shí)需將樣品管放置于干冰上，貼標(biāo)簽前需將樣品管用紙巾擦干以保證貼緊。用盒子裝好已經(jīng)貼好標(biāo)簽的樣品管，在盒子外標(biāo)記好課題名稱、日期及"待分裝樣品管"字樣，然后放置于-8(TC冰箱。2.3分裝樣品將裝有待分裝樣品管的盒子拿出冰箱，放置樣品管于干冰上。掃描第一個(gè)待分裝樣品管上的條形碼。如果數(shù)據(jù)庫能正確識(shí)別樣品，那么一個(gè)"樣本身份"將會(huì)生成。選擇樣品管中的血清體積及每管待分裝的體積，計(jì)算出分裝管數(shù)，打印所有分裝管的新標(biāo)簽。將分裝條形碼標(biāo)簽貼到干凈的0.5mlEP管上，按照原始樣品管的次序排列分裝管。將這些分裝管直接放到Tecan液體操作器的分裝架上，排成16列，每列9管。在所有的分裝管貼好標(biāo)簽并排列和確認(rèn)好后，將樣品管放置于濕冰上，按照它們將被分裝的順序放置在大冰盒上融解60min。將鋁制的分裝架放置在自動(dòng)化機(jī)器載體上，樣品管按照分裝管的次序也置于架上。分裝過程開始前應(yīng)把樣品管架放置于濕冰上。打開桌面電腦上的Gemini程序，運(yùn)行Gemini分裝程序自動(dòng)進(jìn)行分裝過程。蓋上分裝管，將它們放置到干冰上，每個(gè)樣本僅取一分裝管做下一步分析，其余的放置在-8(TC冰箱。將待分析分裝管單獨(dú)放置在一個(gè)盒子里并貼好標(biāo)簽。2.4血清樣品隨機(jī)化排序掃描待分析分裝管的條形碼，建立一個(gè)清單，以普通文本文檔格式保存這個(gè)清單。分裝管應(yīng)一直放置于干冰上。運(yùn)行隨機(jī)化軟件，輸入待分析樣品的數(shù)目，每個(gè)MALDI靶一次最多能分析96份分裝血清，如果添加了更多份的血清，程序?qū)⑸蓛蓚€(gè)或者更多的MALDI靶板排序。按下"開始"按鈕，程序會(huì)要求選擇文件(剛剛建立的那個(gè)普通文本文檔)，一旦你選擇這個(gè)文件后，樣品在MALDI靶上的隨機(jī)分布位置即會(huì)顯示出來，另外，還有內(nèi)標(biāo)的位置也會(huì)顯示出來。隨機(jī)化軟件生成的排序并不代表96孔板中血清樣品在做磁珠分選前的位置。隨后，程序會(huì)詢問保存輸出文件(自動(dòng)實(shí)施文件)的目錄，輸出文件包含有使FlexControl程序運(yùn)行自動(dòng)質(zhì)譜分析的指令。需要打印這些靶圖，因?yàn)樗鼈儗⒃谝逊盅b血清的隨機(jī)化排序中需要。按照靶圖中顯示的次序，將已分裝血清放置在已經(jīng)預(yù)冷的96孔板。時(shí)刻要核對(duì)樣品清單和靶圖以確認(rèn)清單中的樣品、靶圖中的信息和分裝管的標(biāo)示是一致的。分裝管應(yīng)一直放置于干冰上。將輸出文件傳輸?shù)組ALDI-TOF電腦中。2.5建立自動(dòng)化處理程序首先，需要確認(rèn)以下幾項(xiàng)所有待測樣品都已經(jīng)隨機(jī)化的放置于96孔板，檢査2次以確認(rèn)每個(gè)樣品都在正確位置，然后將它們放至U-80°C冰箱；所有所需的試劑和材料都已經(jīng)準(zhǔn)備就緒。自動(dòng)化處理程序的建立選擇在早上進(jìn)行，清洗Tecan液體機(jī)械臂，給機(jī)器要使用的水抽氣，保證垃圾容器有足夠大的空間來接受分析過程中產(chǎn)生的丟棄物，確認(rèn)自動(dòng)吸頭是干凈的。刷新系統(tǒng)兩次。進(jìn)行質(zhì)控試驗(yàn)(具體詳見下文)。開始解凍樣品，置于濕冰上60min，保證樣品在塑料架中的擺放次序。320ul的磁珠用200ul去離子水各洗滌兩次，然后用320u1去離子水重懸，以清除磁珠儲(chǔ)存液中的乙醇。在振蕩器中輕柔的混勻磁珠約5min直到磁珠徹底分散，將磁珠吸到0.2ml薄壁八孔條，每孔40ul，然后放到機(jī)器臺(tái)面的適當(dāng)位置。將新鮮配制的0.1%的TFA加入到TFA槽。開始準(zhǔn)備內(nèi)標(biāo)，詳見表l，內(nèi)標(biāo)必須當(dāng)天配制。準(zhǔn)備一個(gè)96孔半邊裙板，第一列每孔加入75u150%的乙氰，第二列每孔加入95ti1的基質(zhì)溶液。第三列A排孔加入65u1"mastermix"內(nèi)標(biāo)，第三列B排孔加入70til基質(zhì)溶液。將上面準(zhǔn)備96孔半邊裙板放置到冷卻架并系好，冷卻架需在-20°C預(yù)冷幾個(gè)小時(shí)才能使用。將MALDI耙放到預(yù)定位置。表1內(nèi)標(biāo)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>SAUtNm/zsir;calculatedforsmgle-chsrgeclimisexceptwhaioth^ivdse汰化indicated.2.6頭半部分樣品處理將每一樣品50u1加入到一個(gè)無裙邊96孔板的左側(cè)48孔的適當(dāng)位置，檢査樣品相應(yīng)的隨機(jī)化位置以確認(rèn)。將該％孔板放置到機(jī)器臺(tái)面的相應(yīng)位置。刷新系統(tǒng)一次，再一次檢査是否已經(jīng)準(zhǔn)備就緒。運(yùn)行Tecan程序以執(zhí)行以下操作用槍反復(fù)吹打10次混勻八孔條內(nèi)的磁珠。每個(gè)自動(dòng)槍頭吸取40u1八孔條內(nèi)的磁珠。丟棄5ul以避免在磁珠與血清混合時(shí)，槍頭中含有氣泡。在含有樣品的48孔中，每孔加入5til磁珠。緩慢吹打5次以混合磁珠和血清。將96孔板轉(zhuǎn)移到側(cè)向磁架以便將磁珠吸附到側(cè)壁。吸走并丟棄上清。每樣品孔中加入200iil0.P/q的TFA溶液。前后移動(dòng)96孔板，洗滌磁珠。吸走并丟棄洗液。重復(fù)洗滌一次。第二次洗滌后，緩慢吸取并丟棄80yl洗液。將板轉(zhuǎn)移到原先位置。■用槍上下吹打5次，將磁珠重懸在剩余的洗液中。將96孔板轉(zhuǎn)移到底部磁架上，等待160s，使磁珠被吸附到管底。非常小心地吸走并丟棄剩余的洗液。每樣品孔中加入6ul50%的乙氰。快速上下吹打10次以重懸磁珠。將板轉(zhuǎn)移到側(cè)向磁架。轉(zhuǎn)移每樣品孔中5u1洗脫液到96孔板右側(cè)的48個(gè)孔中。在右側(cè)的48個(gè)孔中加入10u1預(yù)制好的基質(zhì)溶液。吹打混合基質(zhì)與洗脫液。吸取1ii1混合液并將其點(diǎn)到MALDI耙上。將在冷卻架上放置的微孔板中的內(nèi)標(biāo)液和基質(zhì)液1:1混合，上下吹打5次。吸取90"1混合物，在另一非裙邊96孔板的A列的每孔中加入10ul。吸取8ti1，在每個(gè)MALDI靶的內(nèi)標(biāo)點(diǎn)加1P1。每個(gè)內(nèi)標(biāo)點(diǎn)上的混合物雖然是相同的，但是它們?cè)诎疑系奈恢貌煌?.7后半部分樣品處理準(zhǔn)備下一批分析的48份血清。開始解凍樣品，置于濕冰上60min，保證樣品在塑料架中的擺放次序。將血清加入一個(gè)新的無裙邊96孔板，置于濕冰上。從側(cè)向磁架上移去及丟棄第一批分析結(jié)束后帶有血清和磁珠的微孔板。余下步驟與第一批樣品分析的過程相同。打開Gemini程序，選擇384點(diǎn)MALDI耙的第二半部分的點(diǎn)樣次序。檢查錯(cuò)誤后，刷新系統(tǒng)兩次，運(yùn)行程序，程序?qū)?huì)執(zhí)行完全相同的步驟，唯一不同的是洗脫物和基質(zhì)的混合物這次被點(diǎn)在384點(diǎn)MALDI耙的第二半部分。移去MALDI靶板，將其轉(zhuǎn)移到MALDI-TOF質(zhì)譜分析儀，耙板必須在3-4小時(shí)內(nèi)讀出結(jié)果。2.8質(zhì)譜分析和圖譜輸出將待分析的靶板插入到MALDI-TOF質(zhì)譜分析儀。打開正確的自動(dòng)執(zhí)行文件，開始自動(dòng)運(yùn)行以下步驟("自動(dòng)執(zhí)行方法"必須更新才能使用合適的激光能源)轉(zhuǎn)移到MALDI板的第一個(gè)耙點(diǎn)。開始收集0.7-4kDam/z范圍內(nèi)片段的肽譜平均發(fā)射400次激光，分四組對(duì)準(zhǔn)基質(zhì)點(diǎn)表面四個(gè)不同的位置，每組發(fā)射100次，頻率為50Hz。圖譜在線性模式幾何學(xué)的狀態(tài)下獲得，20kv下離子加速(延時(shí)引出電壓為18.6kv)，倍增管電壓為-1.3kv，設(shè)置離子?xùn)艦閙/s=400。延時(shí)引出時(shí)間保持在80ns，這樣在每次發(fā)射激光后有適當(dāng)?shù)臅r(shí)間延遲能量聚焦。傳送到靶上的有效激光能量控制在每次發(fā)射16uJ(±10%)(下同)。整個(gè)照射程序由儀器的"自動(dòng)運(yùn)行"功能按照以下步驟自動(dòng)控制在優(yōu)化的儀器設(shè)置下采用正確的圖譜采集方法，找到MALDI板上的正確耙點(diǎn)，輸送4組(每組100次)激光發(fā)射(從一組螺旋運(yùn)動(dòng)到下一組)。移動(dòng)到下一靶點(diǎn)，采集0.7-4kDam/z范圍內(nèi)的肽譜。然后繼續(xù)采集所有(包括樣品和內(nèi)標(biāo))此質(zhì)量范圍內(nèi)的圖譜。再次轉(zhuǎn)移到MALDI板的第一個(gè)靶點(diǎn)。開始收集4-15kDam/z范圍內(nèi)片段的第一個(gè)肽譜平均發(fā)射500次激光，分五組對(duì)準(zhǔn)基質(zhì)點(diǎn)表面五個(gè)不同的位置，每組發(fā)射100次，頻率為50Hz。圖譜在線性模式幾何學(xué)的狀態(tài)下獲得，20kv下離子加速(延時(shí)引出電壓為18.6kv)，倍增管電壓為-1.3kv，設(shè)置離子?xùn)艦閙/s=3000。延時(shí)引出時(shí)間保持在50ns，這樣在每次發(fā)射激光后有適當(dāng)?shù)臅r(shí)間延遲能量聚焦。在第二個(gè)質(zhì)量范圍(4-15kDa)的最初100次激光發(fā)射會(huì)被傳送到與第一個(gè)質(zhì)量范圍(4-15kDa)的最初100次激光發(fā)射相同的區(qū)域，因?yàn)閷?duì)于每一個(gè)MALDI耙點(diǎn)來說，自動(dòng)運(yùn)行功能會(huì)記住一個(gè)初始位置。因此，在第二個(gè)質(zhì)量范圍(4-15kDa)需要額外的100次激光發(fā)射，原因是初始位置不存在晶體。移動(dòng)到下一耙點(diǎn)，采集4-15kDam/z范圍內(nèi)的肽譜。然后繼續(xù)采集所有(包括樣品和內(nèi)標(biāo))此質(zhì)量范圍內(nèi)的圖譜。分析結(jié)束后打開FlexAnalysis程序，使用"打開多個(gè)圖譜"功能打開剛剛已經(jīng)被建立的所有質(zhì)譜圖，檢査是否所有的質(zhì)譜已經(jīng)生成。通過FlexAnalysis的"處理"功能進(jìn)行圖譜分析。另外，也可將圖譜轉(zhuǎn)換成標(biāo)簽分隔的文本文檔，這樣，每個(gè)圖譜含有x和y兩個(gè)變量。2.9質(zhì)量控制每周進(jìn)行一次質(zhì)量控制試驗(yàn)以評(píng)估Tecan液體機(jī)械臂和AutoFlexMALDI-T0F質(zhì)譜儀的重復(fù)性。使用市場購買的人類血清，每次質(zhì)量控制分析用2管即可，保證96孔板中的10個(gè)孔有足夠的樣品，其余的孔用PBS充填。血清樣品在微孔板上的分布要均勻和分散。質(zhì)控分析步驟如下在濕冰上解凍血清1小時(shí)。同時(shí)，準(zhǔn)備Tecan自動(dòng)化儀器及試驗(yàn)所用試劑。運(yùn)行Gemini程序(與臨床樣本測試相同)。移去靶板，轉(zhuǎn)移到MALD工-TOF質(zhì)譜儀。插入待分析的靶板，選擇方法文件"serum—l-4kda.par"。檢査并記錄MS激光的狀態(tài)，打開"狀態(tài)標(biāo)簽"，點(diǎn)擊"詳細(xì)"，檢查激光的狀態(tài)并調(diào)整激光能量到16uJ。打開質(zhì)量控制自動(dòng)實(shí)施模板，編輯此文件，改變?nèi)掌诩氨４鎴D譜的目標(biāo)文件夾。編輯后，保存在質(zhì)量控制自動(dòng)實(shí)施文件目錄。在FlexControl程序中打開編輯后的自動(dòng)實(shí)施文件并運(yùn)行它。運(yùn)行完畢后打開FlexAnalysis程序，使用"打開多個(gè)圖譜"功能打開剛剛已經(jīng)被建立的所有質(zhì)控質(zhì)譜圖。疊放這10張質(zhì)譜圖，另外，分別放大942.43，1，211.70，1,449.76和1，864.95這四個(gè)肽峰區(qū)域，分別測量10副圖譜中的這四個(gè)峰的強(qiáng)度。每一個(gè)峰的平均強(qiáng)度的變異應(yīng)該不大于20-30%。2.10統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)分析工作使用Cli叩rotoolsSoftware2.1。Cli叩rotools中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法(參數(shù)T-Test和非參數(shù)方法WilcoxonTest)尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN(k-nearestneighboure，k=l，3，5,7)建立分類預(yù)測模型。首先使用遺傳算法，設(shè)變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個(gè)數(shù)為1000，適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率，最終經(jīng)過10000次進(jìn)化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用其中差異性多肽，建立模型。計(jì)算模型的特異性、敏感性及^均準(zhǔn)確率。用隨機(jī)抽樣方法(隨機(jī)選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗(yàn)證樣本，運(yùn)行十次)，驗(yàn)證模型的有效性。實(shí)施例l鑒別系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康人^C集靜脈血液和準(zhǔn)備血清，按照上述步驟得到其血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與正常人鑒別的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，若受檢者m/z二3192.34，Arb.U《8.47;且m/z二9289.29，Arb.U《15.56;且m/z二4267.96，Arb.U《1.91;且m/z二2952.17，Arb.U《13.47，診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者。實(shí)施例2鑒別類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者和健康人收集靜脈血液和準(zhǔn)備血清，按照上述步驟得到其血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者與正常人鑒別的蛋白質(zhì)指紋圖譜，若受檢者m/z=2660.7，Arb.U^33.04;且m/z二3263.03，ArbH52;且m/z=1778.75，Arb.U》1.93;且m/z二5904.74,Arb.U《66.26，診斷為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。權(quán)利要求1、用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，其特征在于由基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析儀系統(tǒng)檢測的血清蛋白質(zhì)波譜經(jīng)過軟件統(tǒng)計(jì)分析得到的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者多個(gè)特異蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比m/z及其蛋白質(zhì)波峰強(qiáng)度系數(shù)Arb.U繪制而成，所說的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和波峰強(qiáng)度系數(shù)Arb.U分別為m/z＝3192.34，Arb.U≤8.47；m/z＝9289.29，Arb.U≤15.56；m/z＝4267.96，Arb.U≤1.91；m/z＝2952.17，Arb.U≤13.47；m/z＝2660.7，Arb.U≥33.04；m/z＝3263.03，Arb.U≤15.52；m/z＝1778.75，Arb.U≥1.93；m/z＝5904.74，Arb.U≤66.26；其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與正常人鑒別的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型由m/z＝3192.34，Arb.U≤8.47；m/z＝9289.29，Arb.U≤15.56；m/z＝4267.96，Arb.U≤1.91；m/z＝2952.17，Arb.U≤13.47繪制而成；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者與正常人鑒別的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型由m/z＝2660.7，Arb.U≥33.04；m/z＝3263.03，Arb.U≤15.52；m/z＝1778.75，Arb.U≥1.93；m/z＝5904.74，Arb.U≤66.26繪制而成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，其特征在于所述軟件為Cli叩rotoolsSoftware2.1。3、用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型的建立方法，包括以下步驟1)選取系統(tǒng)性紅斑狼瘡組、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組，收集血液、準(zhǔn)備血清；2)以反向磁珠為基礎(chǔ)進(jìn)行樣品處理；3)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析儀進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測；4)得到數(shù)據(jù)后用Cli叩rotoolsSoftware2.1軟件進(jìn)行分析，建立樣本的血清蛋白指紋圖譜，分析并篩選到差異性多肽，利用差異性多肽建立并驗(yàn)證疾病相關(guān)的高敏感性和高特異性的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，本發(fā)明采用一種新的技術(shù)平臺(tái)(Clinprot)，該平臺(tái)使用了以反向磁珠為基礎(chǔ)的樣品處理和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，得到數(shù)據(jù)后用ClinprotoolsSoftware2.1軟件進(jìn)行分析，建立樣本的血清蛋白指紋圖譜，分析并篩選到差異性多肽，利用差異性多肽建立并驗(yàn)證疾病相關(guān)的高敏感性和高特異性的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。利用該蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，可用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷，對(duì)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床診斷及病情了解具有重要的意義，并為從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度探討SLE的發(fā)病機(jī)制及早期診斷提供新思路和新依據(jù)。文檔編號(hào)G01N27/64GK101329302SQ20081014250公開日2008年12月24日申請(qǐng)日期2008年7月23日優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日發(fā)明者左紅梅,麗張,勇戴,胡成效申請(qǐng)人:勇戴