專利名稱：一種核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及結(jié)核分枝桿菌活菌核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
自1882年Koch發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)是結(jié)核 病的病原菌以來的100余年，人類對結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)特性、致病機(jī)制、耐藥機(jī)制、診 斷方法、抗結(jié)核藥物的研制等方面都取得了巨大的成就。而如今，結(jié)核病仍然是影響人類健 康流行性最廣、病死率最高的感染性疾病之一。尋求快速、準(zhǔn)確的診斷方法一直是結(jié)核病學(xué) 首要研究的領(lǐng)域。 近IO年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對結(jié)核分枝桿菌DNA的檢測研究頗多，和培養(yǎng) 方法比較，DNA檢測的高敏感、高特異和快速性給結(jié)核病的診斷帶來新的期望。但DNA作為 半衰期較長的穩(wěn)定核酸分子，據(jù)研究報(bào)道，在接受標(biāo)準(zhǔn)有效治療的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中，培 養(yǎng)轉(zhuǎn)陰后180天仍有25%的標(biāo)本DNA檢測陽性?？赡艿脑蚪忉屖菢?biāo)本中有死菌和DNA降 解的延滯、L型培養(yǎng)以及持留菌和休眠菌的存在等。可見，以DNA為基礎(chǔ)的檢測，存在平臺 效應(yīng)，不能用于結(jié)核分枝桿菌的活菌診斷。 核糖體RNA(rRNA)是生物細(xì)胞核糖體內(nèi)的遺傳物質(zhì)，在原核生物中有多個(gè)拷貝存 在，每個(gè)結(jié)核分枝桿菌的rRNA有近5000個(gè)拷貝。有學(xué)者在觀察分枝桿菌體內(nèi)外死亡降解 的過程時(shí)發(fā)現(xiàn)，核糖體是第一個(gè)伴隨細(xì)菌活力消失而降解的超微結(jié)構(gòu)，因而認(rèn)為rRNA可作 為結(jié)核分枝桿菌的活菌標(biāo)志。Van derVliet等通過體外擴(kuò)增16S rRNA進(jìn)行分枝桿菌活菌 檢測和藥敏試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該方法能在3 7天內(nèi)獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可計(jì)算出各種藥物的藥 效學(xué)參數(shù)。但Hellyer等(J Clin Microbiol, 37 (2) :290-295,1999)的研究結(jié)果顯示結(jié) 核分枝桿菌的rRNA水平在含藥培養(yǎng)基中72h內(nèi)無明顯變化。Moore等(J ClinMicrobiol， 34(7) :1745-1749， 1996)通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，rRNA也顯示平臺效應(yīng)。所以，rRNA在用于結(jié) 核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)和化療監(jiān)測時(shí)仍存在很大的局限性，也不能用于結(jié)核分枝桿菌的活菌 診斷。 原核生物的mRNA分子，半衰期很短(僅有3 5min)，僅存在于活的、有代謝活性 的菌體中，一般認(rèn)為mRNA是一活性增殖細(xì)胞的很好的分子標(biāo)記物。所以，以mRNA為靶標(biāo)的 檢測只能是活菌，是監(jiān)測藥物敏感性和化療反應(yīng)的很好的分子指標(biāo)。結(jié)核分枝桿菌的85-B mRNA編碼的蛋白85-B，是結(jié)核分枝桿菌的主要分泌性蛋白抗原復(fù)合物85的組成之一，該抗
原復(fù)合物作為結(jié)核分枝桿菌的特異性分泌蛋白，在液體培養(yǎng)基和巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)非常 豐富，所以活菌細(xì)胞內(nèi)存在豐富的85-B mRNA分子。Desjardin等(Am J RespirCrit Care Med，160 :203-210,1999)研究了經(jīng)藥物治療肺結(jié)核患者痰液樣本中提取的結(jié)核分枝桿菌 85-B mRNA、16S rRNA以及IS110DNA含量和涂片染色、培養(yǎng)結(jié)果的關(guān)系，顯示涂片培養(yǎng)測得 的活菌數(shù)量與85-B mRNA含量相關(guān)性最好。因此，選擇85-B mRNA為靶標(biāo)可準(zhǔn)確檢測結(jié)核 分枝桿菌的活菌。 在核酸檢測過程中，多數(shù)情況下樣本中的核酸含量較低，為了使檢測達(dá)到一定的靈敏度和準(zhǔn)確度，需要對樣本中的待測核酸片段進(jìn)行有效擴(kuò)增，目前聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction,PCR)和進(jìn)一步發(fā)展的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已經(jīng)成為核酸擴(kuò)增 檢測的主流技術(shù)手段，用于核酸模板的擴(kuò)增及定性定量檢測。雖然實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測 具有靈敏、快速的優(yōu)點(diǎn)，但檢測時(shí)需昂貴的循環(huán)變溫設(shè)備、操作嚴(yán)格分區(qū)等因素而限制了其 在基層醫(yī)院的推廣使用。目前，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌，擴(kuò)增的是樣本中 的總DNA，不能剔除樣本中的死菌，因此不能用于結(jié)核分枝桿菌的活菌檢測。
1991年Compton提出了基于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(Nucleic Acid SequenceBased Amplification, NASBA) (Nature, 350 (6313) :91 92， 1991)，為基因擴(kuò)增技術(shù)提出了新的 概念。該技術(shù)是以RNA分子的逆轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)錄為技術(shù)主線，通過單向恒溫?cái)U(kuò)增，短時(shí)間內(nèi)形 成相當(dāng)于原RNA拷貝數(shù)近百萬倍的RNA擴(kuò)增子，最后擴(kuò)增產(chǎn)物通過電化學(xué)發(fā)光儀器檢測。 1997年，Gen-Probe公司也開發(fā)了與NASBA原理類似的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)(Transcription MediatedAmplification， TMA)(Journal of Clinical Microbiology,35 (3) :676-678， 1997)，其與NASBA的核酸擴(kuò)增方法原理相同，而TMA的擴(kuò)增結(jié)果是通過雜交保護(hù)測定 (Hybridization Protection Assay,HPA)技術(shù)進(jìn)行定性檢測。NASBA和TMA等核酸恒溫?cái)U(kuò) 增檢測技術(shù)無需進(jìn)行類似于PCR過程的溫度循環(huán)，因此擴(kuò)增不需要復(fù)雜昂貴的熒光PCR儀 器；同時(shí)由于擴(kuò)增模板是RNA，即使在有DNA污染或存在的情況下，同樣具有較高的特異性 和靈敏度。 納米金探針檢測技術(shù)是一種新型的核酸檢測方法，它利用納米金顆粒標(biāo)記的寡核 苷酸探針與核酸靶序列雜交，形成伸展的納米金顆粒一多核苷酸的多聚網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由此引 發(fā)納米金粒子光學(xué)性質(zhì)的變化，產(chǎn)生雜交信號以雜交液/板/試紙顏色變化顯示，存在相互 作用的雜交液/板/試紙顯示為藍(lán)色或藍(lán)紫色，沒有作用的顯示為紅色，微量核酸通過雜交 信號的放大從而被檢測。如果納米金探針檢測技術(shù)結(jié)合NASBA或TMA等類似RNA等溫?cái)U(kuò)增 技術(shù)，微量模板可通過擴(kuò)增的模板拷貝數(shù)和納米金探針檢測的顯色信號兩級放大而得到檢 測?；谶@種RNA核酸等溫轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增和納米金探針檢測方法(Nucleic Acidlsothermal and Transcriptional Amplification with Gold Nano—particle Probes,NITAG)，擴(kuò)增檢領(lǐng)lj結(jié) 核分枝桿菌的85-B mRNA模板，就能實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的活菌檢測，該技術(shù)具有無需特殊昂 貴設(shè)備、檢測靈敏快速、結(jié)果直觀可見等優(yōu)點(diǎn)，適合于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的推廣應(yīng)用，目前NITAG 技術(shù)在活菌檢測中應(yīng)用尚無報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于NATAG技術(shù)的結(jié)核分枝桿菌活菌檢 測方法和試劑盒，為結(jié)核分枝桿菌活菌的檢測、治療藥物療效觀察、抗結(jié)核藥物篩選和藥敏 實(shí)驗(yàn)等研究的提供輔助實(shí)驗(yàn)手段。結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性試驗(yàn)，特別是治療療效的評 價(jià)對活菌的存在有嚴(yán)格的依賴性，因此，結(jié)核分枝桿菌活菌的檢測具有重要的臨床意義及 廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
技術(shù)方案 本發(fā)明提供一種基于NITAG技術(shù)擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌活菌靶基因85-BmRNA的寡聚 核苷酸引物對和探針，其中引物對具有SEQ ID N0:1和SEQID N0:2的序列(SEQ ID NO :25，端含有能被T7RNA聚合酶識別的啟動(dòng)子序列)；檢測探針具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO : 4的序列(前者5'端和后者3'端分別經(jīng)過己烷巰基化處理)，捕獲探針具有SEQ ID NO :5 的序列(5'端生物素Biotin標(biāo)記)。
SEQ ID NO 1 :5， -ggCTgCCAgACTTACAAgTg-3， SEQ ID N02 :5' AATTCTAATACgACTCACTATAggg gTAggCggCCAAgATCATTg-3， SEQ ID N03 :5， HS_(CH2)6_[TTgTCCgCCAACAgggCC] SEQ ID N04:5， [CgCTgCAATCggCTTgTCg]-(CH2)6_SH3， SEQ ID N05 :5， BI0TIN-CCTTCCTgACCAgCgAgCTg-3， 或者包含有上述序列的向5'端或/和3'端延長的序列； 或者與上述序列同源性大于85 %的序列； 或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。 在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種基于NITAG技術(shù)的85-B基因擴(kuò)增的檢測樣本中結(jié)
核分枝桿菌的方法和試劑盒，所述方法包括步驟
(l)mRNA模板在60 7(TC下解鏈后降溫； (2)加入逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和RNA聚合酶，在引物的引導(dǎo)下于37 42。C進(jìn)行等 溫?cái)U(kuò)增，獲得RNA擴(kuò)增子； (3)利用納米金顆粒標(biāo)記的寡核苷酸檢測探針和生物素標(biāo)記的寡核苷酸捕獲探針 檢測RNA擴(kuò)增子，通過在層析膜的顯色反應(yīng)獲得檢測結(jié)果，顯色條帶的存在是樣品中結(jié)核 分枝桿菌的指示。 本發(fā)明提供一種利用上述檢測方法進(jìn)行MTB mRNA等溫?cái)U(kuò)增的檢測試劑盒，其組成 為NITAG反應(yīng)緩沖液、納米金顆粒標(biāo)記的寡核苷酸檢測探針、生物素(或地高辛)標(biāo)記的 寡核苷酸捕獲探針、以及固定有親和素(或抗地高辛抗體)標(biāo)記的層析膜。組裝形成的試
劑盒在-2(rc下保存。 具體而言，本發(fā)明是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的 本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌mRNA NITAG檢測技術(shù)包括樣本處理、mRNA等溫?cái)U(kuò)增以及 納米金探針檢測三個(gè)步驟。樣本處理步驟是從痰液、活檢組織等樣本或結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 物等待檢樣品中提取mRNA模板的過程，擴(kuò)增檢測對象是從樣本中提取獲得的mRNA模板。 利用提取獲得的結(jié)核分枝桿菌mRNA模板經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H(RNase H) 、 RNA聚合 酶(RNA Pol)等溫?cái)U(kuò)增出的大量RNA擴(kuò)增子，并結(jié)合烷巰基化寡核苷酸標(biāo)記的納米金探針 檢測，通過層析膜顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對RNA模板的檢測。 本發(fā)明的等溫?cái)U(kuò)增體系包括RNA模板、引物及緩沖液等組成，檢測體系包括納米 金探針、捕獲探針及緩沖液等組成，其具體操作為將待測標(biāo)本提取的RNA置入反應(yīng)緩沖 液，在60 70 (最優(yōu)選65) t:和37 42 (最優(yōu)選41) 。C下先后處理5min，加入混合酶，在 37 42(最優(yōu)選41)t:下反應(yīng)90 120min ;然后再將RNA擴(kuò)增產(chǎn)物與納米金檢測探針以 及生物素標(biāo)記捕獲探針緩沖液混合檢測，在37 65t:處理5min冷卻后在膜上層析顯色。
本發(fā)明的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液各組分的終濃度為20 60mM Tris-HCl (pH8. 0 9. 0)、30 90mM KCl、10 20mM MgCl2、0. 5 5mM脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 、 1 10mM 核糖核苷三磷酸(NTPs)、4 20mM二硫蘇糖醇(DTT)、10 20% (v/v) 二甲基亞砜(DMSO);所說的兩種引物(包括帶有RNA聚合酶啟動(dòng)子識別序列的引物I和第二鏈cDNA合成引物 II)終濃度各為0. 1 1 mol/L ;所說的混合酶液各組分在20 P L反應(yīng)體系中的量為4 75U逆轉(zhuǎn)錄酶、8 3000U RNA聚合酶(識別特異啟動(dòng)子序列的T3RNA聚合酶或T7RNA聚 合酶)、0. 05 0. 3U RNase H酶、10 50U RNA酶抑制劑(RNasin Inhibitor)和0. 05 5iig小牛血清白蛋白(BSA)。所說的檢測反應(yīng)緩沖液各組分的終濃度為0.3mol/L NaCl， lOmM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)， 5 ii mol/L納米金探針、lii mol/L生物素標(biāo)記捕獲探針。層析 膜為固定有親和素的硝酸纖維膜或尼龍膜(保存于干燥環(huán)境)。 本發(fā)明所用的納米金顆粒大小為1 lOOnm，按照粒徑不同可以采用檸檬酸三鈉 還原法、白磷還原法或者抗壞血酸還原法。 本發(fā)明所述納米金寡核苷酸檢測探針的制備過程為 (1)納米金顆粒的制備在煮沸攪拌HAuCl4溶液(lmM，500mL)回流的情況下，迅速 加入50mL 38. 8mM檸檬酸三鈉溶液，溶液的顏色將由灰黃變?yōu)樯罴t，繼續(xù)回流15min，然后 冷卻至室溫，最后用0.45yM的膜進(jìn)行過濾，即得到約13nm粒徑的金顆粒。這種納米金溶 液具有518 520nm處的特征表面等離子體吸收峰。納米金顆粒上的寡核苷酸探針長度為 10 100bp，連接前需要先經(jīng)過巰基化或烷巰基化處理并純化。 (2) 3'或5'烷巰基標(biāo)記的寡核苷酸在納米金顆粒上的修飾取納米金溶液5mL(約 17nm)2. 50D烷基寡核苷酸探針(由上海生工合成，稀釋終濃度3.61ymol/L)混合并孵育 16小時(shí)左右，然后將混合溶液置于0. lmol/L NaCl， lOmM磷酸鹽緩沖液中并保持40小時(shí)，接 下來在1400r/min至少離心25min以除去未反應(yīng)的試劑。除去上清液，剩余的紅色油狀沉 淀再用緩沖液清洗，離心后保存在O. 3mol/L NaCl，10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，探針終 濃度為10iimol/L。通過紅外光譜的測定證明，每個(gè)金顆粒表面被修飾了許多探針，因此才 有可能在多核苷酸檢測過程中形成聚合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。 (3)層析膜的制備將2mg/ml親和素以2iU/cm的量加到纖維膜或尼龍膜上，在 濕度40^、溫度4(TC的環(huán)境內(nèi)自然干燥3小時(shí)；然后將膜貼于撕去不干膠的硬紙板上，上端 用濾紙覆蓋層析膜、壓緊貼上不干膠固定，最后用割膜機(jī)切割成4mm寬的試紙條狀備用(保 存于干燥環(huán)境)。 本發(fā)明檢測過程中的層析膜顯色反應(yīng)為溶液雜交后層析顯色過程。溶液雜交顯色 法即將等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物10 ii L(約lOpmol)加入至含有20 ii L納米金-烷巰基化寡核苷酸檢 測探針、10ii L生物素化捕獲探針的1. 5mL離心管中，室溫孵育15min，然后將混合溶液置于 恒溫水浴槽中并將其加熱到65t:，將混合物平衡5min，最后放入層析膜試紙條、經(jīng)過5 10min后進(jìn)行觀察，如果納米金探針與擴(kuò)增產(chǎn)物靶序列雜交，會在膜上形成藍(lán)紫色的條帶， 從而顯示結(jié)核分枝桿菌的存在，否則將不會出現(xiàn)條帶。
有益效果 本發(fā)明建立了利用NITAG技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法，從原理上分析，等 溫?cái)U(kuò)增和納米金探針均能放大檢測信號，等溫?cái)U(kuò)增放大的是RNA分子的拷貝數(shù)，納米金探 針放大的是顯色信號，加上層析步驟使顯色的雜交復(fù)合物聚集為一個(gè)窄小條帶，結(jié)果觀察 更為簡便和直觀，所以比NASBA、 TMA技術(shù)更靈敏，使實(shí)際應(yīng)用于微量RNA檢測成為可能；由 于擴(kuò)增過程中沒有大量性質(zhì)穩(wěn)定的雙鏈DNA產(chǎn)生，因此比PCR檢測能更好地排除擴(kuò)增片斷 的污染所帶來的假陽性對檢測結(jié)果的影響。
采用本發(fā)明技術(shù)，結(jié)核分枝桿菌活菌的mRNA擴(kuò)增效率、檢測靈敏度和特異性大大 的提高，并降低了 PCR擴(kuò)增檢測的假陽性率。本發(fā)明的技術(shù)方案設(shè)計(jì)合理，樣本實(shí)驗(yàn)?zāi)茉诜?子水平上證明結(jié)核分枝桿菌活菌的存在，表明該方法切實(shí)可行。基于NATAG技術(shù)的結(jié)核分 枝桿菌活菌檢測方法和試劑盒，可以作為結(jié)核分枝桿菌活菌檢測、治療藥物療效觀察、抗結(jié) 核藥物篩選和藥敏實(shí)驗(yàn)等研究的提供輔助實(shí)驗(yàn)手段，具有重要的臨床意義及廣泛的應(yīng)用價(jià) 值。


圖1為NITAG擴(kuò)增檢測結(jié)核分枝桿菌mRNA技術(shù)原理示意圖
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作 手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑購自上?；瘜W(xué)試劑廠， Trizol試劑購自Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶購自上海申能博彩生物公司，逆轉(zhuǎn)錄AMV 酶、T7RNA聚合酶、RNase H、 RNase Inhibitor和BSA均購自美國Promega公司，引物和探 針均由上海生工公司合成。
實(shí)施例1 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物的NITAG檢測 以下通過介紹結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物提取的mRNA NITAG檢測來舉例說明本發(fā)明的 實(shí)施。 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌H37Rv株(ATCC 27294)用米氏(Middlebrook) 7H9肉湯 培養(yǎng)7 14天，收獲菌體并用4mm玻璃珠振蕩5 10min打散，生理鹽水稀釋使用。
RNA提取:取250iil生理鹽水稀釋后的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物，加入500ia Trizol 提取試劑，用移液器反復(fù)吹打混勻，室溫放置5分鐘，加入200 氯仿，用手來回振蕩混勻 15秒，室溫放置5分鐘，4t: 12，000rpm離心15分鐘，將上清移入新的離心管，加入200 異丙醇，旋渦振蕩5秒，冰浴沉淀10分鐘，4°C 12， OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入500 y 1 預(yù)冷的DEPC水配制的75%乙醇洗滌，上下顛倒10次，4" 10， 000rpm離心5分鐘，吸干上 清，沉淀室溫干燥10-20分鐘，加入10 ii 1 DEPC處理的水稀釋混勻，立即使用或-7(TC保存 (使用前可加入10iU DEPC處理的水稀釋混勻)。然后加入3iillOXDNase I緩沖液、7iU RNase inhibitor, DNaseI 10 ii 1，37。C溫育15分鐘后加入1 P 1 10mM EDTA65。C 15分鐘滅 活DNaseI，短暫離心后直接用于NITAG等溫?cái)U(kuò)增。 NITAG擴(kuò)增檢測:取5 y L的提取處理后的RNA模板置入10 y L2x等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體 系緩沖液，在65"和4rC下先后處理5min，加入5 y L混合酶液，在41。C下反應(yīng)120min ;取 10 ii L等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物加入至含有20 ii L納米金-烷巰基化寡核苷酸探針、10 P L生物素化捕 獲探針的1. 5mL離心管中，室溫孵育15min，然后將混合溶液置于恒溫水浴槽中并將其加熱到65t:，將混合物平衡5min，最后放入層析膜試紙條、經(jīng)過5 10min后進(jìn)行觀察，層析膜 上形成藍(lán)紫色的條帶，說明結(jié)核分枝桿菌mRNA檢測陽性(即有活菌存在)。
實(shí)施例2 臨床肺結(jié)核患者痰液樣本的NITAG檢測 前處理方法:在結(jié)核病患者清晨深咳痰標(biāo)本中加入lml 2. 5%的N-乙?；鵢L_半 胱氨酸(NALC)后，轉(zhuǎn)入含有4mm玻璃珠的試管中振蕩，勻漿后的痰液標(biāo)本于-7(TC保存待 RNA提取。 RNA提取取500 y 1勻漿后的痰液標(biāo)本，加入1000 y 1 Trizol提取試劑，用移液 器反復(fù)吹打混勻，室溫放置5分鐘，加入200 ii 1氯仿，用手來回振蕩混勻15秒，室溫放置5 分鐘，4t: 12，000rpm離心15分鐘，將上清移入新的離心管，加入200 iU異丙醇，旋渦振蕩 5秒，冰浴沉淀10分鐘，4°C 12， OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入500 y 1預(yù)冷的DEPC水 配制的75%乙醇洗滌，上下顛倒10次，4°C 10， OOOrpm離心5分鐘，吸干上清，沉淀室溫干 燥10-20分鐘，加入10 ii 1 DEPC處理的水稀釋混勻。然后加入3 ii 1 10XDNase I緩沖液、 7ii 1 RNaseinhibitor，DNaseI 10 ii 1，37。C溫育15分鐘后加入1 ii 110mM EDTA 65°C 15分 鐘滅活DNaseI，短暫離心后直接用于NITAG等溫?cái)U(kuò)增。 NITAG擴(kuò)增柃測:取5 y L的提取處理后的RNA模板置入10 y L 2x等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng) 體系緩沖液，在65"和4rC下先后處理5min，加入5ii L混合酶液，在41。C下反應(yīng)120min ; 取10 ii L等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物加入至含有20 ii L納米金-烷巰基化寡核苷酸探針、10 P L生物素化 捕獲探針的1. 5mL離心管中，室溫孵育15min，然后將混合溶液置于恒溫水浴槽中并將其加 熱到65t:，將混合物平衡5min，最后放入層析膜試紙條、經(jīng)過5 10min后進(jìn)行觀察，層析 膜上形成藍(lán)紫色的條帶，說明結(jié)核分枝桿菌mRNA檢測陽性(即有活菌存在)。
核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING 〈110〉上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司
上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司
復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院
吳大治，夏懿，呂元 〈120〉 一種核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法及試劑盒 〈130>MTB viability 〈140>CN 〈141>2008-10-10 〈160>5 〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>20
〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis
〈400〉 1 ggctgccaga cttacaagtg20 〈210>2 〈211>45 〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis 〈400>2 aattctaata cgactcacta taggggtagg cggccaagat cattg 45 〈210>3 〈211>19 〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis 〈220〉 〈221〉己烷巰基 〈222>(1). (19) 〈223>y = HS-(CH2)6- 〈400>3 yttgtccgcc aacagggcc
19 〈210>4 〈211>20 〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis 〈220〉 〈221〉己烷巰基 〈222〉 (1) . (20) 〈223>y = - (CH2)6-SH 〈400>4 cgctgcaatc ggcttgtcgy
20 〈210>5 〈211>21 〈212>DNA 〈213>Mycobacterium tuberculosis 〈220> 〈221〉生物素 〈222〉 (1) (21) 〈223>y = biotin- 〈400>5
yccttcctga ccagcgagct 2權(quán)利要求
一種結(jié)核分枝桿菌核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測活菌的方法，采用逆轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)錄和納米金探針檢測層析雜交原理，其擴(kuò)增對象為從痰液、活檢組織等樣本或結(jié)核桿菌培養(yǎng)物中提取獲得的RNA模板；其特征在于，RNA模板通過采用逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H以及RNA聚合酶等溫?cái)U(kuò)增，產(chǎn)生的大量RNA擴(kuò)增子和納米金顆粒標(biāo)記的檢測探針、生物素(或地高辛)標(biāo)記的捕獲探針結(jié)合形成雜交復(fù)合物引起光學(xué)性質(zhì)變化，最后該復(fù)合物和固定在層析膜上親和素(或抗地高辛抗體)結(jié)合形成顯色檢測條帶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，采用了擴(kuò)增結(jié)核桿菌靶基因85-B mRNA的寡聚核苷酸引物和探針引物具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列，其中SEQ ID NO :25，端含有RNA聚合酶識別的啟動(dòng)子序列；檢測探針具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4序列；捕獲探針具有SEQID N0:5序列。這些引物和探針或者是包含有上述序列的向5'端或和3'端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其步驟依次包括(1) RNA模板在60 7(TC下解鏈后降溫；(2) 加入逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H和RNA聚合酶，在引物的引導(dǎo)下于37 42。C進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，獲得RNA擴(kuò)增子；(3) 利用納米金顆粒標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測擴(kuò)增子，并被生物素標(biāo)記寡核苷酸探針結(jié)合捕獲，通過層析膜上的條帶顯色反應(yīng)獲得檢測結(jié)果。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所說的逆轉(zhuǎn)錄酶為鳥成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶或鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶；所說的RNA聚合酶為T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1和5所說的檢測方法，其特征在于，所說的T3 RNA聚合酶所識別特異性啟動(dòng)子序列為5'AAT TCA ATT AAC CCT CAC TAA AGGG3';所說的T7RNA聚合酶所識別特異性啟動(dòng)子序列為5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG G3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測方法，其特征在于，所用的納米金顆粒直徑為1 100nm，納米金顆粒上的寡核苷酸探針SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4長度為10 lOObp，且連接前經(jīng)過巰基化或烷巰基化處理；所用的捕獲探針SEQ ID NO :5長度為10 50bp，其5'端可為生物素或地高辛標(biāo)記。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所用的固定有親和素或抗地高辛抗體(對應(yīng)于捕獲探針5'端標(biāo)記生物素或地高辛)的層析膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所說的顯色反應(yīng)為雜交后在層析膜上出現(xiàn)藍(lán)紫色顯色條帶。
9. 一種利用權(quán)利要求l所述檢測方法組裝的試劑盒，其組成為包含有引物I和II、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、 RNA聚合酶的反應(yīng)緩沖液、納米金顆粒標(biāo)記的寡核苷酸檢測探針、生物素(或地高辛)標(biāo)記的寡核苷酸捕獲探針、帶有親和素(或抗地高辛抗體)標(biāo)記的層析膜。
10. —種利用權(quán)利要求1所述檢測方法組裝的結(jié)核分枝桿菌核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒，可以用于檢測痰液、活檢組織等樣本或結(jié)核桿菌培養(yǎng)物中的結(jié)核分枝桿菌活菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法及其試劑盒，檢測步驟依次包括結(jié)核分枝桿菌mRNA模板在60～70℃下解鏈后降溫；加入逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶，在引物的引導(dǎo)下于37～42℃進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，獲得RNA擴(kuò)增子；然后利用納米金探針和捕獲探針檢測擴(kuò)增子，通過層析雜交顯色反應(yīng)獲得檢測結(jié)果。雜交膜出現(xiàn)顯色條帶為mRNA陽性(有活菌存在)，無條帶為陰性。采用本方法的試劑盒可檢測結(jié)核分枝桿菌活菌，具有準(zhǔn)確靈敏、簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，能克服已有方法鑒定時(shí)間長、操作復(fù)雜、特異性低等不足，可作為結(jié)核病診斷和預(yù)防、治療療效觀察、抗結(jié)核藥物篩選和敏感性實(shí)驗(yàn)等相關(guān)研究的輔助實(shí)驗(yàn)手段。
文檔編號G01N21/77GK101736078SQ20081020223
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日
發(fā)明者呂元, 吳大治, 夏懿 申請人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司;復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院