專利名稱：一種基于可視化蛋白芯片的食物過敏原檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可視化蛋白芯片的檢測方法，特別是涉及食品過敏原的快速及通
量化檢測。
背景技術(shù)：
食物過敏原通常是一些水溶性或鹽溶性糖蛋白，傾向于耐熱、耐酸、耐酶解(果蔬 過敏原例外)，在簡單的加工或消化過程中不會被破壞掉，仍會引發(fā)過敏癥，其癥狀輕則出 現(xiàn)皮膚騷癢、腹瀉等問題，重則發(fā)生休克死亡，故而食物過敏原的檢測有著重大的意義。目 前，食物過敏原的常用檢測方法主要有如下幾種 1、皮膚試驗(yàn)法，主要指劃痕試驗(yàn)、點(diǎn)剌試驗(yàn)、皮內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)，該法雖快捷，但結(jié)果的 特異性和敏感性差，給患者造成痛苦，不安全和不易定量等問題，常造成假陽性和假陰性結(jié) 果。 2、雙盲實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確度較高，但是由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)不確定性因素較多，而且給患者造成 較大的不便和痛苦。 3、基因法，該法雖然檢測限比較低，方法靈敏，但假陽性率相對較高，且操作麻煩。
4、免疫法，主要有放射過敏原吸附抑制試驗(yàn)，、免疫雜交電泳、酶聯(lián)免疫等。其中 放射性的危險限制了放射過敏原吸附抑制試驗(yàn)的廣泛應(yīng)用，免疫雜交電泳存在定量難的問 題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏、快速、簡便、通量化、特異性好的應(yīng)用于食品過敏 原的可視化蛋白芯片檢測方法，所需樣本極微量，檢測成本低。
本發(fā)明所提供的可視化蛋白芯片檢測方法，包括如下步驟
1)以手動式點(diǎn)樣儀將捕獲抗體點(diǎn)至瓊脂糖三維基片上； 2)待測抗原與預(yù)制好的蛋白芯片進(jìn)行雜交，加入以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的 待測蛋白的檢測抗體； 3)加入沉淀型TMB與蛋白芯片進(jìn)行雜交，然后以H2S04或水洗終止反應(yīng)，檢測樣品 點(diǎn)處的色素沉積。 其中，HRP標(biāo)記的待測蛋白檢測抗體的方法參照文獻(xiàn)(PAUL K.NAKANE ANDAKIRA KAWAOI， THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY ANDCYTOCHEMISTRY，1974，22(12) :1084-1091) 制備，HRP標(biāo)記抗體的使用濃度為0. 5-5ug/ml， H2S04濃度為2mol/L。 本發(fā)明方法能應(yīng)用于食物過敏原的快速可視檢測，能檢測到待檢蛋白的蛋白芯片 含有食物過敏原的兔多克隆抗體。 辣根過氧化物酶(HRP) —種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，具有來源廣泛，標(biāo)記操作簡 便，標(biāo)記效率高等特點(diǎn)。本發(fā)明利用辣根過氧化物酶作為待測蛋白檢測抗體的標(biāo)記物，加入 的沉淀型TMB (3， 3' 5， 5——四甲基聯(lián)苯胺)在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和待測蛋白的量呈正相關(guān)。本方法操作簡單，能同 時實(shí)現(xiàn)對多個待檢樣本的檢測，其檢測限可達(dá)到10ng/ml以下，與熒光檢測的靈敏度相當(dāng)， 并且具有設(shè)備簡易，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。


圖1蛤蜊過敏原濃度與灰度值間的關(guān)系圖
圖2海魚過敏原濃度與灰度值間的關(guān)系圖
圖3芯片重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、蛤蜊及海魚魚過敏原的檢測
1、制備抗體蛋白芯片 蛋白芯片的制備方法參見文獻(xiàn)(金世輝、劉必成，張春秀等，中國生物工程雜志， 2005， 25 (2) :57-60)，所用的蛤蜊、海魚抗原及其捕獲抗體均為實(shí)驗(yàn)室自制。
2、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記檢測抗體 將抗蛤蜊及海魚抗原的鼠單克隆抗體參照文獻(xiàn)(PAUL K. NAKANE ANDAKIRA KAWAOI， THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY ANDCYTOCHEMISTRY,1974，22(12) :1084-1091)
中所述的方法進(jìn)行標(biāo)記。
3、芯片雜交 將抗體蛋白芯片放入芯片反應(yīng)盒內(nèi)，加入不同濃度待測的蛤蜊及海魚抗原樣品， 25ul/區(qū)域，蛤蜊及海魚抗原濃度為10，50，100，500ng/ml，l，5，10ug/ml，孵育1小時后，加 入2ug/ml的HRP標(biāo)記的抗蛤蜊的鼠單克隆抗體，15ul/區(qū)域，孵育1小時，加入TMB顯色液， 避光作用20min，后以2mol/L硫酸終止使其變成褐色的可目視檢測的樣點(diǎn)。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測 以平板掃描儀掃描獲得檢測圖像，數(shù)據(jù)采用軟件處理獲得各點(diǎn)的灰度值。 各檢測點(diǎn)的灰度與過敏原的濃度關(guān)系如圖1和圖2所示。圖1為蛤蜊過敏原濃度
與灰度值的關(guān)系圖，圖2為海魚過敏原濃度與灰度值的關(guān)系圖。由圖1和圖2可見，利用HRP
標(biāo)記鼠單克隆抗體，采用雙抗夾心式雜交方法，具有較高的檢測靈敏度，對10ng/ml的蛤蜊
及海魚抗原均能較好地檢出。 實(shí)施例2、芯片的重復(fù)性 1、制備抗體蛋白芯片 蛋白芯片的制備方法參見文獻(xiàn)(金世輝、劉必成，張春秀等，中國生物工程雜志， 2005， 25 (2) :57-60)，采用兔抗蛤蜊制備抗體芯片。
2、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記檢測抗體 將抗蛤蜊抗原的鼠單克隆抗體參照文獻(xiàn)(PAUL K. NAKANE AND AKIRAKAWAOI， THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY ANDCYTOCHEMISTRY, 1974， 22 (12) :1084-1091)中所述的方法 進(jìn)行標(biāo)記。 3、芯片雜交 將抗體蛋白芯片放入芯片反應(yīng)盒內(nèi)，加入三個不同濃度待測的蛤蜊抗原樣品，25ul/區(qū)域，蛤蜊抗原濃度分別為5， 10， 15ng/ml。設(shè)三個平行的芯片，每個芯片上每個濃度 重復(fù)兩個區(qū)域，每個區(qū)域設(shè)9個點(diǎn)樣點(diǎn)，與芯片反應(yīng)1小時后，加入HRP標(biāo)記的抗蛤蜊的鼠 單克隆抗體，15u1/區(qū)域，孵育1小時，加入TMB顯色液，避光作用20min，后以2mol/L的硫 酸終止使其變成褐色的可目視檢測的樣點(diǎn)。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測 以平板掃描儀掃描獲得檢測圖像，數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點(diǎn)的灰度值。
由圖3可見，該檢測方法的重復(fù)性較好。
實(shí)施例3芯片的特異性檢測
1、制備抗體蛋白芯片 蛋白芯片的制備方法參見文獻(xiàn)(金世輝、劉必成，張春秀等，中國生物工程雜志， 2005， 25 (2) :57-60)，采用兔抗蛤蜊制備抗體芯片。
2、檢測的抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記 將抗蛤蜊抗原的鼠單克隆抗體參照文獻(xiàn)(PAUL K. NAKANE AND AKIRAKAWAOI， THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, 1974， 22 (12) :1084-1091)中所述的方
法進(jìn)行標(biāo)記。 3、芯片雜交 將抗體蛋白芯片放入芯片反應(yīng)盒內(nèi)，分別加入10ng/ml的牛奶、南美白對蝦、海魚 及蛤蜊過敏原，25ul/區(qū)域，設(shè)三個平行的芯片，每個芯片上每種過敏原重復(fù)兩個區(qū)域，每個 區(qū)域設(shè)9個點(diǎn)樣點(diǎn)，與芯片反應(yīng)l小時后，加入HRP標(biāo)記的抗蛤蜊的鼠單克隆抗體，15ul/區(qū) 域，孵育1小時，加入TMB顯色液，避光作用20min，后以2mol/L的硫酸終止，使其變成褐色 的可目視檢測的樣點(diǎn)。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測 以平板掃描儀掃描獲得檢測圖像，數(shù)據(jù)采用軟件處理可獲得各點(diǎn)的灰度值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該法特異性較強(qiáng)。
權(quán)利要求
一種基于可視化蛋白芯片的食物過敏原檢測方法，包括如下的步驟1)以手動式點(diǎn)樣儀在基片上點(diǎn)制3×3的矩陣。2)待測抗原與預(yù)制好的蛋白芯片進(jìn)行雜交，加入以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的待測蛋白的檢測抗體；3)加入沉淀型TMB(3，3’5，5-四甲基聯(lián)苯胺)與蛋白芯片進(jìn)行雜交，然后以H2SO4或水洗終止反應(yīng)，檢測樣品點(diǎn)處的色素沉積。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述步驟1中的基片為表面鋪有瓊脂糖的玻片。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述步驟l中的點(diǎn)陣，水平方向點(diǎn)距為1250iim，豎直方向點(diǎn)間間距 為750 ii m，點(diǎn)的大小為500-1000 ii m。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述HRP標(biāo)記抗體方法參照文獻(xiàn) (PAUL K. NAKANE AND AKIRA KAWAOI，THEJOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, 1974,22(12) :1084-1091) ， HRP標(biāo)記抗體的使用濃度為0. 5_5ug/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的步驟3中的H2S04濃度為2mol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述待測蛋白為食物過敏原，所述能 檢測到待檢蛋白的蛋白芯片含有該待檢蛋白的抗體(兔抗)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白芯片的檢測方法。本發(fā)明所提供的蛋白芯片檢測方法，包括如下步驟1)以手動點(diǎn)樣儀點(diǎn)制所需的抗體芯片；2)以辣根過氧化物酶標(biāo)記待測蛋白的抗體，與芯片進(jìn)行雜交；3)加入沉淀型TMB顯色液進(jìn)行反應(yīng)，掃描并分析樣點(diǎn)的灰度值。本發(fā)明方法重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，敏感性高，操作簡便，可以實(shí)現(xiàn)對多種待測蛋白的同時檢測，所需樣本極微量，結(jié)果形象、直觀，無需昂貴的檢測設(shè)備，成本低廉。
文檔編號G01N33/543GK101738469SQ20081015924
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日
發(fā)明者張軼群, 李小燕, 李振興, 林洪 申請人:中國海洋大學(xué)