專利名稱：：一種脫氧雪腐鐮刀烯醇的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：一種脫氧雪腐鐮刀烯醇的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICLIA)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于對(duì)飼料、玉米、谷物及其制品中DON含量的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)又名嘔吐毒素，是一種單端孢霉烯族毒素，主要由某些鐮刀菌產(chǎn)生。DON廣泛存在小麥，大麥，玉米等農(nóng)作物中。目前，世界范圍內(nèi)DON污染谷物居各種生物毒素之首，呈較嚴(yán)重的狀況。我國(guó)2006-2007年飼料及原料霉菌毒素污染調(diào)査報(bào)告顯示在被檢全部樣品中嘔吐毒素檢出率為99.1%，超標(biāo)率53.5%。居被檢測(cè)的六種毒素之首。霉菌毒素中毒往往表現(xiàn)為明顯的地方性和季節(jié)性，臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，有急性中毒、慢性中毒以及致畸和致突變等。1998年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評(píng)價(jià)報(bào)告中，DON被列為三類致癌物。DON被懷疑可能與食管癌疾病的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系。因此為了保障人們的健康，開展食品中DON的衛(wèi)生檢測(cè)研究是很有必要的。DON污染谷物主要造成健康危害和經(jīng)濟(jì)損失。各國(guó)紛紛制定谷物及其制品中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)，其中歐盟等地區(qū)國(guó)家對(duì)DON的限量較為嚴(yán)格。我國(guó)小麥、玉米中DON的限量為100(Vg/kg。DON檢測(cè)技術(shù)主要分為兩類理化檢測(cè)法和免疫檢測(cè)法。理化檢測(cè)法包括薄層色譜法(TLC)，氣相相色譜法(GC)，高效液相色譜法(HPLC)，以及GC或HPLC與質(zhì)譜儀(MS)，電子捕獲檢測(cè)器(EDC)，紫外檢測(cè)器(UV)等聯(lián)合檢測(cè)法。TLC最早用于DON檢測(cè)。最低檢出限為20300ng/g。由于TLC檢測(cè)法重復(fù)性差、缺乏嚴(yán)格的靈敏度，因此一般只用于定性或者半定量檢測(cè)。GC法最低檢出限可達(dá)5ng/g，檢測(cè)前樣品需要衍生化。DON含有三個(gè)羥基能夠形成較強(qiáng)的氫鍵，在檢測(cè)前需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，使得衍生化產(chǎn)物具有揮發(fā)性，然后才可以進(jìn)行GC檢測(cè)法。另外GC法檢測(cè)變異系數(shù)大。HPLC雖然解決了GC的衍生化問題，但它和GC法同樣存在著需要貴重儀器，操作繁瑣，對(duì)待檢樣品預(yù)處理要求高，使用多種毒性有機(jī)溶劑，檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。免疫檢測(cè)法主要為酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)，最低檢出限可達(dá)0.3lng/g。盡管如此，ELISA存在標(biāo)記酶分子較大，活性易受環(huán)境因素的影響從而降低檢測(cè)的靈敏度和精密度。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICLIA)是以納米級(jí)高分子微粒為基礎(chǔ)的新一代化學(xué)發(fā)光技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)將被廣泛地應(yīng)用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)。它具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。LICLIA試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒組成，微粒直徑約188nm，表面覆蓋多糖水凝膠。水凝膠能減少非特異性結(jié)合，同時(shí)，增加微粒的懸浮性。微粒通過水凝膠表面的功能團(tuán)與生物分子共價(jià)連接。納米級(jí)微粒大大增加了反應(yīng)的表面積，每個(gè)微粒的表面包被著成百上千個(gè)生物分子，可捕獲目標(biāo)分子。LICLIA技術(shù)的核心原理是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，單線態(tài)氧的生存時(shí)間僅為4微秒。短暫的生存時(shí)間決定了單線態(tài)氧的傳播直徑很小(約為200mn)。如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受單線態(tài)氧，并發(fā)出高能級(jí)的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍內(nèi)沒有發(fā)光微粒，單線態(tài)氧就會(huì)回落到基態(tài)氧而沒有信號(hào)產(chǎn)生。這種依賴于兩種微粒相互接近的化學(xué)能量傳遞是LICLIA均相反應(yīng)的基礎(chǔ)。通常在該反應(yīng)體系中，微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機(jī)碰撞的幾率很低，因此，反應(yīng)體系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個(gè)微粒的距離，例如形成免疫夾心或受體-配體復(fù)合物，這樣就能產(chǎn)生能量的有效傳遞并發(fā)出光信號(hào)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)DON的試劑盒及其檢測(cè)方法，用于對(duì)飼料、玉米、谷物及其制品中DON含量的檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案一種脫氧雪腐鐮刀烯醇(DON)的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，由白色不透明微孔板(1)，DON標(biāo)準(zhǔn)(2)，連接DON-BSA人工抗原的發(fā)光微粒(3)，兔抗DON的抗體凍干品(4)，生物素化羊抗兔抗體凍干品(5)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(6)組成。連接DON-BSA人工抗原的發(fā)光微粒(3)的制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.5|iL質(zhì)量濃度l%Tween-20，0.05mgDON-BSA人工抗原，10pL硼氫化氰鈉，用0.1M、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸MES緩沖液將體積補(bǔ)充到200pL，37'C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)，加入10pL0.3M、pH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽CMO溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37。C避光孵育1小時(shí)后離心，分離得到己連接DON-BSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。DON標(biāo)準(zhǔn)(2)，從DON純品中稀釋得到，稀釋液為0.01mmol/L、pH7.4的PBS，DON濃度分別為Ong/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL。一種用所述的試劑盒檢測(cè)DON的方法，取包被有DON-BSA的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入DON標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入兔抗DON抗體、生物素化羊抗兔抗體進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)；接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)后檢測(cè)光信號(hào)，以加入DON標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測(cè)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的DON含量。所述的檢測(cè)DON的方法，操作為取20pL包被有DON-BSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的DON標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20nL兔抗DON抗體；繼續(xù)加入20pL生物素化羊抗兔抗體，37。C孵育15分鐘；加175pL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37'C孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的DON含量。所述的檢測(cè)DON的方法，其中的樣品處理，玉米、谷物樣品及其制品的處理將玉米、谷物樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25mL，提取液為蒸餾水，加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號(hào)紙，取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進(jìn)行稀釋，備用檢測(cè)；啤酒樣品處理直接取樣檢測(cè)或者用蒸餾水按比例稀釋備用檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明用于飼料、玉米、谷物及其制品中DON含量的檢測(cè)，試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、廉價(jià)、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高。圖1:檢測(cè)DON的試劑盒示意圖。1、白色不透明微孔板，2、DON標(biāo)準(zhǔn)，3、連接DON-BSA人工抗原的發(fā)光微粒，4、兔抗DON的抗體凍干品，5、生物素化羊抗兔抗體凍干品，6、包被有鏈霉親和素的感光微粒。圖2:DON-LICLIA反應(yīng)示意圖。圖3:DON-LICLIA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方案實(shí)施例1制備試劑盒和檢測(cè)玉米樣品發(fā)光微粒、包被有鏈霉親和素的感光微粒購(gòu)于博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司。包被有DON-BSA人工抗原的發(fā)光微粒制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.5|iL1%Tween-20，0.05mgDON-BSA人工抗原，lOjiL硼氫化氰鈉，用0.1M、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補(bǔ)充到200nL，37'C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)。加入lOpL0.3MpH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37'C避光孵育1小時(shí)后離心，分離得到己連接DON-BSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。標(biāo)準(zhǔn)DON試劑的配制(Ong/mL，0.1ng/mL，lng/mL，10ng/mL，100ng/mL,500ng/mL)，從DON純品中稀釋得到，稀釋液為PBS(0.01mmol/L，pH7.4)。試劑盒的組成(1)、白色不透明微孔板(12條x8孔，可以拆分為單孔)。(2)、1x包被有DON-BSA人工抗原的發(fā)光微粒2mL。(3)、6xDON標(biāo)準(zhǔn)液，1.0mL/瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0，0.1，1，10，100，500ng/mL。(4)、1x兔抗DON抗體凍干品，用時(shí)2mL蒸餾水溶解。(5)、lx生物素化羊抗兔抗體凍干品，用時(shí)2mL蒸餾水溶解。(6)、1x包被有鏈霉親和素的感光微粒20mL。測(cè)定時(shí)注意事項(xiàng)1.使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30'C)。2.使用之后立即將所有試劑放回2-8°C。3.在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射。具體檢測(cè)步驟如下樣品處理:將玉米樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25mL蒸餾水。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號(hào)紙。取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進(jìn)行稀釋，備用。取20pL包被有DON-BSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL、DON標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20pL兔抗DON抗體；繼續(xù)加入20pL生物素化羊抗兔抗體，37。C孵育15分鐘；暗處加175pL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37。C暗處孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的DON含量。結(jié)果見表l，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得該例樣品的溶液所含DON濃度為11.2ng/mL。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2小麥樣品測(cè)定試劑盒提供的試劑與實(shí)施例1相同，用于檢測(cè)小麥樣品。具體檢測(cè)步驟如下小麥樣品處理將小麥樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25mL蒸餾水。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙釆用新華1號(hào)紙。取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進(jìn)行稀釋，備用。取20pL包被有DON-BSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的DON標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20jaL兔抗DON抗體；繼續(xù)加入2C^L生物素化羊抗兔抗體，37"C孵育15分鐘；暗處加175jiL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37'C暗處孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的DON含量。結(jié)果見表2，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得該例樣品的溶液所含DON濃度為1.71ng/ml。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3啤酒樣品測(cè)定試劑盒提供的試劑與實(shí)施例1相同，用于檢測(cè)啤酒樣品。具體檢測(cè)步驟如下啤酒樣品處理直接提取啤酒樣品或者用蒸餾水5倍稀釋。取20|nL包被有DON-BSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的DON標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20nL兔抗DON抗體；繼續(xù)加入20pL生物素化羊抗兔抗體，37C孵育15分鐘；暗處加175^L包被有鏈霉親和素的感光微粒，37。C暗處孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的DON含量。結(jié)果見表3，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得該例樣品的溶液所含DON濃度為1.08ng/ml。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種脫氧雪腐鐮刀烯醇DON的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征是由白色不透明微孔板(1)，脫氧雪腐鐮刀烯醇標(biāo)準(zhǔn)(2)，連接DON-BSA人工抗原的發(fā)光微粒(3)，兔抗DON的抗體凍干品(4)，生物素化羊抗兔抗體凍干品(5)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(6)組成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是連接DON-BSA人工抗原的發(fā)光微粒(3)的制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.5pL質(zhì)量濃度1%的Tween-20，0.05mgDON-BSA人工抗原，10nL硼氫化氰鈉，用O.IM、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸MES緩沖液將體積補(bǔ)充到200pL，37。C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)；加入10|iL0.3M、pH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽CMO溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37°C避光孵育l小時(shí)后離心，分離得到已連接DON-BSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是脫氧雪腐鐮刀烯醇標(biāo)準(zhǔn)(2)，從脫氧雪腐鐮刀烯醇純品中稀釋得到，稀釋液為0.01mmol/L、pH7.4的PBS，脫氧雪腐鐮刀烯醇濃度分別為0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL。4、一種用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法，其特征是取包被有DON-BSA的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入脫氧雪腐鐮刀烯醇標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入兔抗DON抗體、生物素化羊抗兔抗體進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng);接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)后檢測(cè)光信號(hào)，以加入脫氧雪腐鐮刀烯醇標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測(cè)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的脫氧雪腐鐮刀烯醇含量。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法，其特征是操作為取20|iL包被有DON-BSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20^L的脫氧雪腐鐮刀烯醇標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加2(^L兔抗DON抗體；繼續(xù)加入2(^L生物素化羊抗兔抗體，37X:孵育15分鐘；力卩175nL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37'C孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的脫氧雪腐鐮刀烯醇含量。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法，其特征是樣品處理，玉米、谷物樣品及其制品的處理將玉米、谷物樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25mL，提取液為蒸餾水，加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號(hào)紙，取lmL濾液用lmL蒸餾水或去離子水進(jìn)行稀釋，備用檢測(cè)；啤酒樣品處理直接取樣檢測(cè)或者用蒸餾水按比例稀釋備用檢測(cè)。全文摘要一種脫氧雪腐鐮刀烯醇(DON)的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析LICLIA
技術(shù)領(lǐng)域：
。包被有DON-BSA的發(fā)光微粒加入微孔板，順序加入DON標(biāo)準(zhǔn)或樣品、兔抗DON抗體、生物素化羊抗兔抗體避光反應(yīng)，再加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測(cè)。發(fā)光微粒上的DON-BSA與DON競(jìng)爭(zhēng)連接到DON抗體，再與生物素化羊抗兔抗體以及包被鏈霉親和素的感光微粒形成復(fù)合體，在光激發(fā)下，通過單線態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞，將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生熒光，用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)，光信號(hào)強(qiáng)度與樣品中DON濃度成反比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣品中DON含量。本發(fā)明用于飼料、玉米、谷物及其制品中DON含量的檢測(cè)，試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、廉價(jià)、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高。文檔編號(hào)G01N33/543GK101393211SQ20081019489公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日發(fā)明者藝張,趙衛(wèi)國(guó),堅(jiān)金,雷高,飚黃申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所