專利名稱：生物傳感芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物傳感芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
生物傳感器是一種利用生物活性物質(zhì)識(shí)別分子的能力，選擇性地檢測(cè)特定的生
物化學(xué)物質(zhì)的傳感器；它主要包括固定化的生物敏感材料(傳感芯片)、理化換能 器以及信號(hào)放大裝置。在生物醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品衛(wèi)生檢測(cè)等方 面，生物傳感器具有廣闊的應(yīng)用和應(yīng)用前景。生物傳感器中最核心的部件是生物傳 感芯片，生物傳感芯片的表面上固定有生物分子(如蛋白質(zhì)、核酸或待測(cè)物質(zhì)分子)， 它是異相生物反應(yīng)的界面，它的性質(zhì)對(duì)傳感器的整體性能影響很大。
光學(xué)生物傳感器中的傳感芯片采用玻璃作為基底材料，在玻璃基底上固定生物 分子需要經(jīng)過(guò)兩個(gè)步驟基底的活化和生物分子的固定，基底活化的目的是在基底
表面形成一層分子膜，用于固定生物分子，并抑制非特異性吸附。目前對(duì)玻璃基底 的活化方法有很多種，其中薄膜修飾技術(shù)最為有效，包括自組裝單分子膜
(Self-assembled monolayer, SAM)和L-B膜(以其發(fā)明者Langmuir和Blodgett的
名字命名)，這些方法活化后的玻璃基底表面的活性基團(tuán)有限，生物分子的固定量 也受到了限制，另一方面，此方法制備的生物傳感芯片對(duì)生物分子的非特異性吸附 抑制能力較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供生物傳感芯片的制備方法，特別是蛋白質(zhì)生物傳感芯片和 有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片的制備方法。
本發(fā)明提供的制備蛋白質(zhì)生物傳感芯片的方法，依次包括如下步驟
1) 在玻璃基底上用Si02或Ta20s鍍膜；
2) 用硅烷化試劑對(duì)步驟l)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾；
3) 用功能性高分子聚合物對(duì)步驟2)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾；
4) 用戊二醛將蛋白質(zhì)分子固定到步驟3)得到的膜層上，得到本發(fā)明提供的蛋 白質(zhì)生物傳感芯片。
上述制備方法的步驟1)中，可用二氧化硅(Si02)或五氧化二鉭(Ta205)等 透明氧化物進(jìn)行鍍膜，該膜層的厚度為50-150nm。
步驟2)中，所用硅烷化試劑中的功能性基團(tuán)為環(huán)氧基或氨基，可為3-縮水甘
油羥丙基三甲氧基硅垸(GOPTS) 、 3-氨基丙基二甲基單乙氧基硅垸(APDMS)或 3-氨丙基三乙氧基硅垸(APTES)。采用APDMS或APTES這兩種硅烷化試劑進(jìn)行 化學(xué)修飾時(shí)，可先將硅烷化試劑溶于甲苯中，該硅烷化試劑的APDMS或APTES溶 液的質(zhì)量百分比濃度為1%;采用GOPTS硅垸化試劑時(shí)，采用純?cè)噭┻M(jìn)行化學(xué)修飾。
該步驟的反應(yīng)時(shí)間為l-24h，反應(yīng)溫度為室溫。該步驟以盡量形成單分子層為控 制目的，故當(dāng)硅烷化試劑的濃度較高時(shí)，反應(yīng)時(shí)間可適當(dāng)縮短；當(dāng)硅烷化試劑的濃 度較低時(shí)，反應(yīng)時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)。
步驟3)中，所用功能性高分子聚合物為帶有活性氨基、羧基及醛基的親水性 高分子聚合物，具體可為氨基葡聚糖(AMDEX)、羧基葡聚糖(CMDEX)、雙氨 基聚乙二醇(DAPEG)、雙羧基聚乙二醇(DCPEG)、殼聚糖(CHI)或聚哌嗪(PEI)。 上述高分子聚合物的分子量可自由選擇，優(yōu)選1000-150 000 g/mo1，更優(yōu)選10 000-100 000g/mol。
在用硅垸化試劑進(jìn)行化學(xué)修飾之后，在用功能性高分子聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾之 前，先將上述水溶性的功能性高分子聚合物溶于超純水中，脂溶性的功能性高分子 聚合物溶于DMF中，該功能性高分子聚合物的水或DMF溶液的質(zhì)量百分比濃度為 20-60%。
該步驟的反應(yīng)時(shí)間為12-24h，反應(yīng)溫度為25-37i:。該步驟完成后，上述功能性 高分子聚合物在基片表面形成致密的分子膜。
步驟3)中，當(dāng)功能性高分子聚合物采用的是含有活性氨基的聚合物，如 AMDEX、 DAPEG、 CHI或PEI，而步驟2)中采用的硅烷化試劑是APDMS或APTES 時(shí)，需用"琥珀酸酐法"將硅垸化后基片表面的氨基轉(zhuǎn)化成羧基，即將基片放入pH 值為7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入過(guò)量琥珀酸酐，控制溶液pH值在6-7，振蕩溶解 中反應(yīng)至少lh。
步驟4)中，可用"戊二醛法"將蛋白質(zhì)分子固定到步驟3)得到的膜層上。該 方法是首先采用質(zhì)量比為1.25%的戊二醛水溶液與步驟3)得到的基片進(jìn)行反應(yīng)，將 基片表面的氨基轉(zhuǎn)化為醛基，再將濃度為lpg/mL-lmg/mL的蛋白質(zhì)水溶液點(diǎn)到基片 上，37'C下培養(yǎng)至少24h即可。
該步驟中所用蛋白質(zhì)分子為IgG、酶或惰性蛋白。
利用上述制備方法得到的蛋白質(zhì)生物傳感芯片，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明提供的制備有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片的方法，包括兩種方法；其 中，方法一依次包括如下步驟
1)在玻璃基底上用Si02或Ta20s鍍膜；
2) 用硅烷化試劑對(duì)步驟l)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾；
3) 用功能性高分子聚合物對(duì)步驟2)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾；
4) 將有機(jī)小分子固定到步驟3)得到的膜層上，得到本發(fā)明提供的有機(jī)小分子 配基的生物傳感芯片；
上述制備方法的步驟l)中，可用Si02或Ta205等透明氧化物進(jìn)行鍍膜，該膜 層的厚度為50-150nm之間。
步驟2)中，所用硅烷化試劑中的功能性基團(tuán)為環(huán)氧基或氨基，可為3-縮水甘 油羥丙基三甲氧基硅烷(GOPTS) 、 3-氨基丙基二甲基單乙氧基硅垸(APDMS)或 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)。采用APDMS或APTES這兩種硅垸化試劑進(jìn)行 化學(xué)修飾時(shí)，可先將硅垸化試劑溶于甲苯中，該硅垸化試劑的APDMS或APTES溶 液的質(zhì)量百分比濃度為1%;采用GOPTS硅烷化試劑時(shí)，采用純?cè)噭┻M(jìn)行化學(xué)修飾。
該步驟的反應(yīng)時(shí)間為l-24h，反應(yīng)溫度為室溫。該步驟以盡量形成單分子層為控 制目的，故當(dāng)硅烷化試劑的濃度較高時(shí)，反應(yīng)時(shí)間可適當(dāng)縮短；當(dāng)硅垸化試劑的濃 度較低時(shí)，反應(yīng)時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)。
步驟3)中，所用功能性高分子聚合物為帶有活性氨基、羧基及醛基的親水性 高分子聚合物，具體可為氨基葡聚糖(AMDEX)、羧基葡聚糖(CMDEX)、雙氨 基聚乙二醇(DAPEG)、雙羧基聚乙二醇(DCPEG)、殼聚糖(CHI)或聚哌嗪(PEI)。 上述高分子聚合物的分子量可自由選擇，優(yōu)選1000-150 000 g/mo1，更優(yōu)選10 000-100 000g/mol。
在用硅烷化試劑進(jìn)行化學(xué)修飾之后，在用功能性高分子聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾之 前，先將上述水溶性的功能性高分子聚合物溶于超純水中，脂溶性的功能性高分子 聚合物溶于DMF中，該功能性高分子聚合物的水或DMF溶液的質(zhì)量百分比濃度為 20-60%。
該步驟的反應(yīng)時(shí)間為12-24h，反應(yīng)溫度為25-37'C。該步驟完成后，上述功能性 高分子聚合物在基片表面形成致密的分子膜。
步驟3)中，當(dāng)功能性高分子聚合物采用的是含有活性氨基的聚合物，如 AMDEX、 DAPEG、 CHI或PEI，而步驟2)中采用的硅烷化試劑是APDMS或APTES 時(shí)，需用"琥珀酸酐法"將硅垸化后基片表面的氨基轉(zhuǎn)化成羧基，即將基片放入pH 值為7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入過(guò)量琥珀酸酐，控制溶液pH值在6-7，振蕩溶解， 反應(yīng)至少1 h。
步驟4)中，將有機(jī)小分子固定到步驟3)得到的膜層上的方法，可采用直接固 定或間接固定的方法。
其中，直接固定的方法，是用功能化試劑將有機(jī)小分子固定到步驟3)得到的
膜層上。所用功能化試劑為碳二亞胺(EDC)、戊二醛、琥珀酰亞胺(NHS)或二 異丙基碳二亞胺(DIC)。
間接固定的方法，是先將有機(jī)小分子與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物，再將該 偶聯(lián)物固定到步驟3)得到的膜層上。
所用載體蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。之后再用水溶 性功能化試劑，如EDC、 NHS或戊二醛，將該偶聯(lián)物固定到膜層上。
上述間接固定的方法中，各種常用的偶聯(lián)方法均適用，如"EDC法"或"戊二 醛法"。其中，"EDC法"首先是將碳二亞胺與半抗原分子(即有機(jī)小分子，如2,4-D) 的羧基反應(yīng)，生成加成中間產(chǎn)物，再與載體蛋白分子上的氨基酸殘基反應(yīng)，形成酰 胺鍵，實(shí)現(xiàn)有機(jī)小分子與惰性蛋白(即載體蛋白質(zhì))的共價(jià)結(jié)合，得到偶聯(lián)物。偶 聯(lián)物的偶聯(lián)比(蛋白質(zhì)與小分子的分子摩爾比)控制在2-8左右。
"戊二醛法"是首先采用質(zhì)量比為1.25%的戊二醛水溶液與步驟3)得到的基片 進(jìn)行反應(yīng)，將基片表面的氨基轉(zhuǎn)化為醛基，再將濃度為1)ig/mL-lmg/mL的蛋白質(zhì)水 溶液點(diǎn)到基片上，37'C下培養(yǎng)至少24h即可。
本發(fā)明提供的另一種制備有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片的方法(方法二)， 依次包括如下步驟
1) 在玻璃基底上用&02或丁3205鍍膜；
2) 用硅烷化試劑對(duì)步驟l)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾；
3) 將功能性高分子聚合物與有機(jī)小分子進(jìn)行偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物；
4) 用功能化試劑將步驟3)得到的偶聯(lián)物固定到步驟2)得到的膜層上，得到 本發(fā)明提供的有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片；
該方法的步驟l)和步驟2)與方法一完全相同。
步驟3)中，功能性高分子聚合物與有機(jī)小分子的偶聯(lián)方法，與前述方法中有 機(jī)小分子與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)方法相同。
步驟4)中，所用功能化試劑為碳二亞胺(EDC)、戊二醛、琥珀酰亞胺(NHS) 或二異丙基碳二亞胺(DIC)。
另外，采用上述制備方法得到的有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片，也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明提供的制備生物傳感芯片的方法，采用硅烷化試劑和功能性高分子聚合 物聯(lián)合修飾玻璃基片表面，修飾后基片表面帶有一層致密的高分子聚合物層，含有 大量可用于生物分子或有機(jī)小分子配基固定的活性基團(tuán)，并能夠有效的抑制非特異
性吸附，由于整個(gè)修飾的過(guò)程都采用共價(jià)鍵結(jié)合的方式，制備的生物傳感芯片具有 高載量、高穩(wěn)定性、低非特異性吸附、可重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，克服了當(dāng)前玻璃基底修 飾方法中生物分子的固定量受限、芯片對(duì)生物分子的非特異性吸附抑制能力較差的 缺點(diǎn)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為實(shí)施例1制備生物傳感芯片時(shí)對(duì)玻璃基底進(jìn)行化學(xué)修飾的過(guò)程示意圖。
圖2為實(shí)施例2制備生物傳感芯片時(shí)對(duì)玻璃基底進(jìn)行化學(xué)修飾的過(guò)程示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)比本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。 實(shí)施例1、制作2,4-D的生物傳感芯片
如圖1所示，詳細(xì)說(shuō)明2,4-D光學(xué)免疫芯片的制作方法，該方法依次包括如下 步驟
1) 首先對(duì)玻璃基底進(jìn)行光學(xué)鍍膜用擦鏡紙擦掉玻璃基底表面上的明顯污點(diǎn)， 并依次采用強(qiáng)堿(4mol/LNaOH)、強(qiáng)酸(V(濃硫酸)V(雙氧水"3: 2)和丙酮對(duì) 基底進(jìn)行徹底清洗，室溫下氮?dú)獯蹈珊?，采用化學(xué)氣相沉淀鍍膜法(CVD)在基片 表面鍍一層厚度為100 nm左右的Si02。該基片鍍&02膜后的表面狀態(tài)如圖la中1 所示。
2) 將鍍膜后的玻璃基底放入APDMS的7jC/甲苯(0.25%)溶液中反應(yīng)24 h， APDMS的體積百分比濃度為1%，反應(yīng)后依次用甲苯、鹽酸、超純水沖洗，氮?dú)獯?干。該基片的表面狀態(tài)如圖la中21所示。然后將基片正面向上放入染色缸中，并 加入過(guò)量的琥珀酸酐，使其覆蓋在基片上，向染色缸中加入磷酸緩沖液(pH=7.4)， 振蕩過(guò)程中使琥珀酸酐溶解，持續(xù)加入強(qiáng)堿溶液控制pH在6 7之間。反應(yīng)進(jìn)行至少 1小時(shí)。反應(yīng)后的基片用超純水沖洗干凈。該基片的表面狀態(tài)如圖lb中22所示。
3) 超純水配制質(zhì)量百分比濃度為40%的AMDEX溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為 3-4，再向溶液中加入100mg/mLEDC，使其溶于反應(yīng)體系中，將反應(yīng)體系涂抹于硅 烷化后的玻璃基底上，保持玻璃表面一定濕度的條件下培養(yǎng)12-24 h。反應(yīng)后的基片 用超純水沖洗干凈，室溫下晾干。該基片的表面狀態(tài)如圖lb中3所示
4) 配制100 mg/mL的2,4-D的DMF溶液，溶液中加入體積百分比為1: 10的 DIC，將混合溶液滴加到玻璃基片的有效位置上(該基片的表面狀態(tài)如圖lc中3'所 示)，然后在DMF的濕盒中至少培養(yǎng)24h。反應(yīng)后的基片沖洗干凈后室溫下晾干， 得到2,4-D生物傳感芯片。該基片的表面狀態(tài)如圖lc中4所示。
制備后的2，4-D傳感芯片基本不會(huì)對(duì)惰性蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白BSA、卵清
蛋白OVA)產(chǎn)生非特異性吸附，而對(duì)2,4-D的抗體具有良好的特異性反應(yīng)。采用平 面波導(dǎo)型熒光免疫傳感器進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，此芯片對(duì)2mg/mL的BSA的響應(yīng)小于50 個(gè)單位，而對(duì)5pg/mL的2，4-D抗體則有330個(gè)單位的響應(yīng)。
實(shí)施例2、制作微囊藻毒素LR的生物傳感芯片
如圖2所示，詳細(xì)說(shuō)明微囊藻毒素生物L(fēng)R傳感芯片的制作方法，該方法依次 包括如下步驟
1) 用擦鏡紙擦掉玻璃基底表面上的明顯污點(diǎn)，并依次采用強(qiáng)堿(4mol/LNaOH)、 強(qiáng)酸(V(濃硫酸)V(雙氧水"3: 2)和丙酮對(duì)基底進(jìn)行徹底清洗，室溫下氮?dú)獯蹈?后，采用化學(xué)氣相沉淀鍍膜法(CVD)在基片表面鍍一層厚度為100nm左右的Si02。 該基片的表面狀態(tài)如圖2中1所示。
2) 鍍膜后的玻璃基片上滴加純GOPTS，以覆蓋基片表面所有的面積為宜，為 防止GOPTS與空氣接觸發(fā)生反應(yīng)，將另一尺寸相同的玻璃基片蓋在上面，形成三明 治結(jié)構(gòu)，室溫下在N2環(huán)境中的反應(yīng)lh，之后用丙酮充分沖洗。該基片的表面狀態(tài)如 圖2中2所示。
3) 超純水配制質(zhì)量百分比濃度為50%的氨基葡聚糖0.1 mL，均勻涂抹在玻璃 基片的有效位置上，保持玻璃表面過(guò)飽和濕度的條件下，培養(yǎng)至少12 h，反應(yīng)后的 基片用超純水沖洗干凈。該基片的表面狀態(tài)如圖2中3所示。
4) 將已經(jīng)固定有氨基葡聚糖的基片浸于質(zhì)量百分比濃度為1.25%的戊二醛的水 溶液中，室溫下培養(yǎng)過(guò)夜，結(jié)束后沖洗掉未反應(yīng)的戊二醛。在玻璃基底的有效位置 上滴加5嗎/mL的微囊藻毒素LR與OVA的偶聯(lián)物，并在濕盒中培養(yǎng)至少24 h。培 養(yǎng)后的基片浸于2mg/mL的賴氨酸溶液中，阻斷未反應(yīng)的醛基，然后再將基片放入 4mg/mL的硼氫化鈉(NaBH4)溶液中，進(jìn)一步阻斷未反應(yīng)的醛基。超純水沖洗N2 吹干，得到微囊藻毒素LR的生物傳感芯片。
其中，微囊藻毒素LR與OVA的偶聯(lián)物是按照如下方法進(jìn)行制備的
1) 微囊藻毒素MC-LR的分子修飾將摩爾比為3000:1的2-巰基乙胺和MC-LR 加入0.1MpH=9的碳酸鈉緩沖溶液中，混合物在50 'C反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)完畢后降至 室溫，加入乙酸停止反應(yīng)。產(chǎn)物采用固相萃取的方法提純。
2) 載體蛋白OVA的活化濃度為1.25%的過(guò)量戊二醛溶液與20 mg/mL的OVA 溶液混合，室溫下反應(yīng)12-24 h，或者在37t:下反應(yīng)20min。反應(yīng)后產(chǎn)物采用層析柱 進(jìn)行純化。
3) 微囊藻毒素LR與載體蛋白OVA的偶聯(lián)將3 mL活化后的OVA與0.3 mg
修飾后的微囊藻毒素LR充分混合，室溫下至少反應(yīng)24h，反應(yīng)產(chǎn)物用層析柱進(jìn)行純化。
此方案制備的偶聯(lián)物中微囊藻毒素LR與OVA的分子比例(偶聯(lián)比)在2-8之間。
此方法制備的微囊藻毒素LR傳感芯片基本不會(huì)對(duì)惰性蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋 白BSA、卵清蛋白OVA等)產(chǎn)生非特異性吸附，而對(duì)微囊藻毒素LR的抗體具有良 好的特異性反應(yīng)。
實(shí)施例3、制作2,4-D單克隆抗體的生物傳感芯片
1) 用擦鏡紙擦掉玻璃基底表面上的明顯污點(diǎn)，并依次采用強(qiáng)堿(4mol/LNaOH)、 強(qiáng)酸(V(濃硫酸)V(雙氧水"3: 2)和丙酮對(duì)基底進(jìn)行徹底清洗，室溫下氮?dú)獯蹈?后，采用化學(xué)氣相沉淀鍍膜法(CVD)在基片表面鍍一層厚度為100nm左右的Si02。
2) 鍍膜后的玻璃基片上滴加純GOPTS，以覆蓋基片表面所有的面積為宜，為 防止GOPTS與空氣接觸發(fā)生反應(yīng)，將另一尺寸相同的玻璃基片蓋在上面，形成三明 治結(jié)構(gòu)，室溫下在N2環(huán)境中的反應(yīng)lh，之后用丙酮充分沖洗。
3) 經(jīng)過(guò)GOPTS硅烷化后的基片表面以5mg/cn^的濃度加上DAPEG，放入60 'C烘箱中，待融化后用玻璃棒將融化的PEG均勻分布在基片表面，然后放入6(TC烘 箱中至少反應(yīng)36h，最后超純水沖洗掉基片上多余的DAPEG， N2吹干。
4) 將已經(jīng)固定有DAPEG的基片浸于質(zhì)量百分比濃度為1.25%的戊二醛的水溶 液中，室溫下培養(yǎng)過(guò)夜，結(jié)束后沖洗掉未反應(yīng)的戊二醛。在玻璃基底的有效位置上 滴加5 pg/mL的2，4-D單克隆抗體，并在濕盒中培養(yǎng)至少24h。培養(yǎng)后的基片浸于2 mg/mL的賴氨酸溶液中，阻斷未反應(yīng)的醛基，然后再將基片放入4 mg/mL的硼氫化 鈉(NaBH4)溶液中，進(jìn)一步阻斷未反應(yīng)的醛基。超純水沖洗N2吹干，得到2,4-D 單克隆抗體的生物傳感芯片。
實(shí)施例4、制作2,4-D的生物傳感芯片
1) 用擦鏡紙擦掉玻璃基底表面上的明顯污點(diǎn)，并依次采用強(qiáng)堿(4mol/LNaOH)、 強(qiáng)酸(V(濃硫酸)V(雙氧水"3: 2)和丙酮對(duì)基底進(jìn)行徹底清洗，室溫下氮?dú)獯蹈?后，采用化學(xué)氣相沉淀鍍膜法(CVD)在基片表面鍍一層厚度為100nm左右的Si02。
2) 鍍膜后的玻璃基片上滴加純GOPTS，以覆蓋基片表面所有的面積為宜，為 防止GOPTS與空氣接觸發(fā)生反應(yīng)，將另一尺寸相同的玻璃基片蓋在上面，形成三明 治結(jié)構(gòu)，室溫下在N2環(huán)境中的反應(yīng)lh，之后用丙酮充分沖洗。
3)超純水配制質(zhì)量百分比濃度為50%的2,4-D與AMDEX的偶聯(lián)物 2,4-D-AMDEX O.lmL，均勻涂抹在玻璃基片的有效位置上，保持玻璃表面過(guò)飽和濕 度的條件下，培養(yǎng)至少12h，反應(yīng)后的基片用超純水沖洗干凈。
其中，2,4-D與AMDEX的偶聯(lián)物是按照如下方法進(jìn)行制備的
1) 活潑酯的制備取10mg2,4-D溶于2mL干燥DMF中，在溶液中加入50.82 mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和91.11 mg 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，每種均為 加入衍生物的l.l倍摩爾過(guò)量。在冰上攪動(dòng)30分鐘后，溶液放在室溫下過(guò)夜。溶 液過(guò)濾并在冰箱中保存。
2) AMDEX與2,4-D連接500 mg AMDEX溶于5 mL去離子水和5 mLDMF 的混合液中。加入活潑酯溶液，充分混合，放在室溫下過(guò)夜。反應(yīng)后溶液用10倍體 積的甲醇沉淀，然后用有機(jī)相微孔濾膜過(guò)濾，干燥后得到偶聯(lián)物。
利用該方法制備的偶聯(lián)物中2,4-D與AMDEX的分子比例(偶聯(lián)比)在2-10之 間。另外，本發(fā)明提供的兩種制備方法中，各種硅烷化試劑和功能性高分子聚合物 進(jìn)行反應(yīng)的原理相同，其具體的制備方法與上述實(shí)施例相同，只需將相應(yīng)的化合物 進(jìn)行替換即可。
權(quán)利要求
1、一種制備蛋白質(zhì)生物傳感芯片的方法，依次包括如下步驟1)在玻璃基底上用SiO2或Ta2O5鍍膜；2)用硅烷化試劑對(duì)所述步驟1)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾；所述硅烷化試劑為3-縮水甘油羥丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基二甲基單乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷；3)用功能性高分子聚合物對(duì)所述步驟2)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾；所述功能性高分子聚合物為氨基葡聚糖、羧基葡聚糖、雙氨基聚乙二醇、雙羧基聚乙二醇、殼聚糖或聚哌嗪；4)用戊二醛將蛋白質(zhì)分子固定到所述步驟3)得到的膜層上，得到所述蛋白質(zhì)生物傳感芯片。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，用3-氨丙基二甲 基單乙氧基硅垸或3-氨丙基三乙氧基硅垸進(jìn)行化學(xué)修飾之前，先將所述3-氨丙基二甲基單乙氧基硅垸或3-氨丙基三乙氧基硅垸溶于甲苯中；所述3-氨丙基二甲基單乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅垸的甲苯溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.25-5%;所述步驟3)中，在用硅垸化試劑進(jìn)行化學(xué)修飾之后，在用功能性高分子聚合物 進(jìn)行化學(xué)修飾之前，先將功能性高分子聚合物溶于水或DMF中；所述功能性高分子 聚合物的水或DMF溶液的質(zhì)量百分比濃度為20-60%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，用硅垸化試 劑進(jìn)行化學(xué)修飾的反應(yīng)時(shí)間為l-24h，反應(yīng)溫度為室溫；所述步驟3)中，用功能性高分子聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾的反應(yīng)時(shí)間為12-24h，反 應(yīng)溫度為25-37。C。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，用Si02或Ta205 對(duì)玻璃基底鍍膜之后，所述玻璃基底上Si02或Ta205膜層的厚度為50-150nm;所述步驟4)中，蛋白質(zhì)分子為IgG、酶或惰性蛋白。
5、 權(quán)利要求1-4任一所述制備方法得到的蛋白質(zhì)生物傳感芯片。
6、 一種制備有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片的方法，依次包括如下步驟1) 在玻璃基底上用Si02或Ta20s鍍膜；2) 用硅烷化試劑對(duì)所述步驟1)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾； 所述硅垸化試劑為3-縮水甘油羥丙基三甲氧基硅垸、3-氨丙基二甲基單乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅垸； 3) 用功能性高分子聚合物對(duì)所述步驟2)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾； 所述功能性高分子聚合物為氨基葡聚糖、羧基葡聚糖、雙氨基聚乙二醇、雙羧基聚乙二醇、殼聚糖或聚哌嗪；4) 將有機(jī)小分子固定到所述步驟3)得到的膜層上，得到所述有機(jī)小分子配基的 生物傳感芯片。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，用3-氨丙基二甲 基單乙氧基硅垸或3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行化學(xué)修飾之前，先將所述3-氨丙基二甲基單乙氧基硅垸或3-氨丙基三乙氧基硅垸溶于甲苯中；所述3-氨丙基二甲基單乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.25-5%;所述步驟3)中，在用硅烷化試劑進(jìn)行化學(xué)修飾之后，在用功能性高分子聚合物 進(jìn)行化學(xué)修飾之前，先將功能性高分子聚合物溶于水或DMF中；所述功能性高分子 聚合物的水或DMF溶液的質(zhì)量百分比濃度為20-60%。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，用硅烷化試 劑進(jìn)行化學(xué)修飾的反應(yīng)時(shí)間為l-24h，反應(yīng)溫度為室溫；所述步驟3)中，用功能性高分子聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾的反應(yīng)時(shí)間為12-24h，反 應(yīng)溫度為25-37°C。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，用Si02或 Ta20s對(duì)玻璃基底鍍膜之后，所述玻璃基底上Si02或Ta20s膜層的厚度為50-150nm。
10、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟4)中，所述將有 機(jī)小分子固定到所述步驟3)得到的膜層上的方法，是用功能化試劑將有機(jī)小分子固 定到所述步驟3)得到的膜層上；所述功能化試劑為碳二亞胺、戊二醛、琥珀酰亞胺 或二異丙基碳二亞胺。
11、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟4)中，所述將有 機(jī)小分子固定到所述步驟3)得到的膜層上的方法，是先將有機(jī)小分子與載體蛋白質(zhì) 偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物，再將所述偶聯(lián)物固定到所述步驟3)得到的膜層上；所述載體蛋 白質(zhì)為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
12、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟4)中，功能化試 劑為碳二亞胺、戊二醛、琥珀酰亞胺或二異丙基碳二亞胺；所述有機(jī)小分子為2,4-D、 阿特拉津、西馬津、藻毒素類、硝基苯胺類或氯苯類的產(chǎn)品。
13、 權(quán)利要求6-12任一所述制備方法得到的有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片。
14、 一種制備有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片的方法，依次包括如下步驟 1)在玻璃基底上用Si02或Ta205鍍膜； 2) 用硅烷化試劑對(duì)所述步驟l)得到的膜層進(jìn)行化學(xué)修飾；所述硅烷化試劑為3-縮水甘油羥丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙二甲基單乙氧基硅 或3-氨丙基三乙氧基硅垸；3) 將功能性高分子聚合物與有機(jī)小分子進(jìn)行偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物； 所述功能性高分子聚合物為氨基葡聚糖、羧基葡聚糖、雙氨基聚乙二醇、雙羧基聚乙二醇、殼聚糖或聚哌嗪；4) 用功能化試劑將所述步驟3)得到的偶聯(lián)物固定到所述步驟2)得到的膜層上， 得到所述有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片；所述功能化試劑為碳二亞胺、戊二醛、琥珀酰亞胺或二異丙基碳二亞胺。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，用3-氨丙基二 甲基單乙氧基硅院或3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行化學(xué)修飾之前，先將所述3-氨丙基二 甲基單乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷溶于甲苯中；所述3-氨丙基二甲基單乙氧 基硅垸或3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.25-5%。
16、 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，用硅烷 化試劑進(jìn)行化學(xué)修飾的反應(yīng)時(shí)間為l-24h，反應(yīng)溫度為室溫；
17、 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，用SiCb 或Ta205對(duì)玻璃基底鍍膜之后，所述玻璃基底上Si02或Ta205膜層的厚度為50-150nm;所述步驟3)中，所述功能性高分子聚合物的分子量為1000至IJ 150 000g/mo1，優(yōu) 選10 000到100 000g/mol;所述有機(jī)小分子為2,4-D、阿特拉津、西馬津、藻毒素類、硝基苯胺類或氯苯類 的產(chǎn)品。
18、 權(quán)利要求14-17任一所述的制備方法得到的有機(jī)小分子配基的生物傳感芯片。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種光學(xué)生物傳感芯片及其制備方法。該制備方法包括以下步驟1)玻璃基底采用氧化物光學(xué)鍍膜；2)鍍膜后玻璃基片采用帶有活性功能基團(tuán)的硅烷化試劑進(jìn)行化學(xué)修飾；3)功能性高分子聚合物對(duì)玻璃基片進(jìn)一步修飾；4)將蛋白質(zhì)分子固定到高分子聚合物修飾的玻璃基片上；將有機(jī)小分子配基固定到高分子聚合物修飾的玻璃基片上。該方法采用硅烷化試劑和功能性高分子聚合物聯(lián)合修飾玻璃基片表面，使基片表面帶有一層致密的高分子聚合物層，含有大量可用于生物分子或有機(jī)小分子配基固定的活性基團(tuán)，可有效抑制非特異性吸附。制備的生物傳感芯片具有高載量、高穩(wěn)定性、低非特異性吸附、可重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101363870SQ20081022252
公開日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日
發(fā)明者苗 何, 宋保棟, 廖志民, 施漢昌 申請(qǐng)人:清華大學(xué);北京金達(dá)清創(chuàng)環(huán)境科技有限公司