專利名稱：過氧化氫的生物傳感酶檢測電極及其的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種傳感器技術(shù)領(lǐng)域的裝置和方法，具體是一種過氧化氫的生物 傳感酶檢測電極及其的檢測方法。
背景技術(shù)：
過氧化氫作為一種常見的抑菌保鮮劑在食品行業(yè)中應(yīng)用廣泛，如在水發(fā)食品 牛百葉、海蜇、魚翅以及蝦仁、帶魚、魷魚、水果罐頭、和面制品等的生產(chǎn)過程 中添加雙氧水，以提高產(chǎn)品的外觀形象。隨著生活水平的提高，人們對健康環(huán)保 意識逐漸增強(qiáng)，對食品品質(zhì)的要求日益提高，食品安全問題在我國得到了越來越 廣泛的重視，有關(guān)過氧化氫的殘留危害的問題也日漸引起人們的注意。國內(nèi)外很 多研究表明，過氧化氫殘留對機(jī)體某些生物大分子有很強(qiáng)的損傷作用，有較強(qiáng)的 致癌性。因而建立一種快速有效的檢測過氧化氫的方法，對于加強(qiáng)食品安全，保 護(hù)人民群眾的健康有重要的意義。
目前，測定過氧化氫的主要方法有分光光度法、原子吸收法、光化學(xué)方法以 及電化學(xué)方法等。其中采用電化學(xué)方法檢測過氧化氫，具有樣品處理簡單，操 作方便，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前研究過氧化氫檢測的一個熱點(diǎn)。當(dāng)前檢測食 品及保健品中過氧化氫的國家標(biāo)準(zhǔn)方法是化學(xué)滴定法(GB1616-88高錳酸鉀法或 碘量法)，該方法的樣品前處理過程復(fù)雜，檢測時間長，滴定終點(diǎn)難掌握，并且 常因食品中含有還原性物質(zhì)(如維生素C等)的存在導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高，并且 檢測限一般為100ppm左右，達(dá)不到許多微量或痕量檢測要求。目前尚未見到有 關(guān)采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)產(chǎn)業(yè)化制作一次性用于殘留過氧化氫檢測酶電極的相關(guān)報 道。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利申請?zhí)枮?3132054.6，名稱為"一 種制備二氧化鈦凝膠膜電化學(xué)生物傳感器的方法"，該專利中采用二氧化鈦凝膠 膜對傳統(tǒng)電極進(jìn)行修飾，然后采用電化學(xué)的方法來檢測過氧化氫。該方法制備修 飾電極的過程相當(dāng)復(fù)雜，電極的準(zhǔn)備時間超過2小時，制備出的修飾電極穩(wěn)定性
差，修飾電極不能長期保存，當(dāng)保存時間超過一個月時，電極的響應(yīng)靈敏度下降 超過25%，因而不能大范圍推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種過氧化氫的生物傳 感酶檢測電極及其的檢測方法，使其易于產(chǎn)業(yè)化制作和一次性使用，并且大大縮 短了樣品處理和檢測時間，從而實(shí)現(xiàn)樣品的現(xiàn)場快速檢測。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明涉及一種過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，包括電極基片、接線端
子、電極連線、工作電極、對電極、隔離片和蓋片，其中
接線端子、電極連線與工作電極連成一體組成一條電極基體，接線端子、電
極連線與對電極連成一體組成另一條電極基體，兩條電極基體相互平行，電極連
線表面上涂覆一層聚碳酸酯絕緣體，兩條電極基體設(shè)置在電極基片上，接線端子
和對電極均為裸露的導(dǎo)電材料薄膜，在相互平行的對電極和工作電極兩端覆蓋有
隔離片，隔離片與對電極、工作電極垂直放置，隔離片上部覆蓋蓋片，電極、隔
離片和蓋片之間的空隙形成加樣孔。
所述工作電極、對電極，其形狀均為正方形或長方形塊狀。
所述電極基片，是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚
乙烯、聚乙烯對苯二甲酸鹽中任選一種聚合物制成，該聚合物為片材或巻材。 所述隔離片，其雙面帶膠貼片，厚度均勻，是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、
聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙烯對苯二甲酸鹽任選一種聚合物制成，該聚
合物為片材或巻材。
所述蓋片，選用透明聚氯乙烯片、聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯乙烯片、聚酰
亞胺片、聚乙烯片、聚乙烯對苯二甲酸鹽片任選一種聚合物制成。 所述兩條平行電極連線之間的間距為2.5 mm 3mm。 所述工作電極，其與對電極之間的間距為0.8mm lmm。 本發(fā)明還涉及一種如應(yīng)用上述過氧化氫的生物傳感酶檢測電極的檢測方法，
包括如下步驟
步驟一，在生物傳感酶檢測電極的工作電極上采用涂布法涂布一層殼聚糖 膜，晾干后，在電極的工作電極上滴加lnL-5pL2mg/mL的辣根過氧化物酶液， 低溫冷凍干燥，粘貼上隔離片，然后蓋上蓋片，在4'C環(huán)境下保存生物傳感酶檢
測電極；
步驟二，制備鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺溶液取鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺0.1g-0.3g，加入無 水乙醇1 mL -5mL，然后再加入二氧六環(huán)1 mL -5mL，最后用pH5.0的檸檬酸緩 沖液定容為100mL，避光保存；
步驟三，向待測的含有過氧化氫的樣品液中加入鹽酸溶液后，與鹽酸鄰聯(lián)甲 苯胺溶液等體積混合形成反應(yīng)液，并將生成的反應(yīng)液滴加到生物傳感酶檢測電極 中加樣孔；
步驟四，檢測工作電極與對電極之間的電流，若電流在電流檢測儀的檢測范 圍之內(nèi)，則可通過電流檢測儀自動處理轉(zhuǎn)化，并與單片機(jī)中儲存的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行 比對，轉(zhuǎn)化為過氧化氫的濃度，直接由顯示器顯示出檢測結(jié)果，若電流低于或高 于電流檢測儀的檢測范圍，則顯示器顯示過氧化氫濃度低于檢測范圍的最小值或 高于檢測范圍的最大值。
所述電流檢測儀的檢測范圍為5mg/L-200 mg/L。
本發(fā)明利用殼聚糖良好的成膜性和較好的粘結(jié)能力以及其內(nèi)部的極性化學(xué) 基團(tuán)，將辣根過氧化物酶(HRP)固定在生物傳感酶檢測電極中工作電極的表面， 制成能夠?qū)^氧化氫進(jìn)行快速檢測的電流型生物傳感器，過氧化氫與鹽酸鄰聯(lián)甲 苯胺在HRP的催化作用下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電子遷移，形成電流，電流 強(qiáng)度與過氧化氫濃度成正比，檢測范圍為5mg/L-200mg/L。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果
本發(fā)明具有絲網(wǎng)印刷電極結(jié)構(gòu)簡單，加工方法簡便、成本低，用該絲網(wǎng)印刷 電極制成的傳感器檢測過氧化氫操作方便，樣品前處理簡單，檢測時間短，只需 6秒，而且抗干擾能力較強(qiáng)，檢測靈敏度高。
本發(fā)明能夠進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，在食品中過氧化氫的現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域?qū)⒂泻?好的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明中生物傳感酶檢測電極的平面結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本發(fā)明中生物傳感酶檢測電極的空間結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為本發(fā)明中生物傳感酶檢測電極的橫向剖面示意圖； 圖4為本發(fā)明的實(shí)施例中標(biāo)定的檢測結(jié)果曲線圖，
圖中，圖(a)為生物傳感酶檢測電極檢測過氧化氫時間與電流曲線圖，圖
(b)為過氧化氫濃度與電流的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5為本發(fā)明進(jìn)行快速檢測殘留過氧化氫的工作原理圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù) 范圍不限于下述的實(shí)施例。
如圖l、 2、 3所示，本實(shí)施例涉及一種過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，包 括電極基片l、接線端子2、電極連線3、工作電極4、對電極5、隔離片6和
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接線端子2、電極連線3與工作電極4連成一體組成一條電極基體，接線端 子2、電極連線3與對電極5連成一體組成另一條電極基體，兩條電極基體相互 平行，電極連線3表面上涂覆一層聚碳酸酯絕緣體8，兩條電極基體設(shè)置在電極 基片1上，接線端子2和對電極5均為裸露的導(dǎo)電材料薄膜，在相互平行的對電 極5和工作電極4兩端覆蓋有隔離片6，隔離片6與對電極5、工作電極4垂直 放置，隔離片6上部覆蓋蓋片7，對電極5、工作電極4、隔離片6和蓋片7之 間的空隙形成加樣孔9。
所述電極基片1，其長度為32mm 36mm、寬度為7mm 8mm、厚度為0.3 mm ~0.5mm;
所述接線端子2，其長度為4 mm 6mrn、寬度為1.5 mm 2mrn; 所述電極連線3，其長度為20 mm 25mrn、寬度為0.8 mm-lmm; 所述工作電極4，其形狀為實(shí)心方片狀，長度為2mm 3mm、寬度為2mm ~3mm;
所述對電極5，其形狀為實(shí)心方片狀，長度為2 mm 3mrn、寬度為2 mm ~3mm;
所述隔離片6，其長度為7~8mm、寬度為3 mm ~4mm、厚度為0.3 mm ~0.4mm;
所述蓋片7，其長度為10~14mm、寬度為7 mm ~8mm、厚度為0.2 mm 0.3mm;
所述兩條平行電極連線3，其之間的間距為2.5 mm ~3mm; 所述工作電極4，其與對電極5之間間距0.8 mm lmm。所述電極基片l，其材料為聚乙烯對苯二甲酸鹽，該聚合物為片材或巻材。 所述隔離片6，其材料為聚氯乙烯，該聚合物為片材或巻材。 所述蓋片7，其材料為聚氯乙烯片。
本實(shí)施例還涉及一種如應(yīng)用上述過氧化氫的生物傳感酶檢測電極進(jìn)行檢測
的方法，包括如下步驟
步驟一，在生物傳感酶檢測電極的工作電極上采用涂布法涂布一層殼聚糖
膜，晾干后，在電極的工作電極上滴加lpL-5nL2mg/mL的辣根過氧化物酶液， 低溫冷凍干燥，粘貼上隔離片，然后蓋上蓋片，在4t:環(huán)境下保存生物傳感酶檢 測電極；
步驟二，制備鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺溶液取鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺0.1g-0.3g，加入無 水乙醇1 mL -5mL，然后再加入二氧六環(huán)1 mL -5mL，最后用pH5.0的檸檬酸緩 沖液定容為100mL，避光保存；
步驟三，向待測的含有過氧化氫的樣品液中加入鹽酸溶液后，與鹽酸鄰聯(lián)甲 苯胺溶液等體積混合形成反應(yīng)液，并將生成的反應(yīng)液滴加到生物傳感酶檢測電極 中加樣孔；
步驟四，檢測工作電極與對電極之間的電流，若電流在電流檢測儀的檢測范 圍之內(nèi)，則可通過電流檢測儀自動處理轉(zhuǎn)化，并與單片機(jī)中儲存的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行 比對，轉(zhuǎn)化為過氧化氫的濃度，直接由顯示器顯示出檢測結(jié)果，若電流低于或高 于電流檢測儀的檢測范圍，則顯示器顯示過氧化氫濃度低于檢測范圍的最小值或 高于檢測范圍的最大值。
所述電流檢測儀的檢測范圍為5mg/L-200 mg/L。
本實(shí)施例中，采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)將導(dǎo)電銀漿在電極基片上印刷兩條電極的基 體，它們上端為裸露的接線端子，它們的中間部分的電極連線表面上涂覆一層聚 碳酸酯絕緣體，下端為相互平行的工作電極和對電極(工作電極和對電極也可單 獨(dú)用碳漿印制)。
隔離片與工作電極和對電極的兩端對齊，形成的加樣孔的孔隙不能太大，加 樣孔主要是采用毛細(xì)現(xiàn)象讓反應(yīng)液滴自動進(jìn)入空隙，并與工作電極上的反應(yīng)層相 接觸發(fā)生反應(yīng)。
用300nm的二氧化鈦納米粉將工作電極拋光，再用質(zhì)量百分比為50%的硝 酸浸泡處理，最后用蒸餾水沖洗3次，用涂布法在工作電極上涂布一層質(zhì)量百分
比為3%水溶性殼聚糖溶液，晾干，然后滴加2微升3mg/mL的辣根過氧化物酶 液，4'C晾干，粘貼上隔離片，然后蓋上蓋片。
如圖4所示，標(biāo)定過氧化氫溶液濃度與時間、電流的曲線圖
將質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的過氧化氫溶液采用高錳酸鉀滴定法滴定，然后分別稀釋成 以下濃度0.0mg/L、 5mg/L、 10mg/L、 20mg/L、 40mg/L、 80mg/L、 120mg/L、 160mg/L作為標(biāo)準(zhǔn)液。
將每種濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液與等體積的鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺溶液混合均勻形 成反應(yīng)液，取10微升滴在以上述方法制成的生物傳感酶檢測電極的加樣孔中，測 定并記錄電極的時間電流曲線，每一種過氧化氫濃度平行測定四次，過氧化氫濃 度與傳感器測定的電流在加樣后6秒時成良好正比例關(guān)系。
樣品處理
(1) 液體樣品用lmL移液器準(zhǔn)確移取樣品0.9mL，加入0.1mol/L鹽酸100 微升，攪拌均勻，靜置5分鐘，然后離心，取上清液作為待測溶液。
(2) 固體樣品用電子天平稱取樣品1.00g，然后加入蒸餾水2mL攪拌l分 鐘，然后加入0.1mol/L鹽酸100微升，攪拌均勻，靜置5分鐘，然后離心，取上清 液作為待測溶液。
分別將上述液體樣品制成的待測溶液和固體樣品制成的待測溶液，與鹽酸鄰 聯(lián)甲苯胺溶液等體積混合滴加到已標(biāo)定好的生物傳感酶檢測電極的加樣孔中，檢 測過氧化氫殘留，最低檢測限達(dá)到0.5mg/L。
如圖5所示，本實(shí)施例使用生物傳感酶檢測電極和電流檢測裝置進(jìn)行快速檢 測殘留過氧化氫的工作原理圖，生物傳感酶檢測電極上HRP催化反應(yīng)液中的過 氧化氫發(fā)生氧化還原反應(yīng)，放出電子，電子再與反應(yīng)液中的鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺反應(yīng)， 生成傳電子絡(luò)合物，電子在傳感器檢測儀的恒電位激勵下發(fā)生定向移動形成電 流，電流被轉(zhuǎn)換及放大后經(jīng)過模數(shù)轉(zhuǎn)換器之后，由單片機(jī)將電信號轉(zhuǎn)換成過氧化 氫濃度直接從液晶顯示器上讀出，同時還將數(shù)據(jù)存儲到存儲器中。
本實(shí)施例重復(fù)性好，反應(yīng)靈敏，檢測時間短，只需6秒，樣品處理方法簡單， 而且抗干擾能力較強(qiáng)，在食品中過氧化氫的現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域?qū)⒂泻芎玫膽?yīng)用前
學(xué)
權(quán)利要求
1. 一種過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，包括電極基片、接線端子、電極連線、工作電極、對電極，其特征在于，還包括隔離片和蓋片，其中接線端子、電極連線與工作電極連成一體組成一條電極基體，接線端子、電極連線與對電極連成一體組成另一條電極基體，兩條電極基體相互平行，電極連線表面上涂覆一層聚碳酸酯絕緣體，兩條電極基體設(shè)置在電極基片上，接線端子和對電極均為裸露的導(dǎo)電材料薄膜，在相互平行的對電極和工作電極兩端覆蓋有隔離片，隔離片與對電極、工作電極垂直放置，隔離片上部覆蓋蓋片，電極、隔離片和蓋片之間的空隙形成加樣孔。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述工作電極、對電極，其形狀均為正方形或長方形。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述電極基片，是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯、 聚乙烯對苯二甲酸鹽中任選一種聚合物制成，該聚合物為片材或巻材。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所述隔離片，其雙面帶膠貼片，厚度均勻，厚度為0.3mm 0.4mm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述隔離片，是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚 乙烯對苯二甲酸鹽中任選一種聚合物制成，該聚合物為片材或巻材。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述蓋片，是由透明聚氯乙烯片、聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯乙烯片、聚酰亞胺片、 聚乙烯片、聚乙烯對苯二甲酸鹽片中任選一種聚合物制成。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述兩條平行電極連線之間的間距為2.5 mm 3mm。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述工作電極，其與對電極之間的間距為0.8 mm -lrnm。
9、 一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極的檢測方 法，其特征在于，包括如下步驟 步驟一，在生物傳感酶檢測電極的工作電極上采用涂布法涂布一層殼聚糖 膜，晾干后，在電極的工作電極上滴加lpL-5nL2mg/mL的辣根過氧化物酶液， 低溫冷凍干燥，粘貼上隔離片，然后蓋上蓋片，在4'C環(huán)境下保存生物傳感酶檢 測電極；步驟二，制備鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺溶液取鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺0.1g-0.3g，加入無 水乙醇1 mL -5mL，然后再加入二氧六環(huán)1 mL -5mL，最后用pH5.0的檸檬酸緩 沖液定容為100mL，避光保存；步驟三，向待測的含有過氧化氫的樣品液中加入鹽酸溶液后，與鹽酸鄰聯(lián)甲 苯胺溶液等體積混合形成反應(yīng)液，并將生成的反應(yīng)液滴加到生物傳感酶檢測電極 中加樣孔；步驟四，檢測工作電極與對電極之間的電流，若電流在電流檢測儀的檢測范 圍之內(nèi)，則可通過電流檢測儀自動處理轉(zhuǎn)化，并與單片機(jī)中儲存的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行 比對，轉(zhuǎn)化為過氧化氫的濃度，直接由顯示器顯示出檢測結(jié)果，若電流低于或高 于電流檢測儀的檢測范圍，則顯示器顯示過氧化氫濃度低于檢測范圍的最小值或 高于檢測范圍的最大值。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用過氧化氫的生物傳感酶檢測電極進(jìn)行檢測的 方法，其特征是，所述檢測范圍為5mg/L-200mg/L。
全文摘要
一種材料分析技術(shù)領(lǐng)域的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極及其的檢測方法，生物傳感酶檢測電極包括電極基片、接線端子、電極連線、工作電極、對電極、隔離片和蓋片，在對電極和工作電極兩端覆蓋上隔離片，在隔離片上部覆蓋蓋片，電極、隔離片和蓋片之間的空隙形成加樣孔。本發(fā)明方法中，將辣根過氧化物酶固定在生物傳感酶檢測電極中工作電極的表面，制成能夠?qū)^氧化氫進(jìn)行快速檢測的電流型生物傳感器，過氧化氫與鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺在HRP的催化作用下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電子遷移，形成電流。本發(fā)明能大大縮短樣品處理和檢測時間，實(shí)現(xiàn)樣品中過氧化氫的快速檢測，且易于產(chǎn)業(yè)化制作和一次性使用。
文檔編號G01N27/327GK101393158SQ200810201618
公開日2009年3月25日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者劉國艷, 劉海峰, 柴春彥 申請人:上海交通大學(xué)