專利名稱：：玉米赤霉烯酮的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法玉米赤霉烯酮的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種檢測(cè)玉米赤霉烯酮(ZEN)的試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICLIA)
技術(shù)領(lǐng)域：
，用于對(duì)谷物中ZEN含量的檢測(cè)。技術(shù)背景玉米赤霉烯酮(ZEN)是一種雌激素真菌毒素，由禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、三線鐮刀菌(F.tricinetum)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、黃色鐮刀菌(Rculmomm)、串珠鐮刀菌(F.oeniliforme)、木賊鐮刀菌(F.eguiseti)、燕麥鐮刀菌(Ravenaceum)、雪腐鐮刀菌(F.nivale)等多種菌種代謝產(chǎn)生。ZEN其主要存在于玉米和玉米制品中，小麥、大麥、高粱、大米中也有一定程度的分布，其主要污染小麥、大麥、燕麥、小米、芝麻、干草和青貯伺料等。ZEN具有較強(qiáng)的生殖毒性和致畸作用，可引起動(dòng)物發(fā)生雌激素中毒癥，主要癥狀有陰道和乳腺腫脹、子宮腫大、外翻、導(dǎo)致動(dòng)物不孕或流產(chǎn)，對(duì)家禽特別是豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失；ZEN可直接通過污染的谷類等作物進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，亦可通過被污染的肉、奶等動(dòng)物性食品進(jìn)入人體，它引起人中毒的癥狀主要出現(xiàn)無力、頭痛、頭暈、嘔吐、腹瀉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂。因此為了保障人們的健康，開展食品中ZEN的衛(wèi)生檢測(cè)研究是很有必要的。歐盟委員會(huì)規(guī)則856/2005號(hào)規(guī)定了谷物食品和谷物中ZEN的最大限量為20-100|ig/kg，于2006年7月1日生效。目前也有許多國家制定了ZEN的限量標(biāo)準(zhǔn)，奧地利規(guī)定小麥、裸麥、硬質(zhì)小麥中不得超過60pg/kg，巴西、法國、羅馬尼亞、俄羅斯、烏拉圭等國也制定了限量標(biāo)準(zhǔn)。修訂的《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定小麥、玉米中ZEN的限量為60|ug/kg。我國ZEN污染較重地區(qū)主要集中在東北冷濕儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)和華東熱濕儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)。谷物在耕作、收獲、儲(chǔ)藏期間，若濕度較高，溫度適宜25-28"，鐮刀菌可不斷增殖，而且在較低溫度下12。C左右或溫度高低變化的情況下，ZEN毒素都可產(chǎn)生。目前ZEN的檢測(cè)方法主要有色譜技術(shù)和免疫分析技術(shù)。色譜技術(shù)(HPLC、GC-MS、LC-MS)由于費(fèi)時(shí)，花費(fèi)多，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定限制，通常作為確定性的定量檢驗(yàn)方法；免疫分析技術(shù)(ELISA)是常用的現(xiàn)場(chǎng)抽樣快速篩選檢驗(yàn)方法。國外的酶免試劑盒有德國R-Biopharm(檢測(cè)范圍50-4050ppt)、美國Neogen(檢測(cè)范圍25-600ppb)、Beacon(檢測(cè)范圍20-1000ppb)等公司生產(chǎn)的ZEN-ELISA檢測(cè)試劑盒。但由于進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴，在一定程度上限制了它的使用范圍。國內(nèi)有研制的ZEN-ELISA試劑盒，其最低檢出濃度為l|ig/L(ppb)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為l-200嗎/L。檢測(cè)的靈敏度和試劑的穩(wěn)定性不夠，所以需要建立高靈敏的ZEN的檢測(cè)。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICLIA)是以納米級(jí)高分子微粒為基礎(chǔ)的新一代化學(xué)發(fā)光技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)將被廣泛地應(yīng)用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激發(fā)產(chǎn)生的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)。它具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡單的特點(diǎn)。LICLIA試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒組成，微粒直徑約188nm，表面覆蓋多糖水凝膠。水凝膠能減少非特異性結(jié)合，同時(shí)，增加微粒的懸浮性。微粒通過水凝膠表面的功能團(tuán)與生物分子共價(jià)連接。納米級(jí)微粒大大增加了反應(yīng)的表面積，每個(gè)微粒的表面包被著成百上千個(gè)生物分子，可捕獲目標(biāo)分子。LICLIA技術(shù)的核心原理是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，單線態(tài)氧的生存時(shí)間僅為4微秒。短暫的生存時(shí)間決定了單線態(tài)氧的傳播直徑很小(約為200nm)。如果發(fā)光微粒在200nm范圍之內(nèi)就能接受單線態(tài)氧，并發(fā)出高能級(jí)的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍內(nèi)沒有發(fā)光微粒，單線態(tài)氧就會(huì)回落到基態(tài)氧而沒有信號(hào)產(chǎn)生。這種依賴于兩種微粒相互接近的化學(xué)能量傳遞是LICLIA均相反應(yīng)的基礎(chǔ)。通常在該反應(yīng)體系中，微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機(jī)碰撞的幾率很低，因此，反應(yīng)體系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個(gè)微粒的距離，例如形成免疫夾心或受體-配體復(fù)合物，這樣就能產(chǎn)生能量的有效傳遞并發(fā)出光信號(hào)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)ZEN的試劑盒及其檢測(cè)方法，用于對(duì)谷物中本發(fā)明的技術(shù)方案一種檢測(cè)玉米赤霉烯酮(ZEN)的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，由白色不透明微孔板(l)，ZEN標(biāo)準(zhǔn)(2)，連接ZEN-BSA的發(fā)光微粒(3)，ZEN的單克隆抗體凍干品(4)，生物素化羊抗鼠凍干品(5)，包被有鏈霉親和素的感光微粒(6)組成。連接ZEN-BSA的發(fā)光微粒(3)的制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.5pL質(zhì)量濃度1%的Tween-20，0.05mgZEN-BSA人工抗原，lOiiL硼氫化氰鈉，用0.1M、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸MES緩沖液將體積補(bǔ)充到200pL，37°C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)；加入10pL0.3MpH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽CMO溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37i:避光孵育1小時(shí)后離心，分離得到已連接ZEN-BSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。ZEN標(biāo)準(zhǔn)(2)，共6瓶，ZEN濃度分別為Ong/mL，0.1ng/mL，lng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，從ZEN純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇PBS體積比1:9。用所述的試劑盒檢測(cè)ZEN的方法，取包被有ZEN-BSA的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入ZEN單克隆抗體、生物素化羊抗鼠抗體進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)；接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)后檢測(cè)光信號(hào)，以加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測(cè)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的ZEN含量。操作為取20)nL包被有ZEN-BSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20^iL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20pLZEN單克隆抗體；繼續(xù)加入2(HiL生物素化羊抗鼠抗體，37"C孵育15分鐘；暗處加175pL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37'C孵育暗處15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，以加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測(cè)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的ZEN含量。所述的樣品處理，谷物樣品處理將樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25mL，提取液為甲醇PBS體積比7:3，加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華l號(hào)紙，取lmL濾液用7mLPBS進(jìn)行稀釋，備用。本發(fā)明的有益效果該檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，操作簡便、廉價(jià)、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高。圖l:檢測(cè)ZEN的試劑盒示意圖。1、白色不透明微孔板，2、ZEN標(biāo)準(zhǔn)，3、連接ZEN-BSA的發(fā)光微粒，4、ZEN的抗體凍干品，5、生物素化羊抗鼠抗體凍干品，6、包被有鏈霉親和素的感光微粒。圖2:ZEN-LICLIA反應(yīng)示意圖。圖3:ZEN-LICLIA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方案實(shí)施例l:制備試劑盒和檢測(cè)玉米樣品發(fā)光微粒、包被有鏈霉親和素的感光微粒購于博陽生物科技(上海)有限公司。包被發(fā)光微粒ZEN-BSA人工抗原的制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.51%Tween-20，0.05mgZEN-BSA人工抗原，10nL硼氫化氰鈉，用0.1M、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補(bǔ)充到200|aL，37'C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)。加入10jiL0.3MpH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37'C避光孵育1小時(shí)后離心，分離得到已連接ZEN-BSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。試劑的配制ZEN標(biāo)準(zhǔn)，共6瓶，濃度分別為(Ong/mL，0.1ng/mL，lng/mL，10ng/mL，50tig/mL，100ng/mL)，從ZEN純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇PBS體積比1:9。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)自備的試劑甲醇；蒸餾水或去離子水。試劑盒的組成(1)、白色不透明微孔板(12條x8孔，可以拆分為單孔)。(2)、1x包被有ZEN-BSA人工抗原的發(fā)光微粒2mL。(3)、6xZEN標(biāo)準(zhǔn)液，1.0mL/瓶,標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0，0.1，1，10，50，100ng/mL。(4)、lxZEN抗體凍干品，用時(shí)2mL蒸餾水溶解。(5)、lx生物素化羊抗鼠抗體凍干品，用時(shí)2mL蒸餾水溶解。(6)、1x包被有鏈霉親和素的感光微粒20mL。測(cè)定時(shí)注意事項(xiàng)1、使用之前將所有試劑回升至室溫(18-3(TC)。2、使用之后立即將所有試劑放回2-8°C。3、在所有恒溫孵育過程中避免光線照射。具體檢測(cè)步驟如下樣品處理玉米樣品處理將玉米樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25mL，提取液為甲醇PBS=7:3，加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號(hào)紙，取lmL濾液用7mLPBS進(jìn)行稀釋，備用。取20|aL包被有ZEN-BSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20pLZEN單克隆抗體；繼續(xù)加入20pL生物素化羊抗鼠抗體，37。C孵育15分鐘；暗處加175|aL包被有鏈霉親和素的感光微粒37'C孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的ZEN含量。結(jié)果見表l，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得該例樣品所含ZEN濃度為3.15ng/mL。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種檢測(cè)玉米赤霉烯酮(ZEN)的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征是由白色不透明微孔板(1)，ZEN標(biāo)準(zhǔn)(2)，連接ZEN-BSA的發(fā)光微粒(3)，ZEN的單克隆抗體凍干品(4)，生物素化羊抗鼠凍干品(5)，包被有鏈霉親和素的感光微粒(6)組成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是連接ZEN-BSA的發(fā)光微粒(3)的制備在離心管中加入lmg發(fā)光微粒，加入12.5pL質(zhì)量濃度1%的Tween-20，0.05mgZEN-BSA人工抗原，10pL硼氫化氰鈉，用O.IM、pH6.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸MES緩沖液將體積補(bǔ)充到200pL，37。C避光振蕩反應(yīng)48小時(shí)；加入lOpL0.3MpH5.0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽CMO溶液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，37"C避光孵育1小時(shí)后離心，分離得到已連接ZEN-BSA的發(fā)光微粒，稀釋后備用。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是ZEN標(biāo)準(zhǔn)(2)，共6瓶，ZEN濃度分別為Ong/mL，0.1ng/mL，lng/mL,10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，從ZEN純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇PBS體積比1:9。4、一種用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)ZEN的方法，其特征是取包被有ZEN-BSA的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入ZEN單克隆抗體、生物素化羊抗鼠抗體進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)；接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進(jìn)行反應(yīng)后檢測(cè)光信號(hào)，以加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加入被測(cè)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的ZEN含量。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)ZEN的方法，其特征是操作為取20nL包被有ZEN-BSA發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20pL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20pLZEN單克隆抗體；繼續(xù)加入20|aL生物素化羊抗鼠抗體，37'C孵育15分鐘；暗處加175pL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37"C孵育暗處15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的ZEN含量。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)ZEN的方法，其特征是樣品處理，谷物樣品處理將樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液25mL，提取液為甲醇PBS體積比7:3，加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華l號(hào)紙，取lmL濾液用7mLPBS進(jìn)行稀釋，備用。全文摘要玉米赤霉烯酮(ZEN)的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法，屬光激化學(xué)發(fā)光免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。包被ZEN-BSA發(fā)光微粒加入微孔板，順序加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)或樣品、ZEN單克隆抗體和生物素化羊抗鼠抗體反應(yīng)，避光加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測(cè)。包被在發(fā)光微粒上ZEN-BSA與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中ZEN競(jìng)爭(zhēng)連接到ZEN抗體，與生物素化羊抗鼠抗體及包被鏈霉親和素的感光微粒形成復(fù)合體，在光激發(fā)下，通過單線態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞，將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生熒光，用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)，光信號(hào)強(qiáng)度與樣品中ZEN濃度成反比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定被測(cè)樣品中ZEN含量。本發(fā)明用于飼料，谷物及其制品中ZEN含量檢測(cè)。提供的檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，操作簡便、廉價(jià)、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高。文檔編號(hào)G01N21/76GK101398432SQ20081019489公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日發(fā)明者藝張,趙衛(wèi)國,堅(jiān)金,雷高,飚黃申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所