專利名稱：：應用流式細胞術檢測病毒載體類基因治療藥物感染滴度的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基因治療藥物分析檢測領域，特別提供了應用流式細胞術檢測病毒載體類基因治療藥物感染滴度的方法。
背景技術：
：基因治療是當今醫(yī)學與生物領域研究的熱點，對于某些重大疾病的防治，如腫瘤，艾滋病，心血管疾病等，基因治療顯示出廣闊的前景。現(xiàn)有的基因治療臨床實驗方案中，以病毒為載體的基因治療方案居多，在病毒載體類基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制和臨床應用中，比活是一項重要指標，即有活性病毒粒子數(shù)總病毒粒子數(shù)?？偛《玖Ｗ訑?shù)的測定方法主要有電鏡法，光吸收法，離子交換HPLC，PicoGreen法等。而有活性病毒粒子數(shù)的測定是基于病毒所能產(chǎn)生的可以定量的生物效應，傳統(tǒng)的噬斑法一直以來被視為標準方法，其依賴于病毒復制和若干輪的細胞分裂而產(chǎn)生肉眼可見的病毒噬斑，該方法周期長(14天)，肉眼判定，客觀性差。而免疫熒光法是通過將病毒樣品稀釋到一定比例后感染細胞，培養(yǎng)一段時間后用熒光標記的抗體染色，在熒光顯微鏡下記數(shù)陽性細胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)做結(jié)果判定，由于該方法為單點法，無法避免若干次稀釋帶來的累積誤差，而且通過肉眼觀察，根據(jù)細胞熒光強度判定陽性細胞，客觀性差。還有一種方法是基于觀察細胞病變的TCID50法，即半數(shù)組織細胞感染量法，該方法也存在周期長，肉眼判定的缺點。流式細胞術是一種新興的細胞分析技術，國外曾有利用流式細胞術檢測腺病毒感染滴度的報道，但其理論和數(shù)學依據(jù)是在病毒量較小的情況下，細胞的感染率與病毒量近似成正比，不能完全模擬病毒量和細胞感染率之間的數(shù)量關系。因此，我們寄希望建立一個更科學的模型，在此模型的基礎上建立相應的技術方案，以便能夠使用流式細胞術更加快速，準確的檢測病毒載體類基因治療藥物的感染滴度。
發(fā)明內(nèi)容1、發(fā)明目的目前，病毒載體類基因治療方案不斷出現(xiàn)，但現(xiàn)有的用于檢測病毒感染滴度的技術方法都存在一定的缺點。所以，我們需要建立一種更加科學，更加快速準確的方法來檢測病毒感染滴度。這對于該類產(chǎn)品的研究開發(fā)，質(zhì)量控制乃至臨床應用都具有重要意義。2、技術方案本方法的建立是以傳播缺陷型仙臺病毒載體為研究對象，流式細胞儀為檢測方法，建立以泊松分布為基礎的數(shù)學模型做曲線擬合，結(jié)合所建立的計算方法，以函數(shù)中的一項參數(shù)做結(jié)果判定。其技術流程為LLC-MK2細胞鋪六孔板一細胞記數(shù)，病毒感染細胞(每個MOIn對應一個孔)一消化并收集細胞一固定一滲透化一封閉一一抗孵育一FITC標記的二抗孵育一流式上機檢測，記錄各M01n對應的陽性細胞百分數(shù)一使用CurveExpert1.3做曲線擬合，結(jié)果判定。本技術方案為針對傳播缺陷型仙臺病毒載體，對于其它類型病毒載體同樣適用。數(shù)學模型的推導和建立過程為-本數(shù)學模型的建立是基于泊松分布，所謂隨機變量X服從Poisson分布，是指X取值范圍為O,其相應取值概率為XPoisson分布主要用于描述單位時間(空間)中稀有事件的發(fā)生數(shù)，比如一定區(qū)域內(nèi)某種微生物或粉塵的計數(shù)分布，單位容積充分搖勻的水中的細菌數(shù)，比如某河中平均每毫升河水中有6個細菌，則由該河中隨機抽取1毫升水中的細菌數(shù)X服從以P=6為參數(shù)的Poisson分布，._6"x=0，1…泊松分布適合于模擬病毒感染單細胞層面，由于病毒的體積相對于細胞非常小(l:109)，一定量的病毒感染單細胞層面時，可看作一定區(qū)域內(nèi)某種微生物的計數(shù)分布。而且該仙臺病毒為傳播缺陷型，子一代病毒不會感染其它細胞，在某一MOI(病毒與細胞總的數(shù)量比，相當于一個細胞的區(qū)域范圍內(nèi)平均有MOI個病毒)下，那么一個細胞被k個病毒感染的概率為,、M01kxe-M01Pr(X=k)=-每個細胞被感染的概率P即細胞至少被一個病毒感染的概率，貝IJ:Pr(cellinfected)=p=Pr(X》l),、—顧=1-Pr(X=0)=1-e那么在此M0I下，細胞被感染的陽性百分數(shù)為y-恥i、9dINF=100X(l-e)設樣品中實際的活性病毒滴度為m，實驗前由于m未知，假定其滴度為n,m=BXn,根據(jù)血球記數(shù)儀得到的細胞總數(shù)，結(jié)合假定值n將樣品做成不同稀釋度，即得到不同的MOL，由于m=BXn，則M0I=BXM0In(MOI為對應于m的實際值，MOL為根據(jù)假定值n得到的表觀值)，將其代入上式，同時被感染的細胞中有一定比例由于狀態(tài)不好，不能表達大量病毒蛋白，或由于染色時不均一產(chǎn)生假陰性，需引入一個參數(shù)A，艮卩%IFN=100XAX(l-en)(此即為所建立的數(shù)學模型)3、有益效果該方法的建立有利于病毒載體類基因治療藥物的研究開發(fā)，質(zhì)量控制和臨床應用，有望成為一種標準方法，為其它相關方法提供對照。具有較高的理論價值和應用價值。通過與傳統(tǒng)的方法如噬斑法，免疫熒光法做對照，該方法具有以下優(yōu)點1.傳統(tǒng)方法多將樣品高倍稀釋，采用單點上樣，無法避免高倍稀釋帶來的累計誤差，而流式測定采用多個稀釋度，采用曲線擬合，避免了這種不足。2.傳統(tǒng)方法多采用肉眼觀測記數(shù)，客觀性差，不同操作者之間變異大，而流式測定借助儀器分析，結(jié)果更客觀。3.由于被感染的細胞有一定比例由于狀態(tài)不好，無法支持病毒大量復制，或由于染色原因造成一定比例假陰性。采用傳統(tǒng)方法無法避免這種誤差，會造成結(jié)果偏低，而流式測定的數(shù)學模型中引入一項參數(shù)A，可將此誤差校正，而結(jié)果判定由B決定，因此避免了對結(jié)果的干擾。4.病毒感染細胞后到染色之前需培養(yǎng)一定時間，在此過程中一小部分細胞(包括感染細胞和非感染細胞)會分裂，免疫熒光法中鏡下觀察常見兩個熒光細胞連在一起的現(xiàn)象(圖五)，很難區(qū)別是一個陽性細胞分裂為兩個還是兩個單獨的陽性細胞(實際操作中若兩細胞間隔大于一個細胞判為兩個，否則判為一個)，給結(jié)果判定帶來誤差，而流式測定是記數(shù)陽性比(細胞分裂前后，陽性比不會改變)，則回避了細胞分裂帶來的誤差。圖l各MOIn對應的流式熒光直方圖和細胞的感染率。圖l-l陰性對照的流式熒光直方圖1-2MOI^15對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為97.2%;圖1-3M0I^10對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為97.3%;圖l-4MOI^5對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為96.4%;圖l-5MOL^2對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為88.1%;圖l-6M0I=1對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為66.6%;圖卜7M0I=0.8對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為56.4%;圖l-8M0I^0.6對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為47.6%;圖1-9M0I^0.4對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為32.0%;圖I-IOM0I^0.2對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為16.9%;圖l-llMOI。=0.l對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為9.4%;圖1-12MOI=0.05對應的流式熒光直方圖，細胞的感染率為4.6%。圖2根據(jù)先IF^100XAX(卜e—BXMO、)所得擬合曲線，r二O.99927370,A=0.9756678,B=1.0896634。圖3孵育時間<3天對應的流式熒光直方圖。圖3-l陰性對照的流式熒光直方圖3-2可見陰性峰和陽性峰未完全分開，出現(xiàn)假陰性；圖3-3可見陰性峰和陽性峰未完全分開，出現(xiàn)假陰性。圖4分別使用LLC-MK2/F細胞和Vero細胞的噬斑圖片；圖4-1使用LLC-MK2/F細胞的陽性對照；圖4-2使用LLC-MK2/F細胞的陰性對照；圖4-3使用LLC-MK2/F細胞的傳播缺陷型仙臺病毒；圖4-4使用Vero細胞的陽性對照；圖4-5使用Vero細胞的陰性對照；圖4-6使用Vero細胞的傳播缺陷型仙臺病毒。圖5應用免疫熒光法，視野下的陽性細胞。一個細胞代表一個有感染能力的病毒，可見兩個細胞相連的現(xiàn)象。具體實施例方式以下給出了檢測傳播缺陷型仙臺病毒載體的具體實施例，但本發(fā)明并不局限在以下實施例中。l.材料與方法1.l研究對象攜帶外源治療基因的傳播缺陷型仙臺病毒(Sev/AF)。該病毒載體F基因缺失，其包膜上的F蛋白由經(jīng)過改造的恒河猴腎細胞(LLC-MK2)LLC-MK2/F/Ad反式提供。以該病毒感染LLC-MK2后，形成的子一代病毒缺失F蛋白，失去感染其它細胞的能力。1.2仙臺病毒陽性對照(無缺陷型)為本實驗室保存。1.3試劑1.3.1胎牛血清(FCS)，MEM，0.25%trypsin-Versene為Gibco產(chǎn)品。1.3.2anti-Sev兔血清，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG。1.3.3緩沖液、稀釋液、洗液PBS，1%BSA;固定液4%多聚甲醛；封閉掖5%FCS;滲透化液0.l%TritonX-100~PBS。1.4細胞LLC-MK2細胞為恒河猴腎細胞，購自ATCC(ATCCCCL7.1)。該細胞使用含10%FCS的MEM培養(yǎng)基，以2X106接種于75cm2方瓶，于37°C，5%C02孵箱中培養(yǎng)三天后，用0.25%trypsin-Versene消化傳代。1.5儀器流式細胞儀，F(xiàn)ACSCanto,美國BD公司產(chǎn)品；國產(chǎn)800型離心機。1.6數(shù)據(jù)分析軟件CurveExpert1.3。1.7實驗流程1.7.1試驗前72小時以LLC-MK2細胞鋪六孔板，MEM_10%FCS2ml/孔。1.7.2上樣病毒前首先選擇一孔，將細胞消化后用血球記數(shù)儀記數(shù)。結(jié)合細胞總數(shù)，假定值n，病毒上樣體積(lOOyl)，將樣品用1細SA做不同稀釋度，得到不同的MOIn。1.7.3病毒上樣，每個MOL對應一個細胞孔，上樣體積為100ul，同時設一陰性孔，加lOOul1%BSA。搖勻，使病毒液均勻鋪在細胞上，置37'C，5%的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時，每隔15分鐘搖板一次。1.7.4吸去病毒上清，加入PBS(lml/孔)洗一遍，吸干PBS。加入2ml的MEM，37°C，5%的0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。1.7.5吸去MEM，加入PBS(lml/孔)洗一遍，吸干PBS。加入0.5ml/孔0.25%trypsin-Versene，37°C,3min，加入0.5ml/孔10%FCS-MEM，吹勻轉(zhuǎn)入流式管，1000rpm,5min，棄上清。1.7.6固定先用750ulPBS重懸細胞，置震蕩器上緩慢加入250ul16%多聚甲醛，4。C，30min。1500rpm,5min，棄上清。1.7.7滲透化0.l%TritonX-100—PBS1ml重懸細胞，37'C，15min。1500rpm，5min,棄上清。1.7.8封閉5%FCS-PBSlml重懸細胞，室溫30min。1500rpm，5min，棄上清。1.7.9—抗孵育每管加入0.5ml以1%BSA-PBS1:500稀釋的兔抗仙臺病毒抗體，4°C，60min。2000rpm，5min，棄上清。以1柳SA-PBS洗一次。1.7.10二抗孵育每管加入0.5ml以1%BSA-PBS1:500稀釋的FITC標記的羊抗兔IgG，4°C，60min。2000rpm，5min，棄上清。以1%BSA-PBS洗一次。1.7.11每管加入0.5mlPBS，吹勻，過濾網(wǎng)，流式上機檢測。以陰性管設置陰性門和陽性門的分界線，記錄各管的陽性細胞百分數(shù)(即各MOIn對應的陽性細胞百分數(shù))。1.7.12以MOIn為橫坐標，陽性百分數(shù)為縱坐標，根據(jù)所建立的數(shù)學模型，使用CurveExpert1.3做曲線擬合。2.結(jié)果與分析該實驗共進行三次，以其中一次為例詳細闡述細胞記數(shù)為1.0X107孔，則假定IU為2.OX109IU/ml(假定值n，該值理論上可任意設定，但為稀釋方便，可取細胞的整數(shù)倍)，根據(jù)上樣體積100ul，做不同稀釋度，使M0I。依次為15，10，5，2，1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1，0.05,同時設一陰性孔，共12孔。流式上機檢測時，在通用模板上做兩個圖，第一個為FSC-SSC散點圖，調(diào)整FSC，SSC電壓，使細胞群位于合適位置，做門P,，圈住目標細胞群。第二張圖為FITC熒光值的直方圖，讓第二張圖顯示P!門內(nèi)細胞群showp叩ulation-P"同時設左側(cè)陰性門&右側(cè)陽性門P3。上陰性管，調(diào)整相應熒光電壓，使陰性細胞峰位于陰性門&內(nèi)(接近100%)，然后檢測各M0I。對應管，記錄陽性門P3內(nèi)陽性百分數(shù)(圖1)，陰性管的陰性百分比為99.8%,各M0L陽性百分數(shù)為(表一)，<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表一各M0L下的細胞陽性百分數(shù)使用所建立的數(shù)學模型，用CurveExpertL3做曲線擬合(圖2)，所得擬合參數(shù)。實際的IU為BXr^2.OX109IU/mlX1.09=2.18X109IU/ml。另兩次實驗結(jié)果為2.lX109IU/ml,2.lX109IU/ml綜上所述，三次測定結(jié)果分別為2.18X109IU/ml，2.lX109IU/ml，2.1X109IU/ml,(2.13±0.05X109IU/ml，CV=2.34%)。病毒感染細胞后孵育時間的確定是一項重要的條件，孵育時間過短，則病毒沒有充分在胞質(zhì)中復制表達，表現(xiàn)在熒光直方圖上即用陰性管確定陰性們和陽性門分界線后，各樣本的陰性峰和陽性峰不能分布于分界線的兩側(cè)(圖3)，出現(xiàn)假陰性。如果孵育時間過長，則由于病毒在細胞中的大量復制影響細胞狀態(tài)，那么在后續(xù)的操作過程中被病毒感染的陽性細胞容易破碎丟失，從而影響實驗結(jié)果。本研究在優(yōu)化條件時分別在病毒孵育后第一，二，三，四天收集細胞檢測，結(jié)果表明第一和第二天出現(xiàn)假陰性，第三天檢測陰性峰和陽性峰剛好位于分界線兩側(cè)，而且在第三天鏡檢細胞形態(tài)完好。因此確定孵育時間為三天。該方法的質(zhì)控要點主要有兩項，第一各MOL對應管的陰性峰和陽性峰應位于由陰性管確定的分界線的兩側(cè)；第二；所得到擬和曲線r〉0.999。3.分析與討論下面將以噬斑法和免疫熒光法檢測該傳播缺陷型仙臺病毒的感染滴度，并將結(jié)果與上述新建立的方法做對比。噬斑法檢測噬斑法是檢測病毒感染滴度的經(jīng)典方法，其依賴于病毒復制和若干輪的細胞分裂而產(chǎn)生肉眼可見的病毒噬斑，由于該病毒為傳播缺陷型，因此用vero細胞和輔助細胞LLC-MK2/F驗證能否形成噬斑。Vero細胞無輔助功能，無法形成有感染能力的病毒，理論無法產(chǎn)生噬斑，而LLC-MK2/F能輔助產(chǎn)生有感染能力的病毒，因此理論能產(chǎn)生噬斑。將vero和LLC-MK2/F兩種細胞各鋪6孔板，待細胞長至單層后，棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍。加入200lU預稀釋的病毒樣品，用病毒稀釋液做陰性對照，用標準的無缺陷型仙臺病毒做陽性對照，理論上陽性對照在兩種細胞都能產(chǎn)生噬斑。37'C孵育lh。孵育過程中，將預熱好的2X培養(yǎng)基和l%Agar0se以l:l混合，加入5ng/mlTrypsin，輕輕混勻。孵育完畢后，吸棄殘余液體，加入上述制備的混合液lml/孔，室溫下凝固后，放入孵箱培養(yǎng)三天。待鏡下觀察出現(xiàn)細胞病變效應后，甲醛固定，結(jié)晶紫染色。結(jié)果(圖4):無缺陷型仙臺病毒在兩種細胞均可形成噬斑，陰性對照和傳播缺陷型仙臺病毒均未形成噬斑?？赡苁怯捎谳o助細胞輔助效率不高，無法產(chǎn)生大量有感染能力的病毒。由此可見，噬斑法不適合檢測此類傳播缺陷型病毒。免疫熒光法該缺陷型仙臺病毒載體適合用免疫熒光法檢測感染滴度，病毒進入一個細胞后，只在該細胞中表達，因此可通過免疫熒光標記，熒光顯微鏡記數(shù)。其具體方法是將該樣品稀釋5X106倍，每孔上樣100ul，培養(yǎng)三天后，用甲醇固定細胞于培養(yǎng)板，一抗孵育(兔抗Sev血清)，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔二抗標記，熒光顯微鏡下記數(shù)，每個有熒光的細胞代表一個IU，則樣品IU濃度4X10X5X106，A為6孔板中各孔有熒光的細胞平均數(shù)，以該方法測定3次，結(jié)果分別為2.08X109IU/ml，2.4X109IU/ml，1.93X109IU/ml(2.14士0.24X109IU/ml，CV=11.2%)。通過與流式測定結(jié)果比較，可見流式測定在精密度上明顯優(yōu)于免疫熒光法，兩者優(yōu)缺點比較如下-一.免疫熒光法將樣品稀釋5X106倍，采用單點上樣，無法避免高倍稀釋帶來的累計誤差，而流式測定釆用多個稀釋度，采用曲線擬合，避免了這種不足。二.免疫熒光法肉眼觀測記數(shù)，客觀性差，不同操作者之間變異大，而流式測定借助儀器分析，結(jié)果更客觀。三.由于被感染的細胞有一定比例由于狀態(tài)不好，無法支持病毒大量復制，或由于染色原因造成一定比例假陰性。采用免疫熒光法無法避免這種誤差，會造成結(jié)果偏低，而流式測定的數(shù)學模型中引入一項參數(shù)A，可將此誤差校正，而結(jié)果判定由B決定，因此避免了對結(jié)果的干擾。四.病毒感染細胞后到染色之前需培養(yǎng)三天，在此過程中一小部分細胞(包括感染細胞和非感染細胞)會分裂，免疫熒光法中鏡下觀察常見兩個熒光細胞連在一起的現(xiàn)象(圖5)，很難區(qū)別是一個陽性細胞分裂為兩個還是兩個單獨的陽性細胞(實際操作中若兩細胞間隔大于一個細胞判為兩個，否則判為一個)，給結(jié)果判定帶來誤差，而流式測定是記數(shù)陽性比(細胞分裂前后，陽性比不會改變)，則回避了細胞分裂帶來的誤差。權(quán)利要求1.一種應用流式細胞術檢測病毒載體類基因治療藥物感染滴度的方法，其特征在于建立了模擬病毒感染細胞特點的數(shù)學模型和相應的結(jié)果計算方法，具體步驟為1)根據(jù)泊松分布原理，在某一MOI(multiplicityofinfection，即病毒和細胞數(shù)量比值)下，細胞被感染的陽性百分數(shù)為％INF＝100×(1-e-MOI)；2)設病毒樣品中實際的感染滴度為m，實驗前由于m未知，假定其滴度為n，m＝B×n，根據(jù)血球記數(shù)儀得到的細胞總數(shù)，結(jié)合假定值n將樣品做成不同稀釋度，即得到不同的MOIn，由于m＝B×n，則MOI＝B×MOIn，將其代入上式，同時被感染的細胞中有一定比例由于狀態(tài)不好，不能表達大量病毒蛋白，或由于染色時不均一產(chǎn)生假陰性，需引入一個參數(shù)A，即，此即為確定的數(shù)學模型；3)結(jié)果計算方法通過曲線擬和得到B值，那么實際的病毒感染滴度m＝B×n。2.—種應用流式細胞術檢測病毒載體類基因治療藥物感染滴度的方法，其特征在于建立了相應的技術方案，具體步驟為1)試驗前細胞鋪六孔板，2ml完全培養(yǎng)基/孔，置37'C，5%的0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞長滿；(2)上樣病毒前首先選擇一孔，將細胞消化后用血球記數(shù)儀記數(shù)。結(jié)合細胞總數(shù)，假定值n，病毒上樣體積(lOOul)，將樣品用稀釋液做不同稀釋度，得到不同的MOIn;(3)病毒上樣，每個MOL對應一個孔，上樣體積為lOOul，同時設一陰性孔，力卩l(xiāng)OOixl樣品稀釋液。搖勻，使病毒液均勻鋪在細胞上，置37°C，5%的0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時，每隔15分鐘搖板一次；(4)吸去病毒上清，加入PBS(lml/孔)洗一遍，吸干PBS。加入2ml的基礎培養(yǎng)基，37°C，5%的0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；(5)吸去培養(yǎng)基，加入PBS(lml/孔)洗一遍，吸干PBS。加入0.5ml/孔0.25%trypsin-Versene,37"C，3min，加入0.5ml完全培養(yǎng)基/孔，吹勻轉(zhuǎn)入流式管，1000rpm，5min，棄上清；(6)固定lml固定液重懸細胞充分混勻，4°C，30min。1500rpm，5rain，棄上清；(7)滲透化lml滲透化液重懸細胞，37°C，15min。1500rpm，5min，棄上清；(8)封閉lml封閉液重懸細胞，室溫30min。1500rpm，5min，棄上清；(9)一抗孵育每管加入O.5ml以抗體稀釋液l:500稀釋的一抗，4'C，60min。2000rpm，5min，棄上清。以抗體稀釋液洗一次；(10)二抗孵育每管加入0.5ml以抗體稀釋液1:500稀釋的FITC標記的二抗，4°C，60min。2000rpm，5min，棄上清。以抗體稀釋液洗一次；(11)每管加入0.5mlPBS，吹勻，過濾網(wǎng)，流式上機檢測。以陰性管設置陰性門和陽性門的分界線，記錄各管的陽性細胞百分數(shù)(即各MOIn對應的陽性細胞百分數(shù))。3.按照權(quán)利要求2所述的技術方案，所選用的病毒樣品稀釋液，抗體稀釋液和洗液為濕SA—PBS。4.按照權(quán)利要求2所述的技術方案，所選用的固定液為4%多聚甲醛，固定方法為先用750U1PBS重懸細胞，置震蕩器上緩慢加入250nl16%多聚甲醛。5.按照權(quán)利要求2所述的技術方案，所選用的滲透化液為0.l%TritonX-100~PBS。6.按照權(quán)利要求2所述的技術方案，所選用的封閉液為5WFCS-PBS。7.按照權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的應用流式細胞術檢測病毒載體類基因治療藥物感染滴度的方法，其特征為所述的病毒載體類基因治療藥物為適合該數(shù)學模型的所有病毒載體，如傳播缺陷型仙臺病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體。8.—種應用流式細胞術檢測病毒載體類基因治療藥物感染滴度的方法，其特征在于建立了相應的方法質(zhì)控指標，即第一各MOIn對應管的陰性峰和陽性峰應位于由陰性管確定的分界線的兩側(cè)；第二；所得到擬和曲線r〉0.999。全文摘要本發(fā)明公開了一種流式細胞術檢測病毒載體類基因治療藥物感染滴度的方法。首先建立了模擬病毒感染細胞特點的基于泊松分布的數(shù)學模型，并且確定了相應計算方法。具體實施步驟為細胞鋪六孔板，待細胞長滿后選擇一孔計數(shù)，病毒感染細胞，培養(yǎng)一定時間后消化，收集細胞，將收集的細胞依次固定，滲透化，封閉，一抗孵育，F(xiàn)ITC標記的二抗孵育，用流式細胞儀檢測，將所得結(jié)果根據(jù)所建立的數(shù)學模型做曲線擬合，結(jié)果判定。將該方法與傳統(tǒng)方法如噬斑法，免疫熒光法做對比，證實該方法更準確，精密度高，而且不受細胞狀態(tài)和病毒感染細胞后培養(yǎng)過程中細胞分裂的影響。該方法的建立對于此類產(chǎn)品的質(zhì)量控制和臨床應用有重要意義。文檔編號G01N33/48GK101387636SQ200810147329公開日2009年3月18日申請日期2008年8月7日優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日發(fā)明者付志浩,李永紅,王軍志,饒春明,凱高申請人:中國藥品生物制品檢定所