專利名稱：：內(nèi)源性甲醛用于制備老年癡呆癥的診斷劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及甲醛在制備老年癡呆癥的診斷劑中的新用途，其中將內(nèi)源性甲醛用作老年癡呆癥的生物標(biāo)志物。內(nèi)源性甲醛作為老年癡呆癥的生物標(biāo)志物，可以用來確定受試者是否患有老年癡呆癥或發(fā)展老年癡呆癥的危險(xiǎn)，還可以用來評(píng)價(jià)治療老年癡呆癥的藥物的藥效。在本發(fā)明中，我們通過對(duì)81例對(duì)照人群(非癡呆患者)和141例不同癡呆程度的老年癡呆病人進(jìn)行匪SE(Folsteinetal.，1975)測試(國際上通用的簡易精神智能檢查量表)，按照分值不同分為正常，輕度癡呆，中度癡呆和重度癡呆。同時(shí)收集測試者的尿液進(jìn)行熒光-HPLC分析(Luoetal.，2001)。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)AD患者體液中的內(nèi)源性甲醛濃度和對(duì)照比較呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。這一發(fā)現(xiàn)有望將內(nèi)源性甲醛作為臨床普查的一個(gè)參考指標(biāo)。在本發(fā)明的研究工作中，本發(fā)明人經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)AD患者尿甲醛濃度普遍高于對(duì)照(對(duì)照0.082mM，n=38，AD:0.303±0.032mM，n=141，對(duì)照與文獻(xiàn)上報(bào)道健康人尿甲醛濃度為0.08mM相類似)，并隨著癡呆程度加重尿甲醛濃度也呈現(xiàn)遞增的趨勢(見圖3a)。本發(fā)明將內(nèi)源性甲醛用作老年癡呆癥的生物標(biāo)志物，可以用來制備老年癡呆癥的診斷劑。本發(fā)明的實(shí)施方案詳細(xì)描述了內(nèi)源性甲醛與老年癡呆癥之間的關(guān)系，以及它用來制備老年癡呆癥的診斷劑的用途。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過檢測受試者尿液中的甲醛濃度，將其與健康受試者尿液中的甲醛濃度進(jìn)行比較，來判斷所述受試者是否患有老年癡呆癥，并且初步判斷所述受試者的老年癡呆癥的程度。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過縱向監(jiān)測受試者在生命過程不同時(shí)間階段尿液中的甲醛濃度變化，來判斷所述受試者發(fā)展老年癡呆的危險(xiǎn)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過監(jiān)測受試者在服用治療老年癡呆癥的藥物之前和之后不同時(shí)間階段的尿液中的甲醛濃度變化，來評(píng)價(jià)所述藥物針對(duì)老年癡呆癥的藥效。在上文所述的應(yīng)用中，尿液甲醛濃度可以通過高效液相熒光色譜(HPLC-熒光)進(jìn)行測量，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，檢測方法并不限于此，還可以利用本領(lǐng)域公知的任何其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1.提供了甲醛用于制備老年癡呆癥的診斷劑的新用途。內(nèi)源性甲醛作為老年癡呆癥的生物標(biāo)志物，不但可以用來判斷受試者是否患有老年癡呆癥，并且可以初步判斷所述受試者的老年癡呆癥的程度，從而為及時(shí)采用適當(dāng)?shù)闹委熖峁┡R床依據(jù)；2.內(nèi)源性甲醛作為老年癡呆癥的生物標(biāo)志物，還可以通過縱向監(jiān)測所述受試者在生命過程中的不同時(shí)間階段尿液中甲醛濃度的變化，可以及時(shí)預(yù)測所述受試者發(fā)展老年癡呆癥的危險(xiǎn)，及時(shí)采取醫(yī)學(xué)預(yù)防和干預(yù)，以免貽誤治療的最佳時(shí)機(jī)；3.內(nèi)源性甲醛作為老年癡呆癥的生物標(biāo)志物，還可以用來評(píng)價(jià)治療老年癡呆癥的藥物的藥效，評(píng)價(jià)方法簡單快速，成本低，經(jīng)濟(jì)實(shí)用；4.本發(fā)明的檢測方法簡單實(shí)用，對(duì)受試者不造成身體損害，因此，該方法具有非常好的實(shí)用性。從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中圖1顯示熒光高效液相色譜測定的甲醛(FA)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及甲醛濃度與色譜峰面積之間的線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)R2。Y軸色譜峰面積；X軸甲醛濃度。線性回歸方程:Y=15357X+364.34;R2=0.9997。圖2顯示5種不同代表性樣品的熒光高效液相色譜圖。2a.空白水；2b.對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液(lppm);2c.輕度癡呆癥的尿液樣品；2d.中度癡呆癥的尿液樣品；2e.重度癡呆癥的尿液樣品。甲醛的保留時(shí)間約為8分鐘。圖3a顯示4種不同人群中尿甲醛的濃度測定結(jié)果，由圖可見癡呆患者尿甲醛的濃度與患者癡呆程度呈正相關(guān)，并與對(duì)照有顯著性差異，圖中所用數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。所述4組不同人群為1組健康對(duì)照受試者(不患任何疾病，n=38)，和3組3種程度(輕度(n二50)、中度(n二39)、重度(n=52))的AD患者。3b.不同癡呆類別中尿甲醛的濃度測定結(jié)果，包括血管性癡呆，阿爾茨海默性癡呆，混合性癡呆和其它，由圖可見，幾種癡呆患者尿甲醛與對(duì)照相比均有顯著性差異。3c.顯示AD患者(同時(shí)患有高血壓或糖尿病)與相應(yīng)非AD患者(不患任何疾病的健康受試者和分別患有高血壓或糖尿病的非AD患者)尿甲醛濃度比較，可以看出AD患者的尿甲醛濃度與非AD患者有極顯著性差異；3d.患有高血壓或糖尿病的非AD患者的尿甲醛濃度與健康人(不患任何疾病)的尿甲醛濃度比較。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。1.材料與方法1.1材料和儀器氨芐青霉素，甲醛(37%，W/V)(優(yōu)級(jí)純，購自sigma公司)，三氯乙酸，氯化鈉(分析純，購自鼎國生物公司)，乙腈，乙醚(液相色譜純，購自Tedia公司)，水均為Milli-Q超純水。尿液采自廣東汕頭醫(yī)學(xué)院，北京市順義縣居民社區(qū)，老年醫(yī)院和老年公寓中的老年受試者。熒光-高效液相色譜儀(HP1100，agilent)，氮?dú)獯蹈蓛x(上海過望化工有限公司)。1.2簡易智能精神狀態(tài)量表(匪SE)的測定在社區(qū)隨機(jī)抽取112例健康人做調(diào)查，健康人的調(diào)查是在中關(guān)村醫(yī)院老年病科和精神病科的醫(yī)生指導(dǎo)下，在居民社區(qū)(社區(qū)沒有任何與其他居民社區(qū)不同的居住環(huán)境)隨機(jī)入戶調(diào)查取樣的，調(diào)查取樣符合規(guī)范科學(xué)的方法，樣本真實(shí)具有代表性和普遍性。臨床調(diào)查人數(shù)不少于30人，具有統(tǒng)計(jì)意義。最后去掉了少數(shù)無統(tǒng)計(jì)意義且本身伴有除高血壓和糖尿病之外病癥的人群，剩下81人做癡呆調(diào)查的對(duì)照。癡呆患者的調(diào)查者是在老年公寓和老年醫(yī)院住院或門診病人，經(jīng)專業(yè)醫(yī)生診斷確診后再進(jìn)行的調(diào)查。癡呆患者共141人，在正規(guī)醫(yī)院(北京老年醫(yī)院)和幾個(gè)敬老院取樣調(diào)查，此過程完全是在老年病房主任的指導(dǎo)下完成的，按照科學(xué)規(guī)范的方法取樣，樣本具有代表性和普遍性。1.3尿液的采集和處理測試者當(dāng)天禁酒和高脂肪飲食，第二天清晨空腹留尿，暫存于-7(TC，待測。1.4樣品的衍生化反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作將甲醛用水配成lmM的母液，用水系列稀釋成八個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)O，O.01，0.02，0.05，0.l，O.2，0.3，0.6mM，用水作空白對(duì)照。將不同濃度甲醛溶液O.8ml加到8個(gè)含有200ii1健康人尿液的2ml帶蓋的玻璃管中(加尿液是為了與后面測定樣品時(shí)扣除本底的需要)，再分別加0.lml氨芐青霉素(2.5mg/ml的水溶液)和0.25ml三氯乙酸(20X的水溶液)，充分振蕩30秒，隨即置于9(TC水浴鍋中l(wèi)小時(shí)。然后，降至室溫，并將管中溶液轉(zhuǎn)移至10ml玻璃離心管中，將剛才的2ml管子用lml乙醚分別洗兩次并合并到該10ml管中，并于每管中加入少量氯化鈉(約0.5g)，激烈震蕩1分鐘，1000g離心5分鐘，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到5ml的玻璃管中，再用2ml乙醚萃取水相兩次，與有機(jī)相一起合并。在4(TC用氮?dú)獯蹈蓛x吹干有機(jī)相，用800ia乙腈-水溶液(體積比l:1)溶解，震蕩30秒，用0.45iim有機(jī)濾器過濾于液相色譜專用樣品瓶中，密封待測。樣品衍生化樣品衍生化同上操作，準(zhǔn)備如下試劑空白lml水；尿液空白800ii1水+200ii1尿液；尿液+標(biāo)準(zhǔn)300iil水+500y1甲醛標(biāo)準(zhǔn)(l卯m)+200y1尿液；待測樣本800iil水+200ii1待測尿液。處理過程同上述，最后用500yl乙腈-水溶液(體積比l:1)溶解。試劑空白，尿液空白，尿液+標(biāo)準(zhǔn)，待測樣本，每次均做兩個(gè)平行，再取均值用于計(jì)算。計(jì)算樣本的甲醛濃度(單位ppm)=(每個(gè)樣本的峰面積減去試劑空白的峰面積)+(尿液+標(biāo)準(zhǔn)的峰面積減去尿液空白的峰面積)X0.5(標(biāo)準(zhǔn)濃度)X5(200yl尿液)。最后換算成mM。1.5高效液相熒光色譜的條件熒光-HPLC柱HPZorbaxStableBondSB-C18，5m，250mmX4.6mm(德國)，柱溫4(TC，進(jìn)樣量10iil，流動(dòng)相乙腈水(體積比25:75)，流速lml/min，熒光檢測器。2.結(jié)果與討論2.1液相色譜測定甲醛(FA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線從圖1中看到甲醛濃度與色譜峰面積有良好的線性關(guān)系，回歸方程已表明線性相關(guān)系數(shù)為0.9997。因此用此方法完全可以測定血液或尿液中微量甲醛的濃度。2.2高壓液相色熒光譜圖，臨床調(diào)查及尿甲醛測定結(jié)果從圖2可看出，色譜圖中甲醛出峰的保留時(shí)間是相當(dāng)穩(wěn)定的(約為8分鐘)，此方法用于定性和定量都是可行的。標(biāo)準(zhǔn)品的回收率(>95%)，日內(nèi)偏差和日間差(<5%)均達(dá)到要求。圖2的結(jié)果表明，內(nèi)源性甲醛的濃度隨著癡呆程度加重而遞增，表示內(nèi)源性甲醛可以用作診斷和判斷老年癡呆程度的生物標(biāo)志物。2.3不同老年癡呆患者臨床調(diào)查情況及尿甲醛濃度測定結(jié)果表1總結(jié)了隨機(jī)選取的141名不同程度的老年癡呆癥患者的臨床流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果和他們的尿液甲醛濃度的測定結(jié)果。表2總結(jié)了對(duì)照人群(包括81名個(gè)體)調(diào)查情況及它們的尿液甲醛濃度測定結(jié)果。所述對(duì)照人群包括沒有患有任何疾病的健康個(gè)體和患有除AD外的一種或多種疾病的6個(gè)體，所述除AD外的疾病包括，但不限于，高血壓、高血糖、糖尿病、中風(fēng)、心臟病、血栓、腦血栓、半身不遂、和記憶力下降等。表l.不同老年癡呆患者臨床調(diào)查情況一覽表及尿甲醛濃度測定結(jié)果編號(hào)性別年齡既往病史匪SE尿中甲醛濃度(mM)1男82血管性癡呆，腦出血00.0333332男76老年性呆，腦梗塞，帕金森，高血壓00.0666673男80血管性癡呆，腦梗塞，高血壓00.14男74老年性癡呆，II型糖尿病00.1333335女78帕金森病，缺血缺氧醒腦病00.1666676男83混合性癡呆，多發(fā)性腦更00.27女80腦梗塞，高血脂200.2333338女77老年性癡呆，腦梗塞00.2666679男74混合性癡呆，帕金森病60.310女76老年性癡呆，腦梗塞00.33333311女83老年性癡呆，高血脂00.36666712男78混合性癡呆，腦梗，高血脂200.413女79高血脂，高血壓，痛風(fēng)00.43333314女81混合性癡呆，腦梗00.46666715女64混合性癡呆，腦梗，腦出血00.516男79老年性癡呆00.5333337<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2對(duì)照人群*調(diào)查情況一覽表及尿甲醛濃度測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*對(duì)照人群包括沒有患任何疾病的健康群體和患有一種或多種除AD以外的疾病的非AD患者群體。2.4討論本發(fā)明人的研究結(jié)果表明，在AD病人的尿液中內(nèi)源性甲醛濃度與健康人有著明顯的不同，那么對(duì)臨床診斷來講，這無疑是一個(gè)很有實(shí)用意義和應(yīng)用前景的參考指標(biāo)。在本發(fā)明人的研究中，老年癡呆病理切片表明病變是在腦組織中的某些蛋白出現(xiàn)纖維纏結(jié)和老年斑等，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了甲醛在體外可以引起神經(jīng)系統(tǒng)中存在的一種tau蛋白變性形成類似老年癡呆患者中腦組織切片中tau蛋白的聚集并形成螺旋纖維纏結(jié)，所以，本發(fā)明人大膽推測在癡呆患者神經(jīng)系統(tǒng)中內(nèi)源性甲醛的濃度可能超出正常人，并且在以后的代謝過程中會(huì)有表現(xiàn)。本發(fā)明的研究結(jié)果證實(shí)了這一推測，并且在此基礎(chǔ)上本發(fā)明人完成了本發(fā)明。關(guān)于老年癡呆患者尿液中甲醛濃度的異常，本發(fā)明人推測這可能是由于甲醛合成酶及降解酶在老年癡呆患者體內(nèi)失衡造成的。AD病按發(fā)病原因分為很多類型血管性癡呆，單純老年性癡呆，混合性癡呆及其它(魏紅梅，2008)(見圖3b)，由圖3中看到各種類型的AD患者的尿甲醛水平與對(duì)照相比均有極顯著的和顯著性差異。為了排除其他疾病的干擾，將伴有高血壓或糖尿病的AD患者和同時(shí)也有相對(duì)應(yīng)疾病的非AD患者比較發(fā)現(xiàn)(見圖3c)，AD患者的尿甲醛水平與分別患有這兩種相對(duì)應(yīng)疾病的非AD患者比較仍有顯著性差異，而從圖3d中看出，患有高血壓或糖尿病的非AD患者尿甲醛濃度與健康對(duì)照相比并沒有顯著性差異，由此說明尿甲醛濃度的增高至少與老年人常見的高血壓和糖尿病沒有正相關(guān)，即表明尿甲醛濃度的升高將是AD患者尿液中一個(gè)特異性的標(biāo)記物。這為在臨床早期診斷老年癡呆上提供對(duì)患者無任何傷害的簡便易行的參考指標(biāo)，并為研究治療癡呆的藥物療效上提供一個(gè)評(píng)價(jià)方法，本研究結(jié)果在該研究領(lǐng)域?qū)⑹且粋€(gè)全新的發(fā)現(xiàn)。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，而不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍。參考文獻(xiàn)1FemkeH.Bouwmana(CSFbiomarkerlevelsinearlyandlateonsetAlzheimer'sdisease.NeurobiologyofAging7.2008).2FolsteinMF，F(xiàn)olsteinSE，McHughPR(〃Mini-mentalstate〃.Apracticalmethodforgradingthecognitivestateofpatientsfortheclinician.JPsychiatrRes12:189-198.1975).3FrancisPT，PalmerAM，SnapeM，WilcockGK(ThecholinergichypothesisofAlzheimer'sdisease:areviewofprogress.JournalofNeurology，Neurosurgery&Psychiatry66:137-147.1999).4LuoW，LiH，ZhangY，AngCYW(Determinationofformaldehydeinbloodplasmabyhigh—performanceliquidchromatographywithfluorescencedetection.JournalofChromatographyB:BiomedicalSciencesandApplications753:253-257.2001).5McKh靈G，DrachmanD，F(xiàn)olsteinM，KatzmanR，PriceD，StadlanEM(ClinicaldiagnosisofAlzheimer'sdisease:r印ortoftheNINCDS-ADRDAworkgroup.Neurology34:939-944.1984).6SimonsenAH，McGuireJ，PodustVN，DaviesH，MinthonL，SkoogI，AndreasenN，WallinA，WaldemarG，Ble皿owK(IdentificationofanovelpanelofcerebrospinalfluidbiomarkersforAlzheimer'sdisease.NeurobiolAging29:961-968.2008).7施安國費(fèi)秋艷(老年癡呆癥藥物治療進(jìn)展.藥學(xué)進(jìn)展24:338-341.2000).8倪琦煒，陸基宗(老年癡呆癥(阿爾茲海默病)及其藥物治療.中國保健15:59-60.2007).9魏紅梅(老年癡呆發(fā)病機(jī)理的研究.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)15:621-623.2008).20權(quán)利要求甲醛在制備老年癡呆癥的診斷劑中的應(yīng)用，其中將內(nèi)源性甲醛用作老年癡呆癥的生物標(biāo)志物，通過檢測受試者尿液樣品中的甲醛濃度，將其與健康受試者尿液中的甲醛濃度進(jìn)行比較，來確定所述受試者是否患有老年癡呆癥，并且初步判斷所述受試者的老年癡呆癥的程度。2.按照權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中使用高效液相熒光色譜(HPLC-熒光)檢測所述受試者尿液樣品中的甲醛濃度。3.按照權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其還通過縱向監(jiān)測所述受試者在生命過程中不同時(shí)間階段的尿液甲醛濃度，用來判斷所述受試者發(fā)展老年癡呆癥的危險(xiǎn)。4.按照權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其還通過監(jiān)測所述受試者在服用抑制老年癡呆癥的藥物之前和之后不同時(shí)間階段尿液甲醛濃度，用來評(píng)價(jià)所述藥物的藥效。全文摘要本發(fā)明涉及內(nèi)源性甲醛在制備老年癡呆癥的診斷劑中的應(yīng)用，其中將內(nèi)源性甲醛用作老年癡呆癥的生物標(biāo)志物，通過檢測受試者尿液樣品中的甲醛濃度，將其與健康受試者尿液中的甲醛濃度進(jìn)行比較，來確定所述受試者是否患有老年癡呆癥，并且初步判斷所述受試者的老年癡呆癥的程度。文檔編號(hào)G01N33/48GK101726580SQ200810223978公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年10月13日優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日發(fā)明者盧靜,張金玲,李芳序,童志前,赫榮喬申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生物物理研究所