專利名稱：：陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管及用于蛋白質(zhì)在線富集分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制備陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管及其蛋白質(zhì)在線富集毛細(xì)管電泳分析方法，屬于蛋白質(zhì)分離分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)的分離分析無論在醫(yī)療診斷領(lǐng)域還是在日益發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域均具有十分重要的意義。毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis)技術(shù)因其具有高柱效、高選擇性、低消耗、易于自動化等優(yōu)點(diǎn)，己廣泛的用于蛋白質(zhì)的分離分析。毛細(xì)管電泳一般在內(nèi)徑為25100微米的石英毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行，故溶質(zhì)的進(jìn)樣量較小。此外，蛋白質(zhì)毛細(xì)管電泳一般使用紫外檢測器進(jìn)行在線檢測，因此檢測光程較短。所以，毛細(xì)管電泳法檢測靈敏度較差，溶質(zhì)檢測限較高。如何有效的提高毛細(xì)管電泳法的檢測靈敏度及降低溶質(zhì)檢測限是當(dāng)今毛細(xì)管電泳研究及應(yīng)用領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。迄今，解決這一問題主要有三種方法(1)改變與紫外檢測器連接處毛細(xì)管柱的光路設(shè)計(jì)，如安捷倫公司研制的帶有泡型檢測池(bubblecell)的毛細(xì)管柱；(2)采用具有較高靈敏度的檢測器如熒光檢測器，質(zhì)譜檢測器等；(3)采用樣品富集方法，這種方法又分為在線富集(on-linepreconcentratiorO'及離線富集(off-linepreconcentratiorO兩種。其中第一種方法雖然可以在一定程度上提高檢測靈敏度，但是所用的毛細(xì)管柱往往價(jià)格較高。第二種方法往往需要毛細(xì)管電泳儀額外配備價(jià)格昂貴的檢測器，此外，這種方法對樣品或緩沖液均有特殊的要求，進(jìn)而限制了其廣泛應(yīng)用。第三種方法中離線富集方法雖然可以使樣品得到較大程度上的富集，但是這種方法往往需要富集柱同分離柱偶聯(lián)起來使用，操作比較麻煩。樣品在線富集方法是當(dāng)今解決毛細(xì)管電泳檢測靈敏度差的主要方法，也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問題。迄今，許多在線富集方法己用于蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電泳分析。其中，樣品堆積方法(samplestackingmethod)是最常使用的方法。Bessonova.等在《journalofchromatographyA》第1150巻中報(bào)道了采用五中樣品堆積富集方法對人血清白蛋白(HAS)進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離分析(Electrophoreticdeterminationofalbumininurineusingon-lineconcnetrationtechniques,JournalofChromatographyA,2007,1150,332-338)。其中采用大體積樣品堆積方法(largevolumesamplestackingmethod)使HSA的檢測靈密度提高了67倍，樣品檢出限為15ng/ml。使用這種方法樣品的進(jìn)樣量最多為一倍柱體積。然而對于極低濃度的樣品，一倍柱體積的進(jìn)樣量也往往無法得到具有較強(qiáng)信號的溶質(zhì)吸收峰。因此，這種方法不適用于極低濃度樣品的分析檢測。在線樣品萃取富集方法(on-linesampleextractionandpreconcentrationmethod)可以通過多倍柱體積樣品進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)對樣品的高倍富集。Li等用帶有負(fù)電溶膠凝膠涂層管柱對肌紅蛋白進(jìn)行了在線萃取富集分離(Negativelychargedsol-gelcolumnwithstableelectroosmoticflowforonlinepreconcentrationofzwitterionicbiomoleculesincapillaryelectromigrationseparations,Journalofseparationscience,28,2153-2164)。肌紅蛋白在進(jìn)樣的過程中通過靜電作用吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁上，隨后用大于肌紅蛋白等電點(diǎn)的緩沖液在正向電滲流的推動下將吸附的蛋白洗脫下來。該法對肌紅蛋白的富集倍數(shù)達(dá)3000倍。然而，這種方法每次只可以富集分離一種蛋白質(zhì),不適用于蛋白質(zhì)混合物的分離分析。Qu等和Li等分別采用蝕刻后的毛細(xì)管柱和溶膠凝膠涂層的毛細(xì)管柱對氨基酸混合物進(jìn)行了在線萃取及富集分離(Etchedbarefused-silicacapillariesforonlinepreconentrationofaminoacidsinCE,Elelctrophoresis,27，4500-4507:Positivelychargedsol-gelcoatingsforon-linepreconentrationofaminoacidsincapillaryelectrophoresis,Analyticalchemistry,2004，76，218-227)。這種方法中，通過進(jìn)樣吸附在管壁的樣品先用反向電滲流洗脫至管柱進(jìn)口端，隨后用正向電滲流對洗脫下來的祥品進(jìn)行分離。這種方法可以很好的實(shí)現(xiàn)氨基酸混合物的富集分離，然而該法用于蛋白質(zhì)混合物的分離分析中卻未見報(bào)道。用在線萃取富集分離蛋白質(zhì)需要毛細(xì)管柱具有較高的蛋白質(zhì)吸附容量。Xu和Sun用甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體在毛細(xì)管內(nèi)壁接枝上了觸須式聚合物長鏈，隨后在接枝上的聚合物上修飾了苯丙氨酸制得苯丙氨酸修飾的觸須式聚合物涂層毛細(xì)管柱。制得的毛細(xì)管柱具有較高的配基容量，己成功的用于苯類化合物、氨基酸及蛋白質(zhì)的分離分析(NovelopentubularCECwithtentacle-typepolymerstationaryphasefunctionalizedbyphenylalanine,Electrophoresis,2008,29，880-888)。本專利在前人的研究基礎(chǔ)上，成功的制備了新型陰離子聚合物接枝涂層的毛細(xì)管柱并將其用于蛋白質(zhì)在線富集毛細(xì)管電泳法分析。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于蛋白質(zhì)在線萃取富集的毛細(xì)管電泳分離分析方法。本方法采用陰離子聚合物涂層的毛細(xì)管柱萃取樣品溶液中的蛋白質(zhì)溶質(zhì)，并用反向電滲流將吸附的蛋白質(zhì)洗脫并富集于管柱進(jìn)口，隨后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離操作。本方法可以多倍柱體積樣品進(jìn)樣，故可以用于低豐度蛋白質(zhì)樣品溶液的分離分析。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱的制備方法，包括毛細(xì)管預(yù)處理、乙烯基化毛細(xì)管內(nèi)壁、甲基丙烯酸縮水甘油酯原位接枝反應(yīng)以及磺酸基修飾反應(yīng)，其中磺酸基修飾反應(yīng)是向制得的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝修飾的管柱中通入含0.1—0.3g/1亞硫酸鈉及2—6。/。v/v異丙醇的水溶液，管柱兩端封口后室溫反應(yīng)l一3天，隨后用管柱分別用水、甲醇洗，最后氮?dú)獯蹈蓚溆?，便制得了陰離子聚合物接枝涂層的毛細(xì)管柱。本發(fā)明的制備的陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱進(jìn)行蛋白質(zhì)在線富集分析方法，步驟如下第一步為大體積壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣條件為20psi，3min;樣品溶液在壓力的驅(qū)動下進(jìn)入毛細(xì)管，進(jìn)樣過程中帶有正電荷的蛋白質(zhì)分子會吸附到陰離子聚合物接枝涂層的毛細(xì)管內(nèi)壁上；第二步為反向電滲流洗脫富集蛋白質(zhì)，反向電滲流富集電壓為20kV，即將上步中吸附在管壁的蛋白質(zhì)分子用pH大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的溶液將其反向洗脫下來，蛋白質(zhì)樣品會在樣品溶液和洗脫緩沖液的界面處富集;當(dāng)電流的絕對值為32.5nA時(shí)停止加壓；第三步為毛細(xì)管電泳法分離分析第二步中富集的蛋白質(zhì)，運(yùn)行緩沖液為pH9.2的20mM磷酸緩沖液。所述的樣品溶液是為蛋白質(zhì)溶于pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH4.2，5mM磷酸緩沖液。所述的洗脫緩沖液為pH值大于分析蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH9.2的20mM磷酸緩沖液。所述的管柱管柱溫度25°C，檢測波長200nm。詳細(xì)內(nèi)容介紹如下首先制備陰離子聚合物涂層毛細(xì)管柱，制得的管柱可用于高容量萃取樣品溶液中的蛋白質(zhì)。管柱制備包括以下四步毛細(xì)管預(yù)處理、乙烯基化毛細(xì)管內(nèi)壁、甲基丙烯酸縮水甘油酯原位接枝反應(yīng)以及磺酸基修飾反應(yīng)。陰離子聚合物涂層毛細(xì)管柱的反應(yīng)方程式可參見圖1。未經(jīng)任何修飾的毛細(xì)管首先用一定濃度的堿溶液處理除去管內(nèi)堿溶性雜質(zhì)以及將管壁硅氧鍵打開形成硅羥基，隨后用一定濃度的酸溶液沖洗管柱除去管內(nèi)酸溶性雜質(zhì)。第二步反應(yīng)為乙烯基化毛細(xì)管內(nèi)壁，可參見圖l(a)。向預(yù)處理后的毛細(xì)管柱內(nèi)通入含lmg/ml1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)以及30%v/vY-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅垸(Y-MPS)的二甲基呋喃溶液，管柱兩端封口后在120T油浴中反應(yīng)6h。反應(yīng)完成后，管柱用甲醇沖洗，隨后氮?dú)獯蹈伞５谌浇又Ψ磻?yīng)的反應(yīng)方程式可參見圖l(b)。反應(yīng)過程為首先，向上步制得的管柱中通入含有一定濃度接枝聚合反應(yīng)單體和引發(fā)劑的溶液，管柱兩端封口后80"C反應(yīng)10h。所用的引發(fā)劑應(yīng)為自由基聚合反應(yīng)引發(fā)劑，如偶氮二異丁氰、過氧化二苯甲酰等。隨后用分別用甲苯、甲醇沖洗管柱，最后管柱用氮?dú)獯蹈伞５谒牟交撬峄揎椃磻?yīng)的反應(yīng)方程式可參見圖l(c)。反應(yīng)過程為首先向上步制得的管柱中通入含0.1—0.3g/L亞硫酸鈉及2—6%v/v異丙醇的水溶液，管柱兩端封口后室溫反應(yīng)l一3天，隨后用管柱分別用水、甲醇洗，最后氮?dú)獯蹈蓚溆?。這樣便制得了陰離子聚合物接枝涂層的毛細(xì)管柱。因?yàn)樵诠軆?nèi)壁接枝上了修飾有磺酸基的聚合物，故毛細(xì)管內(nèi)壁便可以通過靜電作用高容量吸附蛋白質(zhì)。采用上述制得的陰離子聚合物接枝毛細(xì)管柱在線萃取富集分離蛋白質(zhì)方法為配置pH小于分析物(蛋白質(zhì))等電點(diǎn)的磷酸緩沖液用于樣品制備，配置pH大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的磷酸緩沖液作為毛細(xì)管電泳流動相。樣品的富集分離分為三步(參見圖2):第一步為大體積壓力進(jìn)樣，將樣品溶液用20psi沖洗管柱3min，進(jìn)樣過程中帶有正電荷的蛋白質(zhì)分子會吸附到陰離子聚合物接枝涂層的毛細(xì)管內(nèi)壁上。第二步為反向電滲流洗脫富集蛋白質(zhì)，即將上步中吸附在管壁的蛋白質(zhì)分子用pH大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的溶液將其反向洗脫下來，蛋白質(zhì)樣品會在樣品溶液和洗脫緩沖液的界面處富集。在這步操作中，隨著高pH值，高離子強(qiáng)度的洗脫緩沖液的引入，毛細(xì)管內(nèi)電流會逐漸增加。當(dāng)富集的蛋白質(zhì)被洗脫到毛細(xì)管進(jìn)口端后，電流值將不再發(fā)生變化。故在實(shí)際操作過程中，應(yīng)仔細(xì)觀察電流變化。當(dāng)電流接近穩(wěn)定值時(shí)應(yīng)停止洗脫進(jìn)行第三步操作。第三步為毛細(xì)管電泳法分離分析第二步中富集的蛋白質(zhì)。通過上述操作，便可以實(shí)現(xiàn)對毛細(xì)管內(nèi)壁吸附的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫、富集并分離檢測。因?yàn)橹频玫拿?xì)管柱具有較高的吸附容量，且此法可將整個(gè)管柱上吸附的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫富集，故該方法對蛋白質(zhì)具有較好的富集效果，可以在很大程度上提高蛋白質(zhì)毛細(xì)管電泳的檢測靈敏度。本發(fā)明所介紹的蛋白質(zhì)富集分離分析方法與其它類型的富集分離分析方法相比有如下優(yōu)點(diǎn)第一，陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱可以提供較大的比表面積和較高的離子交換配基修飾密度，因此可以在很大程度上提高蛋白質(zhì)的吸附容量，近而提高富集倍數(shù)；第二，本發(fā)明介紹的蛋白質(zhì)富集方法的樣品進(jìn)樣量不局限于一倍柱體積，即可以多倍柱體積進(jìn)樣，故適用于低豐度蛋白質(zhì)樣品的分離分析；第三，本發(fā)明介紹的蛋白質(zhì)富集分離方法可以對蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行富集分離分析操作；第四，本發(fā)明介紹的方法操作簡便，在現(xiàn)有的商品化的毛細(xì)管電泳設(shè)備上便可實(shí)現(xiàn)。圖1:本發(fā)明介紹的陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱制備圖2:本發(fā)明介紹的蛋白質(zhì)在線富集毛細(xì)管電泳分析方法示意圖3:1.0Ug/ml肌紅蛋白樣品的毛細(xì)管電泳在線富集分析譜圖4:0.4yg/ml肌紅蛋白和0.4yg/ml胰島素混合物的毛細(xì)管電泳在線富集分離譜圖。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)例將對本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說明。實(shí)施例l:陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱的制備用1MNaOH溶液沖洗未經(jīng)任何處理的毛細(xì)管15min，隨后兩端用硅橡膠封口，100°C反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后用水沖洗毛細(xì)管至管內(nèi)流出的液體pH值為7，隨后分別用lMHCl洗5min，水洗15min，甲醇洗15min，然后用氮?dú)獯迪疵?xì)管5h。接下來，向上步制得的毛細(xì)管內(nèi)通入含lmg/mlDPPH以及30%v/vY-MPS的二甲基呋喃溶液，管柱兩端封口后在120。C的油浴中反應(yīng)6h。反應(yīng)完成后，管柱用甲醇沖洗，隨后氮?dú)獯蹈?。隨后，用含1mg/ml偶氮二異丁氰，10。/。v/v甲基丙烯酸縮水甘油酯的甲苯溶液沖洗管柱15min，然后管柱兩端封口80。C反應(yīng)10h。隨后用分別用甲苯、甲醇沖洗管柱，最后管柱用氮?dú)獯蹈?。接下來，向上步制得的管柱中通入?.1g/L亞硫酸鈉及2%v/v異丙醇的水溶液，管柱兩端封口后室溫反應(yīng)三天，三天后用管柱分別用水、甲醇洗，最后氮?dú)獯蹈蓚溆?。陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱的制備方法如圖l所示。實(shí)施例2:制得甲級丙烯酸縮水甘油酯接枝涂層的毛細(xì)管柱(制備方法如下來實(shí)施例l)，隨后向制得的管柱中通入含0.2g/L亞硫酸鈉及4%v/v異丙醇的水溶液，管柱兩端封口后室溫反應(yīng)兩天，兩天后用管柱分別用水、甲醇洗，最后氮?dú)獯蹈蓚溆?。?shí)施例3:制得甲級丙烯酸縮水甘油酯接枝涂層的毛細(xì)管柱(制備方法如下來實(shí)施例1)，隨后向制得的管柱中通入含0.3g/L亞硫酸鈉及6%v/v異丙醇的水溶液，管柱兩端封口后室溫反應(yīng)一天，一天后用管柱分別用水、甲醇洗，最后氮?dú)獯蹈蓚溆?。?shí)施例4:采用實(shí)施例1的陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱。蛋白質(zhì)樣品陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱上富集毛細(xì)管電泳分離分析毛細(xì)管柱為內(nèi)徑50um，總長40.2cm，有效長度30cm的陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱。蛋白質(zhì)樣品1:含有1Pg/ml肌紅蛋白的pH4.2的磷酸緩沖液。蛋白質(zhì)樣品2:含有0.4yg/ml肌紅蛋白和0.4ug/ml胰島素的5mMpH4.2的磷酸緩沖液。洗脫緩沖液為20mMpH9.2的磷酸緩沖液。實(shí)驗(yàn)過程中毛細(xì)管電泳儀循環(huán)冷卻液的溫度為25。C。紫外檢測器的檢測波長為200nm。蛋白質(zhì)樣品陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱上在線富集毛細(xì)管電泳分析操作如下首先將蛋白質(zhì)樣品溶液壓力進(jìn)樣，20psi，3min。隨后，將毛細(xì)管兩端置于裝有洗脫緩沖液的緩沖瓶內(nèi)，在毛細(xì)管兩端加上-20kv的電壓。觀察毛細(xì)管內(nèi)電流變化，當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)電流值為32nA時(shí)，停止加壓。這步操作可將進(jìn)樣過程中吸附在管壁的蛋白質(zhì)洗脫并富集于毛細(xì)管進(jìn)口處。最后，在毛細(xì)管柱兩端加上20kV電壓，對富集的蛋白質(zhì)進(jìn)行毛細(xì)管電泳操作。對蛋白質(zhì)樣品1的富集分析結(jié)果如圖3所示，1yg/ml肌紅蛋白仍有較大的檢測信號。對蛋白質(zhì)樣品2的富集分析結(jié)果如圖4所示，0.4ug/ml肌紅蛋白和0.4ug/ml胰島素的混合物用本發(fā)明介紹的方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)富集及分離。本發(fā)明提出的陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管及用于蛋白質(zhì)在線富集分析方法，已通過現(xiàn)場較佳實(shí)施例子進(jìn)行了描述，相關(guān)技術(shù)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。權(quán)利要求1.陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱的制備方法，包括毛細(xì)管預(yù)處理、乙烯基化毛細(xì)管內(nèi)壁、甲基丙烯酸縮水甘油酯原位接枝反應(yīng)以及磺酸基修飾反應(yīng)，其特征在于磺酸基修飾反應(yīng)是向制得的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝修飾的管柱中通入含0.1-0.3g/l亞硫酸鈉及2-6％v/v異丙醇的水溶液，管柱兩端封口后室溫反應(yīng)1-3天，隨后用管柱分別用水、甲醇洗，最后氮?dú)獯蹈蓚溆?，便制得了陰離子聚合物接枝涂層的毛細(xì)管柱。2.利用權(quán)利要求1制備的陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管柱進(jìn)行蛋白質(zhì)在線富集分析方法，其特征在于-第一步為大體積壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣條件為20psi，3min;樣品溶液在壓力的驅(qū)動下進(jìn)入毛細(xì)管，進(jìn)樣過程中帶有正電荷的蛋白質(zhì)分子會吸附到陰離子聚合物接枝涂層的毛細(xì)管內(nèi)壁上；第二步為反向電滲流洗脫富集蛋白質(zhì)，反向電滲流富集電壓為20kV，即將上步中吸附在管壁的蛋白質(zhì)分子用pH大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的溶液將其反向洗脫下來，蛋白質(zhì)樣品會在樣品溶液和洗脫緩沖液的界面處富集；當(dāng)電流的絕對值為32.5uA時(shí)停止加壓；第三步為毛細(xì)管電泳法分離分析第二步中富集的蛋白質(zhì)，運(yùn)行緩沖液為pH9.2的20mM磷酸緩沖液。3.按照權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于所述的樣品溶液是為蛋白質(zhì)溶于pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH4.2，5mM磷酸緩沖液。4.按照權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于所述的洗脫緩沖液為pH值大于分析蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH9.2的20mM磷酸緩沖液。5.按照權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于所述的管柱管柱溫度:25°C，檢測波長200nm。全文摘要本發(fā)明涉及制備陰離子聚合物接枝涂層毛細(xì)管及其蛋白質(zhì)在線富集毛細(xì)管電泳分析方法，包括毛細(xì)管預(yù)處理、乙烯基化毛細(xì)管內(nèi)壁、甲基丙烯酸縮水甘油酯原位接枝反應(yīng)以及磺酸基修飾反應(yīng)，其中磺酸基修飾反應(yīng)是向制得的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝修飾的管柱中通入含0.1-0.3g/l亞硫酸鈉及2-6％v/v異丙醇的水溶液，管柱兩端封口后室溫反應(yīng)1-3天，隨后用管柱分別用水、甲醇洗，最后氮?dú)獯蹈?，便制得了陰離子聚合物接枝涂層的毛細(xì)管柱。采用陰離子聚合物涂層的毛細(xì)管柱萃取樣品溶液中的蛋白質(zhì)溶質(zhì)，并用反向電滲流將吸附的蛋白質(zhì)洗脫并富集于管柱進(jìn)口，隨后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離操作。本方法可以多倍柱體積樣品進(jìn)樣，故可以用于低豐度蛋白質(zhì)樣品溶液的分離分析。文檔編號G01N33/48GK101358946SQ20081015125公開日2009年2月4日申請日期2008年9月8日優(yōu)先權(quán)日2008年9月8日發(fā)明者史清洪,彥孫,亮徐,姝白,董曉燕申請人:天津大學(xué)