專利名稱：：一種中藥微粉細胞破壁率的測定方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種中藥微粉細胞破壁率的測定方法。技術背景中藥超微粉體是一種微米級新型中藥粉體，主要通過機械粉碎使中藥植物細胞壁破裂，促使有效成分快速釋放。中藥的有效成分主要存在于細胞內，在細胞完整無損的狀態(tài)下，有效成份只能透過細胞壁及細胞膜釋放被利用，當細胞壁(或膜)內外濃度達到平衡時，有效成分不再透過細胞壁(或膜)而被利用。因此中藥有效成分的溶出及釋放不完全導致了利用不完全，最終造成中藥資源的浪費。采取超微粉碎技術，將細胞壁打破以使有效成份直接接觸溶媒，能加快有效成分的溶出速度，提高溶出率。細胞壁的破裂程度直接影響著有效成分的溶出，關系到藥效的發(fā)揮及臨床療效，因此，細胞破壁率常被認為是評價中藥微粉質量的重要指標之一。由于中藥的超微粉碎技術是一個中藥行業(yè)的新技術，很多技術關鍵有待深入研究，關于中藥細胞破壁率測定的方法研究至今未見報道。中藥材中絕大多數品種來源于植物，植物藥材是由多種功能的植物細胞組成，關于植物藥材細胞破壁率的研究不多，品種僅限于花粉與孢子類中藥，方法主要是電鏡掃描和血球計數板法，且未設定統(tǒng)一標準。中藥超微粉體細胞破壁率是其產品質量評價體系中一個關鍵參數，為保證超微粉體的質量，應建立中藥超微粉體的細胞破壁率測定標準。
發(fā)明內容為克服上述缺陷，本發(fā)明對中藥超微粉體細胞破壁率的測定進行了大量研究工作，建立了中藥超微粉體細胞破壁率的測定方法。本發(fā)明提供了一種中藥微粉細胞破壁率的測定方法，應用顯微觀測計數法，測定中藥微粉的細胞破壁率；根據中藥不同入藥部位選擇適宜的細胞類型，即特征細胞作為測定觀測對象；選擇原則為有規(guī)則的細胞形狀，易于觀察與計數；細胞壁較厚，比較堅韌難破，對其種類有代表性。上述中藥微粉細胞破壁率的測定方法根據不同入藥部位種類中藥，選擇觀測的細胞如下根及根莖類首選木栓細胞，次選薄壁細胞，或選石細胞；皮類木栓細胞；花類花粉粒；葉類表皮細胞；果實類首選果皮細胞，次選表皮細胞，或選石細胞。上述中藥微粉細胞破壁率的測定方法，具體實施包括以下步驟1)取中藥樣品干燥，按常規(guī)方法制備中藥細粉和微粉；2)在0.051.5g范圍內稱取5-8個不同重量的步驟l)所述細粉，均勻分散于溶媒中，按顯微觀測計數法觀察細粉中完整的特征細胞為顯微計數物，并進行線性回歸，繪制標準曲線，得回歸曲線方程，反復進行此步驟至回歸曲線方程中相關系數r大于0.9，再進行下一步；3)分別按照步驟2)所述方法稱取步驟1)所述微粉和細粉，按顯微觀測計數法觀察其中完整的特征細胞為顯微計數物，按下列公式計算細粉和微粉的顯微特征細胞個數XV中藥粉體顯微特征細胞個數<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中，X為每個視野內的特征細胞數，V為藥液總體積，V'為蓋玻片下藥液體積，W為樣品稱取量；4)根據樣品細粉和微粉的顯微特征細胞個數，按下列公式計算細胞破壁率:Y=(A-B)/Axl00%，其中，Y為細胞破壁率，A為細粉顯微特征細胞個數，B為微粉的顯微特征細胞個數。上述步驟l)所述中藥樣品干燥為水分低于6%;所述常規(guī)方法制備中藥細粉和微粉是將中藥樣品粉碎成80-100目的細粉，再將細粉進行超微粉碎至過300目的微粉。上述溶媒為水合氯醛或稀甘油。植物中藥的組織結構除了草酸鈣晶體、淀粉粒、菊糖、油滴等后含物外，它們主要有許多來源相同、形態(tài)機構相似、機能相同而又互相聯系的細胞組成的細胞群，如薄壁組織中的薄壁細胞、木栓組織中的木栓細胞、韌皮部的韌皮纖維、木質部的木纖維等；另外，還有導管、管胞、篩管等輸導組織及散在的石細胞、花粉粒等。在選擇適宜的細胞破壁率評價指標時，由于微粉中的纖維、導管等長條形的細胞均已被截斷，所以不宜作為具有代表性的細胞來進行評價。薄壁細胞由于壁薄，通常簡單的機械力量即可將其破碎，因此僅在微粉顯微觀測中沒有其它特征細胞可供選擇時選用。木栓細胞在根及根莖、皮類中藥中大量存在，其細胞壁稍厚，有規(guī)則的形狀，有代表性，易于觀察，適宜作為這幾類中藥微粉細胞破壁率測定的特征細胞。花粉粒壁堅實，內含豐富營養(yǎng)，單個散在，有規(guī)則的性狀，這些都使其成為花類中藥細胞破壁率測定的評價指標。表皮細胞在葉類、果實類中藥中大量存在，均勻規(guī)則，壁堅韌，難以破裂，宜于作為測定該類中藥細胞破壁率的評價指標。不同類別的中藥粉末具有不同的顯微特征，通過對稀甘油、水合氯醛等分散溶媒的對比分析，宜通過試驗選擇不同的分散溶媒來進行處理，在目鏡10x，物鏡10x的顯微鏡下觀察，方可拍攝較為清晰的顯微圖像，便于觀察計數，確保結果的準確性。影響細胞破壁率檢測精確度的主要因素是回歸方程的精確性和未破壁細胞計數的精確性。對于回歸方程，由于稱樣量的誤差可以忽略，每個計數單位內細胞平均數的精確性是最主要的影響因素。通過直觀分析法得出，混懸液濃度為主要因素，觀察倍數和展開面積次之，因此宜選擇最佳混懸液濃度。超微粉碎工藝對于不同質地的中藥，粉碎效果不同；關于細胞破壁率與粒徑的相關性均有待深入研究。本發(fā)明首次對中藥微粉細胞破壁率進行測定，以中藥粉體完整的細胞作為特征計數物，采用細胞計數法考察超微粉碎對中藥細胞破壁率的影響。方法學研究結果表明，采用細胞計數法考察中藥粉體細胞破壁率，方法穩(wěn)定，操作簡便。該法對于測定中藥粉末的細胞破壁率具有借鑒作用，也為中藥超微粉體的質量研究及評價提供了細胞破壁率測定的新思路。圖l:蒼術細粉標準回歸曲線；圖2:番瀉葉細粉標準回歸曲線；圖3:金銀花細粉標準回歸曲線。具體實施方式收集多種中藥材，經鑒定符合《中國藥典》2005年版一部有關規(guī)定。FF1-15型柴日式粉碎機(湖南雪峰機械廠)，BFM-T6BI型振動研磨混煉機(濟南貝利公司)，微量吸管，WINNER99顯微顆粒圖像分析儀(包括三目顯微鏡、CCD圖像采集系統(tǒng)、計算機圖像處理軟件)。所有試劑為分析純。實施例1蒼術微粉的細胞破壁率測定根及根莖類中藥材的粉末顯微特征可見導管、木栓細胞、厚壁細胞、分泌組織等，其后含物菊糖、草酸鈣簇晶等不在選擇之內。研究以蒼術為例，說明根及根莖類中藥微粉的細胞破壁率測定方法的建立。蒼術微粉的細胞破壁率測定宜選擇木栓細胞作為檢測指標，進行其細胞破壁率的測定。分別精密稱取O.1133g、0.2142g、0.3414g、0.4621g、0.5014g、0.6735g、0.7073g、0.8249g細粉，分別置于25mL容量瓶中，加水合氯醛適量，超聲處理5分鐘，使粉末分散均勻，定容至刻度。精密吸取藥液30uL，裝片(裝片時，使混懸液布滿整個玻片，不溢出，無氣泡為度)，分別置WINNER99顯微圖像分析儀下觀察。要考察蒼術細粉的細胞破壁率，主要是測定其木栓石細胞的破壁率，對其進行計數(以一個視野為一個計數單位的平均值)，結果見表l表l不同稱樣量中完整木栓石細胞的個數(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以細粉的稱樣量為橫坐標，每個計數中完整的木栓石細胞平均數為縱坐標，繪制標準曲線(附圖1)，得到回歸曲線方程Y=5.0517X+3.4246，r=0.9977，說明蒼術細粉中完整的木栓細胞在0.H330.8249g范圍內線性關系良好，可用來作為顯微特征計數。分別取蒼術細粉與微粉，精密稱定，照前述方法制片，于顯微鏡(XIOO)下觀察，分別觀察25個視野，根據兩者完整木栓石細胞個數、混懸液體積、稱樣量，按下列公式計算蒼術細粉和微粉的顯微特征個數蒼術粉末顯微特征個數/mg-XV/V'W,式中X為每個蓋玻片下的特征數；V為樣品混懸液總體積(mL);V'為蓋玻片下混懸液體積(mL);W為樣品稱取量(mg)。再根據蒼術細粉和微粉的顯微特征個數，按下列公式計算細胞破壁率Y=(A—B)/AX100%Y:細胞破壁率A:蒼術細粉顯微特征個數；B:蒼術微粉的顯微特征個數。各項參數見表2。表2蒼術粉末顯微特征(木栓細胞)個數計算的相關參數(n=25)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結論超微粉碎可使蒼術的細胞破壁率達到90.1%。實施例2番瀉葉微粉的細胞破壁率測定葉肉組織和氣孔是葉類藥材的主要標志。顯微觀察時可見表皮細胞、氣孔、毛茸、非腺毛、石細胞、晶體等。研究以番瀉葉為例，說明葉類中藥微粉的細胞破壁率測定方法的建立。番瀉葉微粉宜選擇表皮細胞作為檢測指標，進行其細胞破壁率的測定。分別精密稱取0.1323、0.2478、0.3174、0.4527、0.5277、0.6052、0.7246、0.8144g細粉，分別置于25mL容量瓶中，加水合氯醛適量，超聲處理5分鐘，使粉末分散均勻，定容至刻度。精密吸取藥液30uL，裝片(裝片時，使混懸液布滿整個玻片，不溢出，無氣泡為度)，分別置WINNER99顯微圖像分析儀下觀察。要考察番瀉葉細粉的細胞破壁率，主要是測定其表皮細胞的破壁率，對其進行計數(以一個視野為一個計數單位的平均值)，結果見表3.表3不同稱樣量中完整表皮細胞的個數(n=8)稱樣量(g)0.13230.24780.31740.45270.5277細胞個數22.82424.82626.6稱樣量(g)0,60520.72460.8144細胞個數27.628.429.9以細粉的稱樣量為橫坐標，每個計數中完整的表皮細胞平均數為縱坐標，繪制標準曲線(附圖2)，得到回歸曲線方程Y=9.9525X+21.508，r2=0.9940，說明番瀉葉細粉中完整表皮細胞在0.13230.8144g范圍內線性關系良好，可用來作為顯微特征計數。分別取番瀉葉細粉與微粉，精密稱定，照前述方法制片，，于顯微鏡(X100)下觀察，分別觀察25個視野，根據兩者完整表皮細胞個數、混懸液體積、稱樣量，按下列公式計算番瀉葉細粉和微粉的顯微特征個數番瀉葉粉末顯微特征個數/mg:XV/V'W，式中X為每個蓋玻片下的特征數；V為樣品混懸液總體積(mL);V'為蓋玻片下混懸液體積(mL);W為樣品稱取量(mg)。再根據番瀉葉細粉和微粉的顯微特征個數，按下列公式計算細胞破壁率Y=(A—B)/AX100%,Y:細胞破壁率A:番瀉葉細粉顯微特征個數；B:番瀉葉微粉的顯微特征個數。各項參數見表4表4番瀉葉粉末顯微特征(表皮細胞)個數計算的相關參數(n=25)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結論超微粉碎可使番瀉葉的細胞破壁率達到93%。實施例3金銀花微粉的細胞破壁率測定花類藥材顯微觀測可見花粉粒、花粉囊內壁細胞、毛茸、柱頭表皮細胞，其附屬物草酸鈣簇晶等不在選擇之內。研究以金銀花為例，說明花類中藥微粉的細胞破壁率測定方法的建立。金銀花微粉宜選擇花粉粒作為檢測指標，進行其細胞破壁率的測定。分別精密稱取0.1291、0.2247、0.3015、0.4461、0.5375、0.6713、0.7583、0.8195g細粉，分別置于25mL容量瓶中，加水合氯醛適量，超聲處理5分鐘，使粉末分散均勻，定容至刻度。精密吸取藥液30uL，裝片(裝片時，使混懸液布滿整個玻片，不溢出，無氣泡為度)，分別置WINNER99顯微圖像分析儀下觀察。考察金銀花微粉的細胞破壁率，主要是測定其花粉粒的破壁率，對其進行計數(以一個視野為一個計數單位的平均值)，結果見表5.表5不同稱樣量中完整花粉粒的個數(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以細粉的稱樣量為橫坐標，每個計數中完整的花粉粒平均數為縱坐標，繪制標準曲線(附圖3)，得到回歸曲線方程Y-13.891X+10.624,F0.9961，說明金銀花細粉中完整花粉粒在0.12910.8195g范圍內線性關系良好，可用來作為顯微特征計數。分別取金銀花細粉與微粉，精密稱定，照前述方法制片，于顯微鏡于顯微鏡(X100)下觀察下，分別觀察25個視野，根據兩者完整花粉粒個數、混懸液體積、稱樣量，按下列公式計算金銀花細粉和微粉的顯微特征個數金銀花粉末顯微特征個數/mg:XV/V'W，式中X為每個蓋玻片下的特征數；V為樣品混懸液總體積(mL);V'為蓋玻片下混懸液體積(mL);W為樣品稱取量(mg)。再根據金銀花細粉和微粉的顯微特征個數，按下列公式計算細胞破壁率Y=(A—B)/AX100%,Y:細胞破壁率A:金銀花細粉顯微特征個數；B:金銀花微粉的顯微特征個數。各項參數見表6.表6金銀花粉末顯微特征(花粉粒)個數計算的相關參數(n=25)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結論超微粉碎可使金銀花的細胞破壁率達到94%。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結果表明，樣品的取樣量與完整的特征細胞數均呈線性關系，其線性相關系數r大于0.9，通過方法學考察證明其細胞破壁率測定方法簡便，穩(wěn)定與可靠。細胞破壁率多為90%左右。權利要求1、一種中藥微粉細胞破壁率的測定方法，其特征在于，應用顯微觀測計數法，測定中藥微粉的細胞破壁率；根據中藥不同入藥部位選擇適宜的細胞類型，即特征細胞作為測定觀測對象；選擇原則為有規(guī)則的細胞形狀，易于觀察與計數；細胞壁較厚，比較堅韌難破，對其種類有代表性。2、根據權利要求l所述的中藥微粉細胞破壁率的測定方法，其特征在于根據不同入藥部位種類中藥，選擇觀測的細胞如下根及根莖類首選木栓細胞，次選薄壁細胞，或選石細胞；皮類木栓細胞；花類花粉粒；葉類表皮細胞；果實類首選果皮細胞，次選表皮細胞，或選石細胞。3、根據權利要求2所述的中藥微粉細胞破壁率的測定方法，其特征在于，具體實施包括以下步驟1)取中藥樣品干燥，按常規(guī)方法制備中藥細粉和微粉；2)在0.051.5g范圍內稱取5-8個不同重量的步驟1)所述細粉，均勻分散于溶媒中，按顯微觀測計數法觀察細粉中完整的特征細胞為顯微計數物，并進行線性回歸，繪制標準曲線，得回歸曲線方程，反復進行此步驟至回歸曲線方程中相關系數r大于0.9，再進行下一步；3)分別按照步驟2)所述方法稱取步驟1)所述微粉和細粉，按顯微觀測計數法觀察其中完整的特征細胞為顯微計數物，按下列公式計算細粉和微粉的顯微特征細胞個數XV中藥粉體顯微特征細胞個數/mg=-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，X為每個視野內的特征細胞數，V為藥液總體積，V'為蓋玻片下藥液體積，W為樣品稱取量；4)根據樣品細粉和微粉的顯微特征細胞個數，按下列公式計算細胞破壁率:Y=(A-B)/Axl00%，其中，Y為細胞破壁率，A為細粉顯微特征細胞個數，B為微粉的顯微特征細胞個數。4、根據權利要求3所述的中藥微粉細胞破壁率的測定方法，其特征在于，步驟l)所述中藥樣品干燥為水分低于6%;所述常規(guī)方法制備中藥細粉和微粉是將中藥樣品粉碎成80-100目的細粉，再將細粉進行超微粉碎至過300目的微粉。5、根據權利要求1至4之一所述的中藥微粉細胞破壁率的測定方法，其特征在于，所述溶媒為水合氯醛或稀甘油。全文摘要本發(fā)明提供了一種中藥微粉細胞破壁率的測定方法，首次對根及根莖、皮、葉、花、果實類等不同入藥部位的中藥微粉進行了細胞破壁率的測定，并與細粉進行比較，探討了不同入藥部位中藥細胞破壁率測定的共性，確定了不同入藥部位中藥宜選擇不同的特征細胞計數指標，以中藥粉體完整的某一細胞作為特征計數物，采用細胞計數法考察超微粉碎對中藥細胞破壁率的影響。方法學研究結果表明，采用細胞計數法測定中藥微粉細胞破壁率的方法穩(wěn)定，操作簡便、重復性較好。該法對于測定中藥粉體的細胞破壁率具有借鑒作用，也為中藥超微粉體的質量研究及評價提供了細胞破壁率測定的新思路。文檔編號G01N33/48GK101403738SQ200810143609公開日2009年4月8日申請日期2008年11月14日優(yōu)先權日2008年11月14日發(fā)明者雅李,瑛楊,楊永華,溫俊達,蔡光先申請人:湖南省中醫(yī)藥研究院