專利名稱：：石斛色譜指紋圖譜測定方法石斛色譜指紋圖譜測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種應(yīng)用色譜指紋圖譜技術(shù)，對(duì)藥用石斛中提取的含酚類和黃酮類的化學(xué)成分制訂色譜指紋圖譜測定方法，以便于在原料采購、產(chǎn)品生產(chǎn)工藝流程中的各個(gè)步驟的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。
背景技術(shù)：
：石斛是一類常用的貴重中藥材，歷代本草和各版藥典均有收載，中外學(xué)者對(duì)多種石斛的化學(xué)成分進(jìn)行了研究和探索，發(fā)現(xiàn)該屬植物所含的化學(xué)成分類型多樣，包括多糖類、生物堿、黃酮類、醌類、倍半萜類、香豆素類及甾體糖苷類化合物等成分。近年來，眾多學(xué)者對(duì)從多種石斛屬植物中分離得到的成分進(jìn)行了藥理活性研究和臨床應(yīng)用。酚類化合物和黃酮類化合物是石斛中的主要活性成分之一，如石斛中異黃酮類化合物異甘草苷，具有清除自由基、抗氧化的活性(羅丹等，2006)，因此，采用現(xiàn)代質(zhì)控方法，制訂石斛中酚類和黃酮類化學(xué)成分質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是石斛生產(chǎn)廠家重點(diǎn)考慮的。而目前尚沒有采用高效液相(HPLC)指紋圖譜技術(shù)對(duì)石斛酚類和黃酮類化合物進(jìn)行質(zhì)量控制的報(bào)道，因此，本方法對(duì)控制石斛原料和產(chǎn)品的質(zhì)量有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足之處，且方法簡單，可以方便快捷得到色譜圖，并可利用該指紋圖譜全面監(jiān)控石斛的質(zhì)量，以確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的石斛色譜指紋圖譜測定方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的石斛色譜指紋圖譜測定方法，步驟如下①、將藥用石斛剪斷后，低溫干燥，粉碎，過篩備用；②、取適量樣品于錐形瓶中，添加適量一元醇，超聲20min，過濾，濾渣用一元醇淋洗多次，合并濾液，濾液揮至近干，③、用一元醇溶解，定容，再用0.45iim微孔濾膜過濾后作為供試品溶液；、分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行分析；上述步驟中檢測條件為色譜柱C18柱(ODS柱)流速lml/min檢測波長254nm柱溫25。C流動(dòng)相乙腈(A)-l。；醋酸(B).洗脫梯度5%—32%A(O—30min)，32—65%A(30—55min)，65—32%A(55—60min)。如上所述的石斛色譜指紋圖譜檢測方法，其特征在于步驟①中過篩是過40-3003目篩。如上所述的石斛色譜指紋圖譜測定方法，其特征在所述的于一元醇為甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇中的任意一種。如上所述的石斛色譜指紋圖譜測定方法，其特征在于所述的藥用石斛為金釵石角斗DendrobiumnobileLindl.、環(huán)草石角斗D.loddigesiiRolfe.、黃草石角斗D.chrysanthumWall.、馬新更石斛D.fimbriatumHook.Var.oculatumHook.、鐵皮石斛D.candidumWall,exLindl.中的任意一種。本發(fā)明與石斛傳統(tǒng)的質(zhì)量控制方法相比，有如下突出優(yōu)點(diǎn)1、可以方便快捷的得到色譜圖，而且原材料易得，工藝簡單，技術(shù)先進(jìn)。據(jù)文獻(xiàn)記載，可以作為藥用石斛的石斛屬植物有近100種。傳統(tǒng)的質(zhì)量控制方法，如外觀性狀鑒定、顯微鑒定、薄層鑒別、生物堿和總多糖含量測定等方法并不能滿足上述近緣種鑒別的要求。而上述藥用石斛的藥用價(jià)值并不相同，造成了市場上石斛藥材質(zhì)量的參差不齊、以次充好的狀況。中藥色譜指紋圖譜技術(shù)通過多成分、多指標(biāo)來控制產(chǎn)品的質(zhì)量，相比上述質(zhì)量控制指標(biāo)，結(jié)果更加可靠，原材料易得，工藝簡單。2、酚類和黃酮類為藥用石斛的有效部位之一，因此本發(fā)明制訂指紋圖譜質(zhì)量控制方法，能有效表征藥用石斛的質(zhì)量。3、本發(fā)明采用高效液相色譜法(HPLC)制訂了藥用石斛的指紋圖譜，與采用氣相色譜法(GC)和分子生物學(xué)方法相比，本發(fā)明操作方法簡單、分析速度快、成本低、重現(xiàn)性好，特別適合大批量樣品的分析。4、利用本發(fā)明的測定方法，可得到石斛樣品的指紋圖譜色譜圖。再借助計(jì)算機(jī)相似度輔助評(píng)價(jià)軟件，將樣品圖與共有模式圖譜比較，通過相似度計(jì)算，即可評(píng)價(jià)原料品種、產(chǎn)地、真?zhèn)蝺?yōu)劣，以及判斷產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。圖1是Spherisorb0DS2C18色譜柱的指紋圖譜；圖2.1是PhenomenexC18(250mm*4.6mm*5iim，Luna)色譜柱的指紋圖譜；圖2.2是Spherisorb0DS2C18色譜柱和Prodigy0DS3色譜柱的指紋圖譜；圖2.3是Prodigy0DS3色譜柱、ZorbaxSBC18色譜柱和PhenomenexC18色譜柱的指紋圖譜；圖3是空白實(shí)驗(yàn)色譜圖；圖4是供試品溶液穩(wěn)定性的色譜圖；圖5是供試品溶液重性色譜圖；圖6是供試品溶液精密度色譜圖；圖7是金釵石斛酚類、黃酮類指紋圖譜；圖8是20批金釵石斛酚類和黃酮類成分指紋圖譜的共有模式；圖9是圖8中編號(hào)20的指紋圖譜；圖10是圖8中編號(hào)4的指紋圖譜；圖11是圖8中編號(hào)5的指紋圖譜；圖12是背景扣除后得到24.848min色譜峰的光譜圖；圖13是背景扣除后得到25.281min色譜峰的光譜圖。具體實(shí)施方式從實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)出發(fā)，在實(shí)驗(yàn)中我們選擇并比較了不同的C18(0DS柱)色譜柱Spheris-orb0DS2(150mm*4.6mm*5um，waters)色譜柱、PhenomenexC18(250mm*4.6mm*5um，Luna)色譜柱、ZorbaxSBC18(250mm*4.6mm*5um，Aglient)色譜柱、Spherisorb0DS2(250mm氺4.6mm氺5um，waters)色i普柱、Prodigy0DS3(250mm氺4.6mm氺5um，Phenomenex)色譜柱對(duì)金釵石斛酚類和黃酮類成分的色譜組分的分離效果的影響。如圖1所示Spherisorb0DS2(150mm氺4.6mm氺5um，waters)色i普柱，Spherisorb0DS2柱出峰數(shù)量、峰高、峰型均較好而出峰密集、分離度遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求，因此實(shí)驗(yàn)最終沒有采用150mm*4.6mn^5iim類型的色譜柱。實(shí)驗(yàn)過程中采用的250mm*4.6mm*5ym類型色譜柱分離效果好，出峰時(shí)間合適，符合色譜分離最優(yōu)化原則，故而采用此類型色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過不同250mm*4.6mn^5iim類型色譜柱所得色譜圖比較(圖2.1、2.2、2.3)，最終確定分離效果最好的Prodigy0DS3(250mm*4.6mm*5ym，Phenomenex)色譜柱進(jìn)行待測樣本分析(Spherisorb0DS2(250mm*4.6mm*5iim，waters)色譜柱柱效降低嚴(yán)重拖尾)。圖2.3中，1為Prodigy0DS3(250mm氺4.6mm氺5um，Phenomenex)色i普柱2為ZorbaxSBC18(250mm*4.6mm*5um，Aglient)色譜柱；3為PhenomenexC18(250mm*4.6mm*5um，Luna)色譜柱?！獋€(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征?；诖藥醉?xiàng)要求，并在實(shí)驗(yàn)所得金釵石斛酚類和黃酮類成分分離效果最好的前提條件下，選擇了乙腈-1%。乙酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相。通過實(shí)驗(yàn)比較，此流動(dòng)相比單純的乙腈-水系統(tǒng)、甲醇-水系統(tǒng)干擾小、成分峰數(shù)目多、分離度大，故而選用乙腈-1%。乙酸系統(tǒng)作為建立金釵石斛酚類和黃酮類成分的指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相。HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等強(qiáng)度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和PH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。由于金釵石斛酚類和黃酮類成分分析數(shù)目多、分析時(shí)間長，考慮到實(shí)際應(yīng)用中重復(fù)操作的時(shí)效性和可行性，因而實(shí)驗(yàn)首選梯度洗脫的方式。通過調(diào)配梯度洗脫程序最終所得分析結(jié)果在保證分離效果的同時(shí)分析時(shí)間合適。對(duì)于梯度洗脫方式引起的基線漂移和降低重現(xiàn)性這些情況，實(shí)驗(yàn)做了方法學(xué)驗(yàn)證(見下文)，結(jié)果良好。對(duì)于有光譜吸收的樣品，吸收信號(hào)的強(qiáng)度隨波長而變化，只有在其有最大吸收的波長下進(jìn)行檢測才可能獲得最大檢測靈敏度。從全波長掃描3D圖選擇最大吸收波長，兼顧出峰數(shù)量多，信號(hào)響應(yīng)值大，基線平穩(wěn)情況，254nm波長為檢測最佳波長。因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇lml/min。以甲醇作空白實(shí)驗(yàn)，所得色譜指紋圖譜中沒有組分流出，而且基線非常平穩(wěn)，如圖3所示。此方法建立的金釵石斛酚類和黃酮類成分的色譜指紋圖譜能夠表達(dá)該品種的化學(xué)特征，即唯一性。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，取某一批號(hào)的金釵石斛原樣，按擬定方法提取，分別在0h，Id和2d不同時(shí)間進(jìn)行測定。直觀上，這些指紋圖譜的色譜組成無明顯變化，如圖4。用相似度計(jì)算在同一臺(tái)儀器測得的色譜指紋圖譜與其共有模式圖譜的相似度分別為0.9724,0.9877,0.9919。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，取同一批號(hào)的金釵石斛，按照擬定的方法制備4份待測樣品。圖5示出了它們的色譜指紋圖譜。觀察這些指紋圖譜的色譜組成，無明顯變化。用相似度方法(均值)計(jì)算在同一實(shí)驗(yàn)室同一臺(tái)儀器測得的色譜指紋圖譜與其共有模式圖譜的相似度分別為0.9881,0.9951,0.9953,0.9944,0.9952。儀器精密度實(shí)驗(yàn)，取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察儀器精密度和指紋圖譜色譜組分保留時(shí)間的一致性。圖6為精密度試驗(yàn)所得的色譜指紋圖譜。計(jì)算各指紋圖譜與其共有模式圖譜的相似系數(shù)(均值)為0.9876，0."04，0."51，0."21，0.9860，0."45。根據(jù)上述檢測，得到最終檢測條件色譜條件色譜柱Prodigy0DS3(250mm*4.6mm*5um，Phe謹(jǐn)e證)色譜柱流速lml/min檢測波長254nm柱溫25。C流云力相acetonitrile(A)-l%。aceticacid(B).洗脫梯度5%-32%A(30min)，32-65%A(25min)，65-32%A(5min)金釵石斛酚類和黃酮類供試品溶液進(jìn)樣量為20ii1，樣本組分在55min出峰完畢。儀器，根據(jù)各生產(chǎn)廠家的經(jīng)濟(jì)情況、各藥檢部門所擁有的儀器及儀器的性能參數(shù)、實(shí)際可操作性等情況，推薦下列儀器用于金釵石斛中酚類和黃酮類成分的指紋圖譜研究和質(zhì)量控制美國AgilentHP1100高效液相色譜儀(G1322A型真空脫氣機(jī)、G1311A型四元泵、G1315A型二極管陣列檢測器、G1328A型手動(dòng)進(jìn)樣裝置)；B32005T型超聲波清洗儀。本發(fā)明實(shí)施例中選用的是AgilentHP1100高效液相色譜儀。實(shí)驗(yàn)試劑分析純甲醇、色譜純乙腈、分析純36%乙酸，分析純乙醇，二次蒸餾水，異丙醇、正丙醇、正丁醇。數(shù)據(jù)處理軟件，在整個(gè)金釵石斛酚類和黃酮類指紋圖譜研究過程中，用于指紋圖譜數(shù)據(jù)處理和質(zhì)量評(píng)價(jià)的工具為中南大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究中心編寫的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)圖譜/數(shù)據(jù)庫(ExtendableData-baseforQimlityAssessmentofTraditionalChineseHerbalMedicine)和計(jì)算機(jī)輔助相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)(ComputerAidedSimilarityEvaluation,CASE)。金釵石斛酚類和黃酮類成分指紋圖譜的樣本采集，20個(gè)金釵石斛樣本均由本專利權(quán)人提供，均采自于貴州省赤水市。其中io個(gè)樣本采摘于旺隆鎮(zhèn)金釵石斛規(guī)范化種植基地；另外10個(gè)樣本分別采摘于長沙鎮(zhèn)長興村、丙安鄉(xiāng)三佛村、丙安鄉(xiāng)愛華村、旺隆鎮(zhèn)鴨嶺村、長沙鎮(zhèn)長興村、旺隆鎮(zhèn)紅花村、長沙鎮(zhèn)合云村、丙安鄉(xiāng)丙安村、長沙鎮(zhèn)高洞村、復(fù)興鎮(zhèn)。6色譜條件Prodigy0DS3(250mm*4.6mm*5um，Phenomenex)色譜柱，流速lml/min，檢測波長254nm，柱溫25。C;流動(dòng)相acetonitrile(A)_1%。aceticacid(B)，洗脫梯度:5%-32%A(0-30min)，32-65%A(30-55min)，65-32%A(55_60min)供試品溶液進(jìn)樣量為20iil，樣本組分在55min出峰完畢。金釵石斛酚類和黃酮類成分指紋圖譜的建立，按擬訂提取方案提取20個(gè)批次的金釵石斛樣品作為供試品溶液。用HPLC-DAD聯(lián)用方法得到金釵石斛酚類和黃酮類成分的指紋圖譜。通過對(duì)上述20批指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校準(zhǔn)和保留時(shí)間漂移校準(zhǔn)后，如圖7所示l長沙鎮(zhèn)；2丙安鄉(xiāng)三佛村；3丙安鄉(xiāng)愛華村；4旺隆鎮(zhèn)鴨嶺村；5長沙鎮(zhèn)長興村；6旺隆鎮(zhèn)紅花村；7長沙鎮(zhèn)合云村；8丙安鄉(xiāng)丙安村；9長沙鎮(zhèn)高洞村；10復(fù)興鎮(zhèn)；11_20旺隆鎮(zhèn)規(guī)范化種植基地。通過計(jì)算得到的20批金釵石斛酚類和黃酮類成分的相關(guān)系數(shù)和相合系數(shù)，如表1所示，其中編號(hào)為4、5的兩個(gè)樣品與其余18個(gè)樣品相比較相差較大，若選取20個(gè)樣品的指紋圖譜建立共有模式則有悖共有模式建立的意義，故而選取除編號(hào)為4，5外的18個(gè)樣品建立共有模式，如圖8所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>背景扣除后得到24.848min色譜峰的光譜圖如圖12所示，以甲醇為溶劑，黃酮的紫外光譜在240-400nm間一般有兩個(gè)主要吸收帶，處于290_380nm區(qū)的吸收帶稱帶I，240-280nm區(qū)的為帶I1。圖12與圖13顯示，在275nm與330nm處均有樣品的吸收帶，據(jù)前述可簡易定性24.848min與25.281min色譜峰均為黃酮類物質(zhì)。通過上述實(shí)驗(yàn)，得出本發(fā)明石斛指紋圖譜測定方法，步驟如下①、將藥用石斛剪斷2-3cm后，6(TC干燥，粉碎，過80目篩，備用；②、取2g樣品于錐形瓶中，添加20ml甲醇浸泡，超聲20min，布氏漏斗過濾，濾渣用甲醇淋洗3次，每次3ml，合并濾液，濾液揮至近干；③、用甲醇溶解，定容2ml，再用0.45iim微孔濾膜過濾后作為供試品溶液溶解；、分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，即得；上述步驟中檢測條件為色譜柱Phe謹(jǐn)e證ProdigyODS3(250mm*4.6mm*5um)色譜柱流速lml/min檢測波長254nm柱溫25。C流動(dòng)相乙腈(A)_1%。醋酸(B).洗脫梯度5%-32%A(0-30min)，32-65%A(30-55min)，65-32%A(55-60min)。本發(fā)明還可以將供試品溶液的指紋圖譜與對(duì)照品共有模式圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件比較。實(shí)驗(yàn)試劑分析純甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)、色譜純乙腈(江蘇漢邦科技有限公司)、分析純36%乙酸(湖南師范大學(xué)化學(xué)試劑廠)，分析純乙醇(江蘇漢邦科技有限公司)，二次蒸餾水(HPLC純)；0.45iimPTFEfilers，異丙醇、正丙醇、正丁醇。本實(shí)施例中采用50ml錐形瓶。藥用石斛可以是金釵石斛DendrobiumnobileLindl.、環(huán)草石斛D.loddigesiiRolfe.、黃草石角斗D.chrysanthumWall.、馬鞭石角斗D.fimbriat咖Hook.Var.oculatumHook.、鐵皮石斛D.candidumWall,exLindl.中任意的一種。上述藥用石斛的測定方法步驟、工藝條件、檢測條件、數(shù)據(jù)處理軟件都相同。權(quán)利要求石斛色譜指紋圖譜測定方法，步驟如下①、將藥用石斛剪斷后，低溫干燥，粉碎，過篩備用；②、取適量樣品于錐形瓶中，添加適量一元醇，超聲20min，過濾，濾渣用一元醇淋洗多次，合并濾液，濾液揮至近干，③、用一元醇溶解，定容，再用0.45μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液；④、分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行分析。上述步驟中檢測條件為色譜柱C18柱(ODS柱)流速1ml/min檢測波長254nm柱溫25℃流動(dòng)相乙腈(A)-1‰醋酸(B).洗脫梯度5％→32％A(0→30min)，32→65％A(30→55min)，65→32％A(55→60min)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石斛色譜指紋圖譜檢測方法，其特征在于步驟①中過篩是過40-300目篩。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石斛色譜指紋圖譜測定方法，其特征在所述的于一元醇為甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇中的任意一種。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的石斛色譜指紋圖譜測定方法，其特征在于所述的藥用石斛為金釵石斛DendrobiumnobileLindl.、環(huán)草石斛D.loddigesiiRolfe.、黃草石斛D.chrysanthumWall.、馬新更石角斗D.fimbriatumHook.Var.oculatumHook.、鐵皮石角斗D.candidumWall,exLindl.中的任意一禾中。全文摘要本發(fā)明公開了一種石斛色譜指紋圖譜測定方法，步驟如下①將藥用石斛剪斷后，低溫干燥，粉碎，過篩備用；②取適量樣品于錐形瓶中，添加適量一元醇，超聲20min，過濾，濾渣用一元醇淋洗多次，合并濾液，濾液揮至近干，③用一元醇溶解，定容，再用0.45μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液；④分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行分析。本發(fā)明可以方便快捷的得到色譜圖，而且原材料易得，工藝簡單，技術(shù)先進(jìn)。據(jù)文獻(xiàn)記載，可以作為藥用石斛的石斛屬植物有近100種。而且本發(fā)明通過多成分、多指標(biāo)來控制產(chǎn)品的質(zhì)量，相比上述質(zhì)量控制指標(biāo)，結(jié)果更加可靠，原材料易得，工藝簡單。文檔編號(hào)G01N30/02GK101726547SQ20081021849公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年10月15日優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日發(fā)明者徐吉銀,成金樂,易倫朝,李先霞,梁逸曾申請(qǐng)人:中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司