專利名稱：蘋果多酚氧化酶的提取及測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于蘋果多酚氧化酶的提取和測(cè)定方法，屬于天然藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酶促褐變是果蔬加工過程中普遍存在的一種現(xiàn)象。酶促反應(yīng)的發(fā)生不僅影響產(chǎn)品 的外觀品質(zhì)，同時(shí)營養(yǎng)成分及風(fēng)味也會(huì)發(fā)生很大的變化，使產(chǎn)品質(zhì)量下降，影響到產(chǎn)品的銷 售和企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。尤其是發(fā)生在肉質(zhì)顏色較淺的水果、蔬菜上的酶促褐變更為顯著。在 熱帶鮮果中，酶促褐變導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)50%。 酶促褐變反應(yīng)非常迅速，甚至在極短的時(shí)間內(nèi)便可發(fā)生。酶促褐變產(chǎn)生的原因主 要是當(dāng)果蔬受到機(jī)械損傷或處于不良環(huán)境，如受凍、受熱時(shí)，尤其是在加工過程中，果蔬內(nèi) 的多酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的催化作用下氧化而呈現(xiàn)褐色。這些多酚類物質(zhì)包括鄰苯二酚 (兒茶酚)、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸等，它們?cè)谕暾募?xì)胞中作為呼吸傳遞物質(zhì)，在酚_醌 之間保持著動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)新鮮的果蔬組織被損傷，氧大量侵入，酶原被激活，鄰苯二酚類 物質(zhì)經(jīng)酶的催化作用氧化為鄰苯醌類化合物，該化合物進(jìn)一步聚合形成復(fù)雜聚合物黑素 (melanin)。 酶促褐變反應(yīng)的發(fā)生必須具備三個(gè)條件多酚類物質(zhì)、多酚氧化酶和氧。決定酶 促褐變率的最重要的因素即為組織中活性多酚氧化酶和酚類化合物的濃度、可利用的氧含 量、pH值和溫度等。 多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,簡(jiǎn)稱PP0)的系統(tǒng)命名是鄰二酚氧-氧化還原 酶，廣泛分布于自然界。多酚氧化酶是一種含銅的酶，必需以氧為受氫體，是一種末端氧化 酶。人們普遍認(rèn)為多酚氧化酶是兩種酶的復(fù)合體(1)酚羥化酶，又叫甲酚酶(cresolase)。 催化一元酚羥基化反應(yīng)，生成相應(yīng)的鄰一二羥基化合物。(2)多元酚氧化酶，又叫兒茶酚酶 (catecholase)。催化鄰_ 二酚氧化，生成鄰_醌。以上兩類反應(yīng)都需要有分子氧的參加。 由果蔬酶促褐變產(chǎn)生的機(jī)理可知，抑制酶促褐變可從三方面人手(l)減少多酚類物質(zhì)的 含量；(2)控制多酚氧化酶的活性；(3)降低氧濃度，從而控制褐變的發(fā)生。
果蔬的酶促褐變主要是由于多酚氧化酶催化酚類物質(zhì)氧化而造成的。
世界蘋果年產(chǎn)量約為3，200萬公噸。美國所產(chǎn)的蘋果通常有一半鮮食；約l/5用以 制醋、果汁、果凍、蘋果泥等；約1/6做成罐裝蘋果醬及用作餡餅原料。在歐洲，很大部分蘋 果用制蘋果酒和白蘭地。用制蘋果酒的蘋果占世界產(chǎn)量的1/4。美國、中國、法國、意大利和 土耳其是最大的生產(chǎn)國，法國、義大利、匈牙利、阿根廷、智利、南非和美國是最大的輸出國。 蘋果富含碳水化合物和維生素A、C，所含纖維量多，亦為身體所必需。1.蘋果中的膠質(zhì)和 微量元素鉻能保持血糖的穩(wěn)定，還能有效地降低膽固醇；2.在空氣污染的環(huán)境中，多吃蘋 果可改善呼吸系統(tǒng)和肺功能，保護(hù)肺部免受污染和煙塵的影響；3.蘋果中含的多酚及黃酮 類天然化學(xué)抗氧化物質(zhì)，可以減少肺癌的危險(xiǎn)，預(yù)防鉛中毒；4.蘋果特有的香味可以緩解 壓力過大造成的不良情緒，還有提神醒腦的功效；5.蘋果中富含粗纖維，可促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)， 協(xié)助人體順利排出廢物，減少有害物質(zhì)對(duì)皮膚的危害；6.蘋果中含有大量的鎂、硫、鐵，銅、碘、錳、鋅等微量元素，可使皮膚膩、潤滑、紅潤有光澤。 蘋果營養(yǎng)豐富，是人們非常喜愛的水果之一。蘋果中富含多酚類物質(zhì)和多酚氧化 酶，在蘋果的保鮮過程中，多酚氧化酶能催化酚類物質(zhì)氧化發(fā)生酶促褐變反應(yīng)，使蘋果的品 質(zhì)發(fā)生變化。如果能將蘋果中的多酚氧化酶提取出來，那么對(duì)于高濃度蘋果汁、蘋果醬、蘋 果酒等蘋果加工產(chǎn)品的生產(chǎn)將具有重要意義。在本發(fā)明完成之前，未發(fā)現(xiàn)有對(duì)蘋果多酚氧 化酶提取并測(cè)定的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種蘋果多酚氧化酶的提取測(cè)定方法。
本發(fā)明的目的之二是為果蔬類產(chǎn)品的保鮮技術(shù)的開發(fā)提供一些資料。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下 1.多酚氧化酶(polyphenol oxidase,簡(jiǎn)稱PP0)的提取 蘋果洗凈后在低溫下保溫，再去皮去核后取其果肉，立即加入冷丙酮，用高速組織 搗碎機(jī)勻漿2min，而后用布氏漏斗抽濾濾餅用前一次1/2量的冷凍丙酮再次提取抽濾，得 到的白色物質(zhì)冷凍真空干燥，即得PP0丙酮粉。 稱取丙酮粉，溶于的預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液中，用磁力攪拌器攪拌離心，上清液過
濾，即得蘋果PPO粗酶液。 2.多酚氧化酶測(cè)定方法在lml磷酸氫二鉀-擰檬酸緩沖液中，用lm10. lmol/L鄰苯二酚為底物，加lml酶 提取液，反應(yīng)3min后，在分光光度儀掃描并觀察吸收峰情況。測(cè)定時(shí)以水為空白，以熱失活 的粗酶液代替粗酶液在同樣條件下測(cè)定為對(duì)照。
3.PP0活性的測(cè)定 取磷酸鹽緩沖溶液lml于lcm比色皿中，加人0. lmol/L鄰苯二酚溶液lml。混勻 后在400mm處比色，從酶液加入后開始記時(shí)，每15s記錄一次0D隨時(shí)間的變化值，以最初直 線段的斜率(A0D/t)表求酶活力，一個(gè)酶活力單位(U)定義為在測(cè)定條件下，每分鐘引起 吸光度改變0. 001所需的酶量。 本發(fā)明采用有機(jī)溶劑提取蘋果中的多酚氧化酶，并用分光光度計(jì)對(duì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn) 行鑒定。然后用比色法測(cè)定PP0活性。多酚氧化酶的提取對(duì)于高濃度蘋果汁、蘋果醬、蘋果 酒等蘋果加工產(chǎn)品的生產(chǎn)將具有重要意義。另外，還可以將提取出來的多酚氧化酶對(duì)其進(jìn) 行抑制作用研究，尋找更佳的果蔬保鮮劑。
權(quán)利要求
蘋果多酚氧化酶的提取及測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟(1)多酚氧化酶(簡(jiǎn)稱PPO)的提取蘋果洗凈后在低溫下保溫，再去皮去核后取其果肉，立即加入冷丙酮，用高速組織搗碎機(jī)勻漿2min，而后用布氏漏斗抽濾濾餅用前一次1/2量的冷凍丙酮再次提取抽濾，得到的白色物質(zhì)冷凍真空干燥，即得PPO丙酮粉。稱取丙酮粉，溶于的預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液中，用磁力攪拌器攪拌離心，上清液過濾，即得蘋果PPO粗酶液。(2)多酚氧化酶測(cè)定方法在1ml磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液中，用1ml0.1mol/L鄰苯二酚為底物，加1ml酶提取液，反應(yīng)3min后，在分光光度儀掃描并觀察吸收峰情況。測(cè)定時(shí)以水為空白，以熱失活的粗酶液代替粗酶液在同樣條件下測(cè)定為對(duì)照。(3)PPO活性的測(cè)定取磷酸鹽緩沖溶液1ml于1cm比色皿中，加人0.1mol/L鄰苯二酚溶液1ml?；靹蚝笤?00mm處比色，從酶液加入后開始記時(shí)，每15s記錄一次OD隨時(shí)間的變化值，以最初直線段的斜率(ΔOD/t)表求酶活力，一個(gè)酶活力單位(U)定義為在測(cè)定條件下，每分鐘引起吸光度改變0.001所需的酶量。
2. 根據(jù)權(quán)利1中所述的蘋果洗凈后在低溫下保溫，再去皮去核后取其果肉，立即加入冷丙酮，其特征在于蘋果的保溫溫度為4t:，保溫時(shí)間為4h ;加入冷丙酮的量為7ml/g蘋果。
3. 根據(jù)權(quán)利1中所述的稱取丙酮粉，溶于的預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液中，其特征在于磷酸緩沖液(m):丙酮粉(v) = 100 : 1，濃度為0.05mol/L，pH 6. 8，溫度4°C ，且包含有含2% 的PVPP(聚己烯吡咯烷酮)和0. 25% Triton X100。
4. 根據(jù)權(quán)利1中所述的用磁力攪拌器攪拌離心，上清液過濾，其特征在于攪拌時(shí)間 20min，速率5000r/min，離心10min。
5. 根據(jù)權(quán)利1中所述的在分光光度儀掃描并觀察吸收峰情況，其特征在于分光光度 計(jì)的掃描波長為300-450nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蘋果多酚氧化酶的提取及測(cè)定方法。蘋果冷凍后取其果肉，加入冷丙酮，用高速組織搗碎機(jī)搗成勻漿，抽濾，濾餅用冷凍丙酮再次提取抽濾，得到的白色物質(zhì)真空干燥，即得PPO丙酮粉。將丙酮粉溶于磷酸鹽緩沖溶液中，用磁力攪拌器攪拌離心，上清液過濾，即得粗酶液。然后用分光光度儀掃描觀察吸收峰情況確定物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。最后采用比色法測(cè)定PPO的活性。
文檔編號(hào)G01N21/25GK101760453SQ200810162969
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者吳菁, 陳群 申請(qǐng)人:湖州來色生物基因工程有限公司;吳菁