專利名稱：：液相色譜法測(cè)定獨(dú)一味藥物制劑中木犀草素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，涉及一種藥品的檢測(cè)方法，尤其涉及一種高效液相色譜法測(cè)定獨(dú)一味藥物制劑中木犀草素的含量的方法。
背景技術(shù)：
：木犀草素(C15H1Q06)屬弱酸性四羥基黃酮化合物，為黃色晶體，屬于黃酮。木犀草素熔點(diǎn)328°C330°C(—水合物)，微溶于水，溶于堿溶液(一水合物)。獨(dú)一味為傳統(tǒng)藏藥，相關(guān)制劑被臨床廣泛應(yīng)用于各種外科手術(shù)后的鎮(zhèn)痛止血及口腔科、婦科、關(guān)節(jié)炎等方面的治療?！吨袊?guó)藥典》要求測(cè)定獨(dú)一味及其制劑中總黃酮及木犀草素含量，并設(shè)定了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。大量藥理實(shí)驗(yàn)表明，木犀草素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌；解痙、祛痰、抑酶、利尿利膽作用，是獨(dú)一味的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，建立獨(dú)一味制劑中木犀草素含量的測(cè)定方法，能更好地保障獨(dú)一味藥材及其相關(guān)提取物、制劑的質(zhì)量。目前，測(cè)定獨(dú)一味藥物中木犀草素的方法是采用高效液相色譜法(見《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VID)，其中流動(dòng)相的選擇主要有甲醇-0.4%磷酸水溶液(45:55);甲醇-水-乙酸(50:50:1);甲醇-0.025mo1/L磷酸二氫鈉溶液-磷酸(55:45:0.08);乙腈-O.5%磷酸水溶液(3:7);甲醇-四氫呋喃-0.5%醋酸(27:4:69)等。用以上系統(tǒng)溶液作流動(dòng)相時(shí)，木犀草素峰和雜質(zhì)峰分離度差，并有拖尾現(xiàn)象，使木犀草素的含量測(cè)定不夠準(zhǔn)確。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的提供一種專屬性強(qiáng)、能更準(zhǔn)確測(cè)定獨(dú)一味藥物中木犀草素的含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。本發(fā)明液相色譜法測(cè)定獨(dú)一味藥物制劑中木犀草素含量的方法，是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-四氫呋喃-0.5%磷酸為流動(dòng)相，在檢測(cè)波長(zhǎng)350士2nm，柱溫255(TC，流速0.51.5ml/min，進(jìn)樣量520^1的色譜條件下，將獨(dú)一味藥物供試品溶液進(jìn)行液相色譜分析，測(cè)定對(duì)照品溶液相應(yīng)位置的色譜峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的含量。所述流動(dòng)相中，乙腈、四氫呋喃、0.5%磷酸的體積比為(10-40):(4.87.2):(55.282.8)。優(yōu)選體積比為(15~30):(5.6~6.8):(64.478.2);最佳體積比為20:6.4:73.6。所述對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥的木犀草素對(duì)照品，用甲醇或乙醇制成濃度介于3~40iLig'mr1的梯度溶液。本發(fā)明的測(cè)定方法適用于獨(dú)一味藥物制劑，主要有貼膏劑、氣霧劑、軟膏劑、噴霧劑、片劑、丸劑、巴布劑等。所述獨(dú)一味藥物制劑供試品溶液的制備將獨(dú)一味藥物制劑按1:101:25的體積比加入到濃度為1.54.0mol/L的鹽酸甲醇溶液，于80~100°C，回流10~120分鐘，冷卻，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2-5體積份，用甲醇或所述流動(dòng)相或乙醇稀釋05倍，搖勻，用0.22~0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)，即得獨(dú)一味藥物供試品溶液。所述鹽酸甲醇溶液中鹽酸與甲醇的體積比1.35:10~4.05:10。下面通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。(1)儀器與試劑儀器Agilent-1100液相色譜儀；對(duì)照品來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品鑒定所(供含量測(cè)定用，批號(hào)111520-200201);試劑甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純，其余試劑均為分析純。(2)色譜條件選擇色譜柱Zorbax-C18;流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-0.5%磷酸(體積比為20:6.4:73.6);十八垸基硅垸鍵合硅膠為填充劑為250mmx4.6mm，5|im;柱溫40°C;檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm;流速1.0ml/min，進(jìn)樣量20pl;理論板數(shù)按木犀草素(C15H1()06)峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取濃度為3、6、12、18、24、30^ig'ml"的木犀草素對(duì)照品溶液各0.01ml，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果表明木犀草素在3~30嗎范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表3可知，RSD為0.99c/。，表明樣品在24小時(shí)之內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定性良好。(6)重現(xiàn)性試驗(yàn)依法制備供試品溶液6份，每份2g，分別精密稱定，精密加入2.5mol/L的鹽酸甲醇溶液25ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，精密稱定重量，加熱到98°C，回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2ml，置5ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。注入液相色譜儀，分別測(cè)定，結(jié)果見表4。表4重現(xiàn)性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表4可知，RSD為0.99。/。，表明樣品的重現(xiàn)性良好。(7)加樣回收試驗(yàn)取己知含量的供試品(木犀草素含量0.32mg/g)6份，每份lg，精密稱定重量，同供試品制備方法，精密量取續(xù)濾液2ml，置量瓶中，再分別精密加入濃度為30嗎'ml"的木犀草素對(duì)照品溶液0.7ml、0.8ml、1.0ml，用乙腈:四氫呋喃0.5%磷酸(體積比為20:6.4:73.6)稀釋至5ml，搖勻，用0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)。注入液相色譜儀，分別測(cè)定，結(jié)果見表5。表5加樣回收試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(8)樣品測(cè)定取獨(dú)一味藥物制劑約2g，精密稱定，精密加入2.5mol/L的鹽酸甲醇溶液25ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2ml，置量瓶中，用甲醇稀釋至5ml，搖勻，用0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)。注入液相色譜儀，分別測(cè)定，結(jié)果見表6。表6(n=2)產(chǎn)品批號(hào)-木犀草素含量(mg/g)產(chǎn)品批號(hào)-木犀草素含量(mg/g)12平均值12平均值0506500.300.280.290705240.250.270.260509650,300.320.310705280,320.320.320510770.340.340.340705290.440.460.450512890.390.410.400706310.370.370.370512910.360.350.360707390.380.360.370512920.380.360.370705300.440.420.430610320.430.450.440707440.290.310.300610350.400.390.400708480.420.410.420611420.360.350.360708060.390.410.400611410.480.500.490708510.360.370.37通過(guò)對(duì)多批留樣產(chǎn)品中的木犀草素檢測(cè)可知，藥物組合物制劑中每lg含獨(dú)一味以木犀草素計(jì)在0.26mg0.49mg的范圍內(nèi)，考慮到多批樣品的批間差異，在最低限量的基礎(chǔ)上下浮40%，作為最低限量標(biāo)準(zhǔn)0.15mg/g。因此暫定本品每lg含獨(dú)一味以木犀草素(C15H1()06)計(jì)，應(yīng)不得少于0.15mg。(9)陰性樣品測(cè)定取不含獨(dú)一味的藥物制劑約2g，精密稱定，精密加入2.5mol/L的鹽酸甲醇溶液25ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2ml，置量瓶中，用甲醇稀釋至5ml，搖勻，用0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)。注入液相色譜儀，進(jìn)行分析，結(jié)果對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。(10)供試品溶液的制備取獨(dú)一味藥物制劑約2g，精密稱定，精密加入2.5mol/L的鹽酸甲醇溶液25ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2ml，置量瓶中，用甲醇稀釋至5ml，搖勻，用0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。(11)樣品中的含量測(cè)定精密吸取樣品溶液20.0^1，以上述色譜條件，注入高效液相色譜儀中，測(cè)定與木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品相同位置的色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算制劑中木犀草素的含量；結(jié)果見表7。表7樣品含量測(cè)定(n=2)樣品編號(hào)制劑名稱含量(單位)1獨(dú)一味片劑不低于0.lmg/g2獨(dú)一味丸劑不低于0.lmg/g3獨(dú)一味氣霧劑不低于順m1—14獨(dú)一味貼膏劑不低于1.0mg/100cm25獨(dú)一味軟膏劑不低于10Pg/g6獨(dú)一味噴霧劑不低于脅gml—'7獨(dú)一味巴布膏不低于1.0mg/100cm2結(jié)果表明，獨(dú)一味不同制劑中均可檢測(cè)出木犀草素，但含量相差很大。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果1、本發(fā)明采用乙腈-四氫呋喃-0.5%磷酸為流動(dòng)相，減少了雜質(zhì)的影響，木犀草素峰與雜質(zhì)峰得到了更好的分離，使木犀草素的含量測(cè)定更為準(zhǔn)確。2、本發(fā)明得測(cè)定方法具有重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好、操作方法簡(jiǎn)便、精密度高、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；3、本發(fā)明可有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量，使獨(dú)一味藥物制劑的質(zhì)量達(dá)到穩(wěn)定、可控、高效及安全。圖1為獨(dú)一味中木犀草素對(duì)照品色譜圖圖2為獨(dú)一味中木犀草素樣品色譜圖圖3為獨(dú)一味中木犀草素陰性色譜圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例一含獨(dú)一味藥材的片劑中木犀草素含量測(cè)定照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VID)測(cè)定。(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250mmx4.6mm，5pm);以乙腈-四氫呋喃-質(zhì)量濃度0.5°/。磷酸(20:6.4:73.6)為流動(dòng)相，柱溫40'C;檢測(cè)波長(zhǎng)350nm;流速1.0ml/min;理論板數(shù)按木犀草素(C15H10O6)峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。(2)對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥的木犀草素對(duì)照品0.25mg，置量瓶中，加甲醇制成每lml含5pg的溶液，即得。(3)供試品溶液的制備取本品約0.5g，精密稱定，精密加入2.5mol/L的鹽酸甲醇溶液15ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2ml，置量瓶中，用甲醇稀釋至5ml，搖勻，用0.45)im的微孔濾膜濾過(guò)，即得。(4)測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10)il，注入液相色譜儀，測(cè)定，本品每lg含獨(dú)一味以木犀草素(C^HwO6)計(jì)，不得少于0.45mg。實(shí)施例二含獨(dú)一味藥材的貼膏劑中木犀草素含量測(cè)定照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VID)測(cè)定。步驟(1)、(2)與實(shí)施例1同。(3)供試品溶液的制備取本品約2g，精密稱定，精密加入2.5mol/L的鹽酸甲醇溶液25ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2ml，置量瓶中，用甲醇稀釋至5ml，搖勻，用0.45nm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。(4)測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各1(^1，注入液相色譜儀，測(cè)定，本品每lg含獨(dú)一味以木犀草素(Q5Hn)06)計(jì)，不得少于0.27mg。實(shí)施例三含獨(dú)一味藥材的丸劑中木犀草素含量測(cè)定照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VID)測(cè)定。步驟(1)、(2)與實(shí)施例1同。(3)供試品溶液的制備取本品約5g，精密稱定，精密加入3.0mol/L的鹽酸甲醇溶液40ml(鹽酸與甲醇的體積比2.7:10)，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇溶液補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液4ml，置量瓶中，用乙醇稀釋至5ml，搖勻，用0.45jnm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。(4)測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10pl，注入液相色譜儀，測(cè)定，本品每lg含獨(dú)一味以木犀草素(C,5Hu)06)計(jì)，不得少于0.32mg。實(shí)施例四含獨(dú)一味藥材的氣霧劑中木犀草素含量測(cè)定照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VID)測(cè)定。步驟(1)、(2)與實(shí)施例1同。(3)供試品溶液的制備精密量取本品10ml，置水浴鍋上蒸干，殘?jiān)芗尤?.5mol/L的鹽酸甲醇25ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，稱定重量，加熱水解30分鐘，放涼，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。(4)測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各1(^1，注入液相色譜儀，測(cè)定，本品每lml含獨(dú)一味以木犀草素(C15H1Q06)計(jì)，應(yīng)不得少于30嗎。實(shí)施例五含獨(dú)一味藥材的軟膏劑中木犀草素含量測(cè)定照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VID)測(cè)定。步驟(1)、(2)與實(shí)施例1同。(3)供試品溶液的制備取本品約10g，精密稱定，精密加入2.5mol/L的鹽酸甲醇溶液50ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液4ml，置量瓶中，用乙腈:四氫呋喃0.5%磷酸(體積比為20:6.4:73.6)稀釋至5ml，搖勻，用0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。(4)測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10pl，注入液相色譜儀，測(cè)定，本品每lg含獨(dú)一味以木犀草素((^HH)O6)計(jì)，不得少于0.20mg。實(shí)施例六含獨(dú)一味藥材的噴霧劑中木犀草素含量測(cè)定照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VID)測(cè)定。步驟(1)、(2)與實(shí)施例1同。(3)供試品溶液的制備精密量取本品5ml，置水浴鍋上蒸干，殘?jiān)芗尤?.5mol/L的鹽酸甲醇10ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，稱定重量，加熱水解30分鐘，放涼，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。(4)測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各lO)ll，注入液相色譜儀，測(cè)定，本品每lml含獨(dú)一味以木犀草素(C15H1()06)計(jì)，應(yīng)不得少于25|ig。實(shí)施例七含獨(dú)一味藥材的巴布劑中木犀草素含量測(cè)定照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VID)測(cè)定。步驟(1)、(2)與實(shí)施例1同。(3)供試品溶液的制備取本品約5g(30cm2)，剪成小塊，除去蓋襯，置平底燒瓶中，精密加入2.5mol/L的鹽酸甲醇25ml(鹽酸與甲醇的體積比2.25:10)，精密稱定重量，加熱回流60分鐘，放涼，用甲醇補(bǔ)足其減失的重量，精密量取續(xù)濾液2ml，置量瓶中，用甲醇至5ml，搖勻，用0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。(4)測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10pl，注入液相色譜儀，測(cè)定，本品每lg含獨(dú)一味以木犀草素(C^Hu)O6)計(jì)，應(yīng)不得少于0.15mg。權(quán)利要求1、液相色譜法測(cè)定獨(dú)一味藥物制劑中木犀草素含量的方法，其特征在于以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-四氫呋喃-0.5％磷酸為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為350±2nm，柱溫25～50℃，流速0.5～1.5ml/min，進(jìn)樣量5～20μl的色譜條件下，將獨(dú)一味藥物制劑供試品溶液進(jìn)行液相色譜分析，測(cè)定對(duì)照品溶液相應(yīng)位置的色譜峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的含量。2、如權(quán)利要求1所述液相色譜法測(cè)定獨(dú)一味藥物制劑中木犀草素含量的方法，其特征在于所述流動(dòng)相中乙腈四氫呋喃0.5%磷酸的體積比為(10~40):(4.87.2):(55.282.8)。3、如權(quán)利要求1所述液相色譜法測(cè)定獨(dú)一味藥物制劑中木犀草素含量的方法，其特征在于所述獨(dú)一味藥物制劑供試品溶液的制備將獨(dú)一味藥物制劑按1:101:25的體積比加入到濃度為1.5~4.0mol/L的鹽酸甲醇溶液，于80100°C，回流10120分鐘，冷卻，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25體積份，用甲醇或所述流動(dòng)相或乙醇稀釋05倍，搖勻，用0.22~0.45pm的微孔濾膜濾過(guò)，即得獨(dú)一味藥物制劑供試品溶液；所述鹽酸甲醇溶液中鹽酸與甲醇的體積比1.35:104.05:10。4、如權(quán)利要求1所述液相色譜法測(cè)定獨(dú)一味藥物制劑中木犀草素含量的方法，其特征在于所述對(duì)照品溶液的制備將經(jīng)五氧化二磷干燥的木犀草素對(duì)照品，用甲醇或乙醇制成濃度介于3~40pg.mr1的梯度溶液。5、如權(quán)利要求1所述液相色譜法測(cè)定獨(dú)一味藥物制劑中木犀草素含量的方法，其特征在于所述獨(dú)一味藥物制劑為貼膏劑、氣霧劑、軟膏劑、噴霧劑、片劑、丸劑或巴布劑。全文摘要本發(fā)明提供一種液相色譜法測(cè)定獨(dú)一味中木犀草素含量的方法，該方法以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-四氫呋喃-0.5％磷酸為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為350±2nm，柱溫25～50℃，流速0.5～1.5ml/min，進(jìn)樣量5～20μl的色譜條件下，將制備的供試品溶液進(jìn)行液相色譜分析，測(cè)定對(duì)照品溶液相應(yīng)位置的色譜峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的含量。本發(fā)明的測(cè)定方法精密度高、重現(xiàn)性好、回收率高、測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確，提高了含獨(dú)一味藥材的藥物制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有利于產(chǎn)品穩(wěn)定性和工業(yè)化生產(chǎn)的質(zhì)量控制，并確保了人們用藥的安全性和有效性。文檔編號(hào)G01N30/02GK101446573SQ20081018479公開日2009年6月3日申請(qǐng)日期2008年12月29日優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日發(fā)明者包旭宏,張國(guó)霞,李智勤,桑杰東主申請(qǐng)人:甘肅奇正藏藥有限公司