專利名稱：一種同時(shí)分析氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及色譜分析技術(shù)，特別提供了一種通過毛細(xì)管電泳一質(zhì)譜聯(lián)用法 同時(shí)分析生物樣品中氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜的方法。
背景技術(shù)：
氨基酸和有機(jī)酸是代謝組學(xué)研究中重要的代謝物，與糖、脂、蛋白質(zhì)和核 酸的代謝密切相關(guān)，研究表明人體內(nèi)氨基酸和有機(jī)酸的濃度變化與多種疾病有 密切關(guān)系。現(xiàn)有檢測(cè)氨基酸的方法主要是以離子交換色譜、高效液相色譜、氣 相色譜、毛細(xì)管電泳等為分離手段，以紫外或熒光檢測(cè)器為檢測(cè)方法，由于氨 基酸和有機(jī)酸大都紫外吸收較弱或無(wú)紫外吸收，不易氣化，因此用前述四種方 法時(shí)均需要衍生化步驟，操作繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)或靈敏度低，難以同時(shí)檢測(cè)常 見的幾十種氨基酸和有機(jī)酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)存在的不足，提供一種尿液中同時(shí)分析氨基酸和有機(jī) 酸代謝物譜的方法。本發(fā)明方法是將生物樣本經(jīng)常規(guī)沉蛋白處理后，采用毛細(xì) 管電泳為分離手段，檢測(cè)器選擇通用性強(qiáng)、靈敏度高的質(zhì)譜檢測(cè)器。本發(fā)明通 過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1) 樣品預(yù)處理
取樣品(尿液)200 pL，加入20 內(nèi)標(biāo)液及400 甲醇，于旋渦混合 器上混合5 min， 12000 r/min離心10min，移取500 上清液，于離心濃縮儀 離心濃縮至干，殘?jiān)尤?00 |iL水溶解后，12000 r/min離心10min取上清液 進(jìn)樣分析(用于標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液處理方式同樣品)。
標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)溶液制備分別取各氨基酸、有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，
用水或含一定濃度氨水的水溶液溶解。作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液。低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 溶液通過用適量水稀釋儲(chǔ)備溶液得到。取適量鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定， 用水溶解，作為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。
(2) 毛細(xì)管電泳一質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定
A.毛細(xì)管電泳條件緩沖液含有3.0-6.0%甲酸和2.5-15%甲醇，分離 電壓為15-18kV，分離溫度為25。C，程序進(jìn)樣50mbar壓力下進(jìn)14。/。的濃氨水(v/v) 0-3秒后，再于50mbar壓力下進(jìn)樣品溶液40秒，
B.質(zhì)譜條件SIM模式檢測(cè)，鞘液為含80-90%甲醇和0.05%甲酸的溶 液，流速為3 ^iL/min，霧化氣壓力為2 - 4 psig，干燥氣流速和溫度分別為7 - 8 L/min和250-275°C，毛細(xì)管電壓為4500V，各氨基酸、有機(jī)酸及內(nèi)標(biāo)碎片電 壓均為10-70V。
本發(fā)明是一種不需要衍生化步驟，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，選擇性好，普適 性強(qiáng)的能夠同時(shí)測(cè)定生物樣品中22種氨基酸和5種有機(jī)酸的分析方法。本發(fā) 明的方法具有良好的精密度(日內(nèi)4.96-14.93%，日間6.22-14.03%)和回 收率(高濃度83.62-111.41°/。，中濃度81.73-105.50%，低濃度80.17-110.94%), 檢測(cè)限為0.80- 2562 ng/mL。


圖1是22種氨基酸和5種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的總離子流色譜圖 (TIC)。
圖2是22種氨基酸和5種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的選擇離子色譜圖。 圖3是正常人尿液中氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜分析的總離子流色譜圖 (TIC)。
圖4是正常人尿液中氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜分析的選擇離子色譜圖。 圖5是乳腺癌病人尿液中氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜分析的總離子流色譜圖 (TIC)。
圖6是乳腺癌病人尿液中氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜分析的選擇離子色譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。 實(shí)施例1
樣品預(yù)處理取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 iliL，加入400iliL甲醇，于渦旋混合 器上混合2min， 12000 r/min離心10min，移取500 上清液，于離心濃縮儀 離心濃縮至干，殘?jiān)尤?00 fxL水充分溶解后，12000 r/min離心10min取上
清液進(jìn)樣分析。
標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)溶液制備分別取各氨基酸、有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品約1.0-8.0mg， 精密稱定，用水或含一定1%濃度氨水的水溶液溶解，制成濃度分別為1.0 - 8.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液。臨用前，用水稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取 鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品約1.0 mg，精密稱定，用水溶解，制成濃度為0.01 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。
毛細(xì)管電泳條件緩沖液含有6.0°/。甲酸和6%甲醇，分離電壓為15kV， 分離溫度為25i:。進(jìn)樣50mbar壓力下進(jìn)樣品溶液40s。
質(zhì)譜條件SIM模式檢測(cè)，m/z值見表l;鞘液為含80%甲醇和0.05%甲 酸的溶液，流速為3pL/min;霧化氣壓力為4psig;干燥氣流速和溫度分別為 7 L/mki和275 °C;毛細(xì)管電壓為4500V;各氨基酸、有機(jī)酸及內(nèi)標(biāo)碎片電壓 均為10。
表lSIM離子的m/z及其對(duì)應(yīng)的代謝物名稱
離子質(zhì)荷比 物質(zhì)名稱離子質(zhì)荷比物質(zhì)名稱
76甘氨酸135蘋果酸
90P-丙氨酸、丙氨酸147賴氨酸、谷氨酰胺
104卩-氨基異丁酸148谷氨酸
1053-羥基丁酸150甲硫氨酸
106絲氨酸156組氨酸
116輔氨酸166苯丙氨酸
118纈氨酸175精氨酸
119琥珀酸182酪氨酸
120蘇氨酸193檸檬酸
122半胱氨酸205色氨酸
132肌酸、亮氨酸、異亮氨酸241胱氨酸
133鳥氨酸352鹽酸巴馬汀(內(nèi)標(biāo))
134天冬氨酸
應(yīng)用毛細(xì)管電泳一質(zhì)譜法對(duì)22個(gè)氨基酸和5個(gè)有機(jī)酸進(jìn)行分析，分析結(jié)
果參見附圖1和圖2。圖2中1:甘氨酸，2: |3-丙氨酸，3:丙氨酸，4: p-氨基異丁酸，5: 3-羥基丁酸，6:絲氨酸，7:輔氨酸，8:纈氨酸，9:琥珀 酸，10:蘇氨酸，11:半胱氨酸，12:肌酸，13:亮氨酸，14:鳥氨酸，15: 天冬氨酸，16:蘋果酸，17:賴氨酸，18:谷氨酰胺，19:谷氨酸，20:甲硫 氨酸，21:組氨酸，22:苯丙氨酸，23:精氨酸，24:酪氨酸，25:檸檬酸， 26:色氨酸，27:胱氨酸。
實(shí)施例2
樣品預(yù)處理取正常人尿液200 L，加入400 L甲醇，于渦旋混合器上混 合2 min， 12000 r/min離心10min，移取500 L上清液，于離心濃縮儀離心濃 縮至干，殘?jiān)尤?00L水充分溶解后，12000 r/min離心10min取上清液進(jìn)樣 分析。
5毛細(xì)管電泳條件緩沖液含有4.0%甲酸和15%甲醇，分離電壓為15kV， 分離溫度為25。C。進(jìn)樣50mbar壓力下進(jìn)樣品溶液40s。 質(zhì)譜條件同實(shí)施例l。
應(yīng)用毛細(xì)管電泳一質(zhì)譜法對(duì)正常人尿液中氨基酸和有機(jī)酸進(jìn)行分析，結(jié)果 參見附圖3和圖4。圖4中1:甘氨酸，2: P-丙氨酸，3:丙氨酸，4: P-氨基異丁酸，5: 3-羥基丁酸，6:絲氨酸，7:輔氨酸，8:纈氨酸，9:琥珀 酸，10:蘇氨酸，11:半胱氨酸，12:肌酸，13:亮氨酸，14:鳥氨酸，15: 天冬氨酸，17:賴氨酸，18:谷氨酰胺，19:谷氨酸，20:甲硫氨酸，21: 組氨酸，22:苯丙氨酸，23:精氨酸，24:酪氨酸，25:檸檬酸，26:色氨酸， 27:胱氨酸
實(shí)施例3
樣品預(yù)處理取乳腺癌病人尿液200 L，加入400 L甲醇，于渦旋混 合器上混合5min， 12000 r/min離心10min，移取500 L上清液，于離心濃 縮儀離心濃縮至干，殘?jiān)尤?00 L水充分溶解后，12000 r/min離心10min
取上清液進(jìn)樣分析。
毛細(xì)管電泳條件緩沖液含有4.0°/。甲酸和2.5%甲醇，分離電壓為18kV, 分離溫度為25"C。進(jìn)樣50 mbar壓力下進(jìn)14°/。的濃氨水(v/v) 3 s后，再于 50 mbar壓力下進(jìn)樣品溶液40 s。
質(zhì)譜條件SIM模式檢測(cè)，m/z值如表1所示；鞘液為含80%甲醇和0.05% 甲酸的溶液，流速為3 L/min;霧化氣壓力為2psig;干燥氣流速和溫度分別 為8L/min和250 °C;毛細(xì)管電壓為4500V;各氨基酸、有機(jī)酸及內(nèi)標(biāo)碎片電 壓均為70。
應(yīng)用毛細(xì)管電泳 一 質(zhì)譜法對(duì)乳腺癌病人尿液中氨基酸和有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)定，
結(jié)果見附圖5和圖6。圖6中1:甘氨酸，2: |3-丙氨酸，3:丙氨酸，4:卩-氨基異丁酸，5: 3-羥基丁酸，6:絲氨酸，7:輔氨酸，8:纈氨酸，9:琥珀 酸，10:蘇氨酸，11:半胱氨酸，12:肌酸，13:亮氨酸，15:天冬氨酸，16: 蘋果酸，17:賴氨酸，18:谷氨酰胺，19:谷氨酸，20:甲硫氨酸，21:組氨 酸，22:苯丙氨酸，23:精氨酸，24:酪氨酸，25:檸檬酸，26:色氨酸，27: 胱氨酸。
權(quán)利要求
1. 一種尿液中同時(shí)分析氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜的方法，其特征在于通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)樣品預(yù)處理取樣品200μL，加入20μL內(nèi)標(biāo)液及400μL甲醇，于旋渦混合器上混合5分鐘，高速離心10分鐘，移取500μL上清液，于離心濃縮儀離心濃縮至干，殘?jiān)尤?00μL水溶解后，高速離心10分鐘取上清液進(jìn)樣分析；(2)毛細(xì)管電泳—質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定A. 毛細(xì)管電泳條件緩沖液含有3.0-6.0％甲酸和2.5-15％甲醇，分離電壓為15-18kV，分離溫度為25℃，程序進(jìn)樣50mbar壓力下進(jìn)體積百分含量為14％的濃氨水0-3秒后，再于50mbar壓力下進(jìn)樣品溶液40秒，B. 質(zhì)譜條件SIM模式檢測(cè)，鞘液為含80-90％甲醇和0.05％甲酸的溶液，流速為3μL/min，霧化氣壓力為2-4psig，干燥氣流速和溫度分別為7-8L/min和250-275℃，毛細(xì)管電壓為4500V，氨基酸、有機(jī)酸及內(nèi)標(biāo)碎片電壓均為10-70V。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)分析尿液中氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜 的方法，其特征在于步驟(1)所用內(nèi)標(biāo)液的制備是取鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品， 用水溶解，作為內(nèi)標(biāo)液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)分析尿液中氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜 的方法，其特征在于步驟(2) B中所述的是22種氨基酸和5種有機(jī)酸，分別是甘氨酸、絲氨酸、輔氨酸、纈氨酸、琥珀酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蘋果酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、檸檬酸、色氨酸、卩-丙氨酸、丙氨酸、卩-氨基異丁酸、3-羥基丁酸、賴氨酸、谷氨酰胺、肌酸、亮氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、鹽酸巴馬汀。
全文摘要
本發(fā)明提供一種尿液中同時(shí)分析氨基酸和有機(jī)酸代謝物譜的方法，是將生物樣本經(jīng)常規(guī)沉蛋白處理后，采用毛細(xì)管電泳為分離手段，檢測(cè)器選擇通用性強(qiáng)、靈敏度高的質(zhì)譜檢測(cè)器。本發(fā)明方法具有良好的精密度和回收率，是一種不需要衍生化步驟，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，選擇性好，普適性強(qiáng)的能夠同時(shí)測(cè)定生物樣品中22種氨基酸和5種有機(jī)酸的分析方法。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101430307SQ20081016316
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者劉昌孝, 朋 沈, 王書芳, 程翼宇, 青 邵 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)