專利名稱：：用于檢測(cè)肝癌特征蛋白的質(zhì)譜模型及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及惡性腫瘤肝癌檢測(cè)領(lǐng)域，為一種全新的非入侵性檢測(cè)方法，在體外對(duì)肝癌進(jìn)行早期的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)，其敏感性和特異性均達(dá)到100%。
背景技術(shù)：
：原發(fā)性肝癌(下稱肝癌)是我國(guó)高發(fā)癌癥之一。不僅東南沿海地區(qū)發(fā)病率甚高，西北地區(qū)發(fā)病率亦不低。究其原因大致與乙型肝炎在我國(guó)廣泛流行有關(guān)?，F(xiàn)乙肝疫苗接種己在我國(guó)逐步推廣。據(jù)初步報(bào)道，在曾接受乙肝疫苗接種的青少年中，肝癌的發(fā)病率己見明顯下降。但肝癌高發(fā)于中、老年，故我國(guó)肝癌發(fā)病率的全面下降尚需假以時(shí)日。近30多年來(lái)，由于診斷技術(shù)的進(jìn)步，肝癌被早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的明顯增多，加以手術(shù)經(jīng)驗(yàn)的積累、圍手術(shù)期處理的改善，使手術(shù)切除率明顯提高、預(yù)后改善。自上個(gè)世紀(jì)80年代初，介入治療興起后，近20多年來(lái)各種非手術(shù)療法層出不窮，并且都有一定的療效。①目前肝癌的診斷都是依據(jù)每6個(gè)月用甲胎蛋白和超聲檢查，但用AFP及B超進(jìn)行篩査有局限性，AFP對(duì)部分肝癌的敏感性和特異性相對(duì)較低,特別是對(duì)AFP陰性的患者;而B超在小肝癌的診斷方面尚有缺陷?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比，檢測(cè)離子。盡管MALDI-TOF的準(zhǔn)確度高達(dá)0.1%~0.01%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，但在腫瘤標(biāo)志物尤其是肝癌標(biāo)志物的應(yīng)用中仍然存在一些缺陷，因此國(guó)內(nèi)迄今為止尚無(wú)采用MALDI-TOF-MS技術(shù)獲得檢測(cè)肝癌標(biāo)志物或肝癌血清特征蛋白的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是為了克服已有對(duì)肝癌標(biāo)志物或肝癌血清特征蛋白檢測(cè)技術(shù)的不足之處，提出一種用于檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法。本發(fā)明的第一個(gè)發(fā)明目是提供一組用于檢測(cè)肝癌特征蛋白的腫瘤標(biāo)志物，其特征在于利用質(zhì)譜儀測(cè)定肝癌患者和健康人血清樣本的蛋白質(zhì)組譜圖，并篩選出相應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物，其中所述的腫瘤標(biāo)志物由具有以下質(zhì)荷比峰的5個(gè)肝癌特征蛋白組成6432.74m/z3192.67m/z8862.78m/z4054.13m/z2724.35m/z在一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述的質(zhì)譜儀是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，所述的篩選方法是采用弱陽(yáng)離子結(jié)合表面(WCX)芯片檢測(cè)肝癌患者和健康人的蛋白質(zhì)質(zhì)譜。本發(fā)明的第二個(gè)發(fā)明目是提供通過(guò)上述腫瘤標(biāo)志物制備質(zhì)譜模型的方法。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的質(zhì)譜模型的建立方法，包括1)收集多例臨床確診的肝癌患者血清和正常對(duì)照人員的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行低溫冷凍備用；2)對(duì)血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜前預(yù)處理3)對(duì)預(yù)處理過(guò)的兩組血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對(duì)所有的肝癌患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)實(shí)驗(yàn)質(zhì)控處理，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的5個(gè)肝癌特征蛋白6432.74m/z3192.67m/z8862.78m/z4054.13m/z2724.35m/z6)將所述5個(gè)肝癌特征蛋白作為腫瘤標(biāo)志物，建立用于檢測(cè)肝癌的質(zhì)譜模型。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的步驟2)包括使用磁珠純化和穩(wěn)定樣品中的血清蛋白或多肽。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟3)指采用WCX芯片對(duì)兩組血清蛋白進(jìn)行吸附，并對(duì)結(jié)合在弱陽(yáng)離子WCX芯片上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選出相應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物并建立檢測(cè)模型進(jìn)行分析檢測(cè)，所述的生物信息學(xué)方法包括對(duì)指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理、對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)實(shí)驗(yàn)質(zhì)控處理、篩選期望的血清特征蛋白并建立質(zhì)譜模型，以及可選擇地包括使用遺傳算法結(jié)合最近鄰算法建立并驗(yàn)證質(zhì)譜模型等。其中，所述的實(shí)驗(yàn)質(zhì)控處理指保留峰數(shù)量大于50的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)，并采用Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)來(lái)保證實(shí)驗(yàn)的一致性，從而根據(jù)變異系數(shù)滿足一致性的允許范圍來(lái)進(jìn)行篩選。本發(fā)明中，變異系數(shù)優(yōu)選為13.1%。本發(fā)明的第三個(gè)發(fā)明目的是提供所述的腫瘤標(biāo)志物組成的質(zhì)譜模型，在檢測(cè)肝癌中的應(yīng)用。其中，所述的應(yīng)用包括建立血清特征蛋白質(zhì)譜模型在肝癌早期檢測(cè)和篩査中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)發(fā)明目的是由所述的腫瘤標(biāo)志物組成的質(zhì)譜模型，或者上述方法所制備的質(zhì)譜模型，在檢測(cè)肝癌中的應(yīng)用。其中，所述的應(yīng)用包括血清特征蛋白質(zhì)譜模型在肝癌早期檢測(cè)和篩查中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明與其它肝癌的檢測(cè)方法比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)第一，本發(fā)明采用肝癌患者與正常人具有差異的多個(gè)特征蛋白組合進(jìn)行對(duì)肝癌血清的檢測(cè)，并采用了傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)與現(xiàn)代生物信息學(xué)方法相結(jié)合的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，從而得到肝癌患者和健康人血清蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測(cè)模型，并且所發(fā)現(xiàn)的一系列蛋白質(zhì)質(zhì)荷比峰為尋找新的更理想的腫瘤標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)和資源。第二，與以往的血清學(xué)檢測(cè)方法比較具有較高的敏感性和特異性，并能用于篩選抗肝癌的藥物中。第三，本發(fā)明模型的構(gòu)建方法設(shè)計(jì)合理可行，為提供肝癌的臨床治愈率提供了新的篩査方法，同時(shí)也為探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供了新的思路。第四，利用本發(fā)明分析了109份血清樣品，訓(xùn)練組79例，驗(yàn)證組30例，驗(yàn)證結(jié)果結(jié)果顯示，49例判斷正確，檢出率達(dá)94.35%，特異性為100%，靈敏性為100%，因此本發(fā)明可對(duì)肝癌作出早期的診斷，提高病人的存活率和生活質(zhì)量。圖1為部分健康人血清的多肽圖譜，其中正常(normal)A-E為健康人血清。圖2為部分肝癌患者血清的多肽圖譜，其中肝癌(cancer)F-J為肝癌患者血清。圖3重復(fù)做樣的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血清(SigmaK-O)血清質(zhì)譜指紋圖。圖4表示根據(jù)正常血清曲線和肝癌血清曲線的蛋白峰的平均圖譜；箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為2724.35m/z的肝癌特征蛋白峰。圖5表示根據(jù)正常血清曲線和肝癌血清曲線的蛋白峰進(jìn)行蛋白的平均圖譜；箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為3192.67m/z的肝癌特征蛋白峰；。圖6表示根據(jù)正常血清曲線和肝癌血清曲線的蛋白峰進(jìn)行蛋白的平均圖譜；箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為4054.13m/z的肝癌特征蛋白峰。圖7表示根據(jù)正常血清曲線和肝癌血清曲線的蛋白峰進(jìn)行蛋白的平均圖譜；箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為6432.74m/z的肝癌特征蛋白峰。圖8表示根據(jù)正常血清曲線和肝癌血清曲線的蛋白峰進(jìn)行蛋白的平均圖譜；箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為8862.78m/z的肝癌特征蛋白峰。具體實(shí)施方式本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例做進(jìn)一步的說(shuō)明，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1肝癌質(zhì)譜模型的建立1.樣本和儀器-共109例血清樣本，分兩批獲取。第一批作樣79例，其中49例來(lái)自肝癌患者，另外30例來(lái)自健康人群。本批79例樣品作為訓(xùn)練組。第二批作樣30例，其中20例肝癌患者，10例來(lái)自健康人群，本批30例樣品作為測(cè)試組。所有69例肝癌患者均經(jīng)術(shù)后病理報(bào)告確定。所有的血清樣本均在清晨空腹下抽取，分離血清后儲(chǔ)存在-80低溫冰箱中?；|(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜AutoflexIITOF/TOF及實(shí)驗(yàn)用的WCX磁珠試劑盒由美國(guó)Bruker公司研制。使用Bruker公司的數(shù)據(jù)分析軟件Clinprotools做數(shù)據(jù)的預(yù)處理，處理后的數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件R2.6.2的遺傳算法包genalg進(jìn)行處理。2.技術(shù)路線血清的采集收集靜脈血在BD管中，避免溶血。緩慢地上下振蕩管五次，使血液中的凝結(jié)塊混勻。室溫(25'C)血凝結(jié)1小時(shí)，垂直放置。其中血液必須精確凝結(jié)一小時(shí)，否則，由于樣品不同的凝結(jié)時(shí)間而導(dǎo)致不同的肽譜。室溫下，用臨床離心機(jī)以1.400-2.000g離心SST管(真空采血管，BD公司)十分鐘。吸取血清(上清液)到對(duì)應(yīng)的已標(biāo)記管中。標(biāo)記干凈的0.5ml離心管，同一血清樣品50ul—管，分裝多管。立即凍存血清樣品于-80。C。由于反復(fù)凍融血清樣品易造成多肽沉淀，從而使得肽譜丟失部分多肽，應(yīng)避免反復(fù)凍融。凍存血清分為永久保存和待分裝的。血清分裝后可在-80'C保存多年。血清樣品的磁珠處理在進(jìn)行ClinProt實(shí)驗(yàn)前，從低溫冰箱提取分裝的血清樣品各1管，放于濕冰上?；瘍?0—90分鐘。取出10ul磁珠結(jié)合緩沖液(BS)，10ul混勻的磁珠懸浮液，5ul血清樣品至樣品管，混勻。室溫靜置5min后，將樣品管放入磁珠分離器。使磁珠貼壁1分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體，再向樣品管中加入100ul磁珠清洗緩沖液(WS)，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動(dòng)樣品管10次。最后一次使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體。重復(fù)從加100ul磁珠清洗緩沖液，到最后吸去懸浮液體的操作步驟共3次。從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5ul磁珠洗脫緩沖液(ES)，溶解貼壁的磁珠，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的剛加入5ul磁珠穩(wěn)定緩沖液(SS)0.5ml樣品管。3.生物信息學(xué)方法(一)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集應(yīng)用AutoflexIlTOF/TOF質(zhì)譜儀。激光能量50%時(shí)，10shots去雜，36%時(shí)50shots采集一個(gè)樣品結(jié)晶點(diǎn)的某一個(gè)點(diǎn)，平均每個(gè)樣品結(jié)晶點(diǎn)收集8次共400shots。激光頻率50Hz。數(shù)據(jù)收集范圍l-20KDa。在每8個(gè)樣品結(jié)晶點(diǎn)收集數(shù)據(jù)前用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行外標(biāo)校正，平均分子量偏差小于100ppm。參見圖l，圖1中為血清多肽指紋譜圖。實(shí)驗(yàn)質(zhì)控(1)對(duì)于每一張采集到的原始圖譜，我們?cè)O(shè)定S/N^5的峰數(shù)量做為評(píng)判圖譜質(zhì)量的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于峰數(shù)量大于50的圖譜才保存，舍棄峰數(shù)量小于50的圖譜。(2)針對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作，采用Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)保證實(shí)驗(yàn)的一致性，本實(shí)例方法的變異系數(shù)為13.1%，滿足一致性允許范圍，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)一致性良好，參見表l、圖3。表l為Sigma血清中12個(gè)蛋白峰的變異系數(shù)值；圖3為實(shí)驗(yàn)中5個(gè)SigmaA-E血清的指紋圖譜。表1Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(二)原始數(shù)據(jù)預(yù)處理原始數(shù)據(jù)經(jīng)Bruker公司數(shù)據(jù)分析軟件Clinprotools處理，800-10K的峰值經(jīng)由Tophat方法做基線校準(zhǔn)，最小基線寬度10%，以10%最小閥值聚類；然后用總離子^1方法做歸一化處理。(三)肝癌特征蛋白的選擇每個(gè)質(zhì)荷比蛋白峰對(duì)各類樣本的區(qū)分的相對(duì)重要性都不同，這里綜合運(yùn)用了r檢驗(yàn)尸值和受試者接受曲線(ROC)的方法來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)蛋白峰的相對(duì)重要性。(四)遺傳算法遺傳算法是一種很有效的全局隨機(jī)化搜索算法，它借鑒了生物界自然選擇和自然遺傳的機(jī)制，其主要特點(diǎn)是群體搜索策略和群體中個(gè)體之間的信息交搜索不依賴于梯度信息。遺傳算法對(duì)多個(gè)個(gè)體組成的群體進(jìn)行操作，通過(guò)遺傳算子可以使個(gè)體間的信息得以交換,這樣的群體中的個(gè)體一代一代地得以優(yōu)化,并逐歩逼近最優(yōu)解。它尤其適用于處理傳統(tǒng)搜索方法難以解決的復(fù)雜和非線性問(wèn)題，可廣泛用于涉及高維空間的組合優(yōu)化領(lǐng)域。本發(fā)明方法的遺傳算法從統(tǒng)計(jì)差異蛋白子集形成的特征空間中搜索次優(yōu)特征子集。分類函數(shù)采用最近鄰算法(K麗)。在訓(xùn)練遺傳算法集合最近鄰算法分類的過(guò)程中引入了交叉驗(yàn)證的過(guò)程，這里采用隨機(jī)選擇樣本中的80%來(lái)建立模型，余下的20%作為驗(yàn)證。它可以監(jiān)督訓(xùn)練過(guò)程，避免建立的模型出現(xiàn)對(duì)建模樣本表現(xiàn)好，對(duì)預(yù)測(cè)樣本表現(xiàn)差的"過(guò)學(xué)習(xí)"現(xiàn)象。在利用遺傳算法和最近鄰算法對(duì)訓(xùn)練樣本建立質(zhì)譜數(shù)據(jù)分類模型后，利用驗(yàn)證樣本來(lái)檢驗(yàn)所建立模型的分類能力。實(shí)施例2肝癌檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例1的方法對(duì)健康人群30例，肝癌患者49例的血清蛋白質(zhì)圖譜作了檢測(cè)分析。用初步初步篩選的質(zhì)荷比峰按照戶值小于0.05為統(tǒng)計(jì)差異顯著的差異蛋白峰，在這些蛋白峰按照受試者接受曲線下面積(ROC)進(jìn)行從大到小排序，選擇其中ROCAUO啕.7蛋白作為特征空間，利用遺傳算法結(jié)合最近鄰算法建立最終的診斷模型。健康人群40例，肝癌患者49例樣本經(jīng)過(guò)實(shí)施例二中的方法共產(chǎn)生88個(gè)分子量的峰值，進(jìn)一步用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)篩選出6432.74m/z3192.67m/z8862.78m/z4054.13m/z2724.35m/z等5個(gè)蛋白峰，以下表2是這五個(gè)蛋白峰在疾病組和正常組中的平均峰的對(duì)照。表2健康人和肝癌比較的五個(gè)建模蛋白峰的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>這樣模型采用6432.74m/z3192.67m/z8862.78m/z4054.13m/z2724.35m/z五等個(gè)蛋白峰建立模型。模型識(shí)別率100%。并采用隨機(jī)選擇方法進(jìn)行交叉驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果為94.35%。模型具有很好的預(yù)測(cè)能力。表3模型訓(xùn)練結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3中對(duì)于訓(xùn)練樣本的結(jié)果為49例肝癌全部判斷正確，特異性100%;30例正常組全部判斷正確，敏感性為100%。模型訓(xùn)練完成后，建立起了一個(gè)有十二個(gè)輸入變量的模型，接著用這個(gè)模型對(duì)30個(gè)驗(yàn)證樣本來(lái)預(yù)測(cè)，并判斷出樣本的類別。結(jié)果表明，18例肝癌患者中的16例，特異性88.9%;IO例正常組中的IO例被準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，敏感性為100%。詳見表4。表4驗(yàn)證樣本預(yù)測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例3與其他肝癌檢測(cè)方法的比較對(duì)于肝癌的診斷，根據(jù)其生物學(xué)特征、年齡、性別、病發(fā)部位及臨床過(guò)程進(jìn)行分析，在病史及體征基礎(chǔ)上，采用AFP、超聲波等對(duì)肝癌的診斷和治療總體上取得了顯著進(jìn)步。然而，對(duì)肝癌的治療似乎并沒(méi)有突破性進(jìn)展，患者大多在確診后很快死亡，迫切需要一種更早期的診斷方法。而本發(fā)明方法原理不同于以上的檢測(cè)方法，并且本發(fā)明方法的結(jié)果表明，采用血清多肽檢測(cè)肝癌也不失為一個(gè)效果非常好的診斷手段，對(duì)于更早期的肝癌診斷大有裨益。參考文獻(xiàn)1.楊秉輝.目前肝癌綜合治療模式的選擇.中國(guó)普外與臨床雜志.2004.11(5)2.ChenDS，ChenCJ，HsuHM,etal.EffectsofneonatalhepatitisBvaccinationontheprevalenceofhepatocellularcarcinoma.Abstractsof11thInternationalSymposiumonViralHepatitis&，LiverDisease[C].SydneyAustralia,2003:19213.楊秉輝.原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)(J).中華肝病雜志.2001，64.黃宇琨、范學(xué)工等。肝細(xì)胞患者外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)。中國(guó)普通外科雜志2004[13,3]5.陳孝平、陳漢等。原發(fā)性肝癌外科治療方法的選擇(J).中國(guó)使用外科雜志,2001.10(2):99-1016.楊秉輝.目前肝癌綜合治療模式的選擇,中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2004。權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)肝癌特征蛋白的腫瘤標(biāo)志物，其特征在于利用質(zhì)譜儀測(cè)定肝癌患者和健康人血清樣本的蛋白質(zhì)組譜圖，并篩選出相應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物，其中所述的腫瘤標(biāo)志物由具有以下質(zhì)荷比峰的5個(gè)肝癌特征蛋白組成6432.74m/z3192.67m/z8862.78m/z4054.13m/z2724.35m/z。2.權(quán)利要求1所述的腫瘤標(biāo)志物，其中所述的質(zhì)譜儀是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。所述的篩選方法是采用弱陽(yáng)離子結(jié)合表面(WCX)芯片檢測(cè)肝癌患者和健康人的蛋白質(zhì)質(zhì)譜。3.由權(quán)利要求1或2所述的腫瘤標(biāo)志物組成的診斷模型，可用于檢測(cè)肝癌患者。4.權(quán)利要求3所述的質(zhì)譜模型的制備方法，包括以下步驟1)收集多例臨床確診的肝癌患者血清和正常人(對(duì)照樣本)的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行低溫冷凍備用；2)對(duì)血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜前預(yù)處理-3)對(duì)預(yù)處理過(guò)的兩組血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對(duì)所有的肝癌患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)實(shí)驗(yàn)質(zhì)控處理，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的5個(gè)肝癌特征蛋白6432.74m/z3192.67m/z8862.78m/z4054.13m/z2724.35m/z6)將所述5個(gè)肝癌特征蛋白作為腫瘤標(biāo)志物，建立用于檢測(cè)肝癌的質(zhì)譜模型。5.權(quán)利要求4所述的制備方法，其中步驟2)包括使用磁珠純化和穩(wěn)定樣品中的血清蛋白或多肽。6.權(quán)利要求4-5所述的制備方法，其中步驟3)指采用WCX芯片對(duì)兩組血清蛋白進(jìn)行吸附，并對(duì)結(jié)合在弱陽(yáng)離子WCX芯片上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜。7.權(quán)利要求4-6所述的制備方法，其中在步驟5)中，所述的實(shí)驗(yàn)質(zhì)控處理指保留峰數(shù)量大于50的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)，并采用Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)來(lái)保證實(shí)驗(yàn)的一致性，從而根據(jù)變異系數(shù)滿足一致性的允許范圍來(lái)進(jìn)行篩選。8.權(quán)利要求4-7所述的制備方法，其中變異系數(shù)優(yōu)選13.1%。9.權(quán)利要求l-2所述的腫瘤標(biāo)志物，用于肝癌早期檢測(cè)和篩査。10.權(quán)利要求3所述的質(zhì)譜模型，或權(quán)利要求4-8的方法所制備的質(zhì)譜模型，用于肝癌早期檢測(cè)和篩査。全文摘要本發(fā)明提出一種用于檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法。本發(fā)明采用肝癌患者與正常人具有差異的多個(gè)特征蛋白組合進(jìn)行對(duì)肝癌血清的檢測(cè)，并采用了傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)與現(xiàn)代生物信息學(xué)方法相結(jié)合的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過(guò)利用質(zhì)譜儀測(cè)定肝癌患者和健康人血清樣本的蛋白質(zhì)組譜圖，并篩選出相應(yīng)的5個(gè)肝癌特征蛋白的腫瘤標(biāo)志物，從而制備檢測(cè)肝癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型，為尋找新的更理想的腫瘤標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)和資源。文檔編號(hào)G01N27/64GK101403740SQ200810174079公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月13日優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日發(fā)明者于中連,呂萍萍,殷汝雷,嵐王,胡曉慧,馬慶偉申請(qǐng)人:毅新興業(yè)(北京)科技有限公司