專利名稱：熒光分光光度法篩選催化非水相體系轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)用酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種催化非水相體系轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的酶的篩選方法，具體說是利 用熒光分光光度法對酶能否在非水相中催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)進(jìn)行判定，并根據(jù)熒光 強(qiáng)度確定酶催化能力強(qiáng)弱，屬于酶反應(yīng)及熒光測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
有些脂肪酶、酯酶和蛋白酶在水相中催化分解反應(yīng)，卻能在非水體系中催 化合成及轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。酶催化的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)甚至能對固體高分子聚合物進(jìn)行改 性，將功能基團(tuán)引入高分子化合物側(cè)鏈。因此，如果能夠通過酶催化轉(zhuǎn)酯化反 應(yīng)在棉纖維表面引入不同的基團(tuán)，則可在不損害棉纖維的條件下通過改性賦予 棉纖維新的功能。
目前為止，酶催化反應(yīng)的測定通常使用氣相色譜或高效液相色譜，這些方 法中酶、反應(yīng)底物和反應(yīng)溶劑用量較多，并且測定樣品前處理要求高，單個樣 品測定時間較長。相比之下，熒光分光光度法測定需要樣品量少，反應(yīng)體系可 以以微升計，每次可同時測定多個樣品。熒光分光光度法利用自身沒有熒光的 熒光底物和酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物之一作用生成熒光衍生物，通過測定熒光衍生物 的熒光強(qiáng)度間接反映酶的催化能力。該方法要求酶催化反應(yīng)和熒光衍生物產(chǎn)生 反應(yīng)能同步發(fā)生。因此，這兩個反應(yīng)發(fā)生的條件必須相協(xié)調(diào)，而很多熒光底物 反應(yīng)生成熒光衍生物的條件與酶催化反應(yīng)條件不一致而導(dǎo)致測定無法進(jìn)行，從 而限制了熒光分光光度法在酶催化領(lǐng)域的應(yīng)用。
4 -肼基-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜二唑肼(^0-&!^12,2)是一種商業(yè)化熒光 底物，能用于醛類物質(zhì)的熒光測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題主要是提供一種判斷非水相體系酶催化轉(zhuǎn)酯 化反應(yīng)發(fā)生的方法，同時可以比較能催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)酶的活性。本方法操作簡 潔，直觀明了。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種判斷非水相體系酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)發(fā)生的方法， 同時可以比較能催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)酶的活性。熒光分光光度法篩選催化非水相體 系轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)用酶的方法，a、酶催化乙烯基酯和伯醇類物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，
反應(yīng)產(chǎn)物之一的乙烯基醇通過酮式-烯醇式互變異構(gòu)生成乙醛，使轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)
不可逆；b、乙醛和4-胼基-7-硝基-2,l，3-苯并氧雜二唑胼(NBD-H.NH2NH2)
反應(yīng)生成熒光衍生物，并通過測定該熒光衍生物的熒光強(qiáng)度來間接反映酶的催化能力；酶催化反應(yīng)和熒光衍生物產(chǎn)生反應(yīng)的反應(yīng)式為:
<formula>formula see original document page 4</formula> (1)
<formula>formula see original document page 4</formula> (2)
現(xiàn)將方法中幾個關(guān)鍵技術(shù)分述如下
(1) 酶的冷凍干燥
配制濃度為1.333g/L的酶溶液，加入酶溶液重量百分5%蔗糖作為冷凍干 燥保護(hù)劑，充分振蕩溶解后，用移液槍分裝到0.5mL離心管中，300 nL/管， 進(jìn)行冷凍干燥，得冷凍干燥酶粉，備用；
所選用的酶、酶溶液配置為
蛋白酶bacillolysin用pH7.5、0.1mol/L的K2HP04-KH2P04緩沖溶液配制； 蛋白酶subtilisin Carisberg用pH7.5、0.1 mol/L的K2HP04-KH2P04緩沖溶
液配制；
脂肪酶LPL-3用pH7.5、 0.1mol/L的K2HP04-KH2P04緩沖溶液配制； 蛋白酶Alcalase 3.0 T用pH8.0、 0.1 mol/L的K2HP04-KH2P04緩沖溶液 配制。
(2) 配制NBD-H.NH2NH2異辛烷溶液
準(zhǔn)確稱取一定量的NBD-H.NH2NH2至預(yù)先定量好的異辛烷中，配制濃度 為200 )amol/L的NBD-H.NH2NH2異辛烷溶液，使用旋渦混勻器連續(xù)震蕩直到 NBD-H.NH2NH2完全溶解，該溶液在配制后3天內(nèi)使用；NBD-H.NH2NH2溶解 于甲苯和乙腈中時也照此操作；
(3) 酶反應(yīng)及熒光測定
在裝有冷凍干燥酶粉的0.5 mL離心管中依次加入①、200 pL200 pmol/L 的仰0-辻,2,2異辛烷溶液，@、0.211111101正丙醇，為15pL，和③、0.02mmo1 丙酸乙烯基酯為2pL或0.02 mmol月桂酸乙烯基酯為5pL;
使用旋渦混勻器震蕩混勻，在酶的反應(yīng)溫度下于恒溫震蕩水浴中反應(yīng)1.5h，反應(yīng)結(jié)束后靜置片刻，用移液槍吸取200 pL上清液至黑色不透明96孔 板中測定熒光強(qiáng)度，每個條件做3個平行樣，測定結(jié)果取平均值，熒光測定條 件為激發(fā)光波長435nm，發(fā)射光波長535nm，激發(fā)時間ls，采取頂部閱讀模式， 數(shù)據(jù)分析時采用相對熒光強(qiáng)度表示，以同批次測定中最高熒光強(qiáng)度為100%。
所選用的酶的反應(yīng)溫度為蛋白酶bacillolysin溫度37。C;蛋白酶subtilisin Carlsberg溫度37°C;脂肪酶LPL-3溫度50°C;蛋白酶Alcalase 3.0 T溫度50°C 。
本發(fā)明的有益效果乙醛是揮發(fā)性物質(zhì)，酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)產(chǎn)生的乙醛能
否完全和NBD-H.NH2NH2作用生成熒光衍生物也影響熒光分光光度法對酶催 化能力的測定，但和測定樣品前處理要求高、單個樣品測定時間長的氣相色譜 和高效液相色譜相比較，熒光分光光度法測定需要樣品量少，反應(yīng)體系可以以 微升計，每次可同時測定多個樣品，是一種較好的能直觀反應(yīng)酶催化活性的方 法。本發(fā)明操作簡潔，能直觀明了判定非水相中酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)能否發(fā)生， 可以比較能催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)酶的催化活性，并可以通過本發(fā)明方法對影響酶催 化反應(yīng)的因素進(jìn)行研究。


圖l不同參試用酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的能力。1、脂肪酶LPL-3; 2、蛋白酶 Alcalase 3.0 T; 3、蛋白酶subtilisin Carlsberg; 4、蛋白酶bacillolysin。
圖2不同轉(zhuǎn)酯化酯底物對轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響。1、蛋白酶bacillolysin; 2、 脂肪酶LPL-3; 3、蛋白酶subtilisin Carlsberg; 4、蛋白酶Alcalase 3.0 T。
圖3不同有機(jī)溶劑對轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響。1、蛋白酶bacillolysin; 2、脂肪 酶LPL-3; 3、蛋白酶subtilisin Carlsberg; 4、蛋白酶Alcalase 3.0 T。
具體實施例方式
實施例l:不同參試用酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的能力
實驗用酶均為商品化酶制劑，蛋白酶bacillolysin (最適溫度37°C，最適 pH7.5)購自日本東京化成工業(yè)株式會社，脂肪酶LPL-3 (最適溫度50'C，最 適pH7.0)購自日本天野酶制品株式會社，蛋白酶subtilisin Carlbergs (最適溫 度37。C，最適pH7.5)購自Sigma公司，蛋白酶Alcalase 3.0 T(最適溫度50°C， 最適pH 8.5)購自Novozymes公司。NBD-H.NH2NH2購買于日本東京化成株 式會社，色譜純。月桂酸乙烯基酯(色譜純)購買于日本東京化成工業(yè)株式會 社。丙酸乙烯基酯(色譜純)購買于Sigma。熒光測定所用1420 multilabel counter 型多功能分辨熒光儀為美國PerkinElmer公司生產(chǎn)。
按照上述方法研究上述4種酶的催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的能力，如圖1所示。脂 肪酶LPL-3催化的反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度在1.5 h后進(jìn)入平臺期，反應(yīng)2 h的熒光 強(qiáng)度比1.5 h的只增加了 2.3%，其余三種酶催化的體系熒光強(qiáng)度在實驗時間內(nèi) 一直呈現(xiàn)增長趨勢。實驗結(jié)果說明實驗所用4種酶都能在異辛烷中催化丙酸乙烯基酯和正丙醇發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，催化能力是脂肪酶LPL-3〉蛋白酶Alcalase 3.0 T〉蛋白酶subtilisin Carlsberg〉蛋白酶bacillolysin。
反應(yīng)進(jìn)行到2h時，脂肪酶LPL-3催化體系的相對熒光強(qiáng)度為100%，蛋 白酶Alcalase 3.0 T催化體系的相對熒光強(qiáng)度為73.5%，蛋白酶subtilisin Carlsberg催化體系的相對熒光強(qiáng)度為43.4%，蛋白酶bacillolysin催化體系的相 對熒光強(qiáng)度為7.9°/。。
實施例2:研究不同轉(zhuǎn)酯化酯底物對反應(yīng)的影響
以醇部分結(jié)構(gòu)相同、羧酸部分碳鏈長短不同的丙酸乙烯基酯和月桂酸乙烯 基酯作為酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的底物，研究不同分子大小酯底物對反應(yīng)的影響。 實驗所用4種酶分別催化丙酸乙烯基酯和正丙醇反應(yīng)的能力均大于催化月桂酸 乙烯基酯和正丙醇反應(yīng)的能力，說明小分子酯底物有利于酶作用。
實施例3:研究不同有機(jī)溶劑對反應(yīng)的影響
以丙酸乙烯基酯和正丙醇為底物，比較不同疏水性有機(jī)溶劑異辛烷(log
P=4.5)、甲苯(logP=2.5)、乙腈(logP=-0.33)對酶催化能力的影響。這4種 酶的催化能力在異辛烷和甲苯、乙腈體系中呈現(xiàn)出一致的趨勢，但是隨著有機(jī) 溶劑疏水性的下降，這4種酶的催化活性迅速下降蛋白酶bacillolysin、脂肪 酶LPL-3、蛋白酶subtilisin Carlsberg和蛋白酶Alcalase 3.0 T在甲苯中的催化 能力分別只有在異辛垸中的11.5%、 10.1%、 10.8%和8.8%;在乙腈中的催化 能力分別只有在異辛垸中的5.7%、 4.1%、 5.3%和4.7%。與甲苯、乙腈相比， 疏水性較強(qiáng)的異辛烷比較適合做為酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的溶劑。 所得結(jié)果為
1) 實驗所用4種酶在異辛烷中催化丙酸乙烯基酯和正丙醇，發(fā)生轉(zhuǎn)酯化 反應(yīng)的能力是脂肪酶LPL-3〉蛋白酶Alcalase 3.0 丁>蛋白酶subtilisin Carisberg> 蛋白酶bacillolysin。
2) 實驗所用4種酶催化丙酸乙烯基酯和正丙醇反應(yīng)的能力均大于催化月 桂酸乙烯基酯和正丙醇反應(yīng)的能力。
3) 與甲苯、乙腈相比，疏水性較強(qiáng)的異辛烷更適合做為酶催化轉(zhuǎn)酯化反 應(yīng)的溶劑。
權(quán)利要求
1、熒光分光光度法篩選催化非水相體系轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)用酶的方法，其特征是a、酶催化乙烯基酯和伯醇類物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物之一的乙烯基醇通過酮式-烯醇式互變異構(gòu)生成乙醛，使轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)不可逆；b、乙醛和4-肼基-7-硝基-2，1，3-苯并氧雜二唑肼NBD-H.NH2NH2反應(yīng)生成熒光衍生物，并通過測定該熒光衍生物的熒光強(qiáng)度來間接反映酶的催化能力；步驟為(1)酶的冷凍干燥配制濃度為1. 333g/L的酶溶液，加入酶溶液重量百分5％蔗糖作為冷凍干燥保護(hù)劑，充分振蕩溶解后，用移液槍分裝到0.5mL離心管中，300μL/管，進(jìn)行冷凍干燥，得冷凍干燥酶粉備用；所選用的酶、酶溶液配制為蛋白酶bacillolysin用pH7.5、0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液配制；蛋白酶subtilisin Carlsberg用pH7.5、0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液配制；脂肪酶LPL-3用pH7.5、0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液配制；蛋白酶Alcalase 3.0T用pH8.0、0.1mol/L的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液配制；(2)配制NBD-H. NH2NH2異辛烷溶液準(zhǔn)確稱取一定量的NBD-H.NH2NH2至預(yù)先定量好的異辛烷中，配制濃度為200μmol/L的NBD-H.NH2NH2異辛烷溶液，使用旋渦混勻器連續(xù)震蕩直到NBD-H.NH2NH2完全溶解，該溶液在配制后3天內(nèi)使用；NBD-H.NH2NH2溶解于甲苯和乙腈中時也照此操作；(3)酶反應(yīng)及熒光測定在裝有冷凍干燥酶粉的0.5mL離心管中依次加入①、200μL 200μmol/L的NBD-H.NH2NH2異辛烷溶液，②、0.2mmol正丙醇為15μL，和③、0.02mmol丙酸乙烯基酯為2μL或0.02mmol月桂酸乙烯基酯為5μL；使用旋渦混勻器震蕩混勻，在酶的反應(yīng)溫度下于恒溫震蕩水浴中反應(yīng)1.5h，反應(yīng)結(jié)束后靜置片刻，用移液槍吸取200μL上清液至黑色不透明96孔板中測定熒光強(qiáng)度，每個條件做3個平行樣，測定結(jié)果取平均值，熒光測定條件為激發(fā)光波長435nm，發(fā)射光波長535nm，激發(fā)時間1s，采取頂部閱讀模式，數(shù)據(jù)分析時采用相對熒光強(qiáng)度表示，以同批次測定中最高熒光強(qiáng)度為100％；所選用的酶的反應(yīng)溫度為蛋白酶bacillolysin溫度37℃；蛋白酶subtilisinCarlsberg溫度37℃；脂肪酶LPL-3溫度50℃；蛋白酶Alcalase 3.0T溫度50℃。
全文摘要
熒光分光光度法篩選催化非水相體系轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)用酶的方法，屬于酶反應(yīng)及熒光測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過a、酶催化乙烯基酯和伯醇類物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物之一的乙烯基醇通過酮式-烯醇式互變異構(gòu)生成乙醛，使轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)不可逆；b、乙醛和4-肼基-7-硝基-2，1，3-苯并氧雜二唑肼(NBD-H.NH₂NH₂)反應(yīng)生成熒光衍生物，并通過測定該熒光衍生物的熒光強(qiáng)度來間接反映酶的催化能力；本發(fā)明操作簡潔，能直觀明了判定非水相中酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)能否發(fā)生，可以比較能催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)酶的催化活性，并可以通過本發(fā)明方法對影響酶催化反應(yīng)的因素進(jìn)行研究。
文檔編號G01N21/64GK101430279SQ200810194918
公開日2009年5月13日 申請日期2008年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月27日
發(fā)明者穎 張, 王樹根, 范雪榮, 谷家棟 申請人:江南大學(xué)