專(zhuān)利名稱(chēng)：：檢測(cè)煙草脆裂病毒的細(xì)胞株、單克隆抗體和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)煙草脆裂病毒的細(xì)胞株、單克隆抗體和試劑盒，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)屬于煙草脆裂病毒屬(Tobravirus)。TRV通過(guò)生于土壤的線蟲(chóng)(TrchodorusandParatrichodours)傳播的。線蟲(chóng)往往會(huì)在排水不良的地方發(fā)現(xiàn)。TRV是這種土上引起病害的主要因素。在這種地方TRV持續(xù)存在，并通過(guò)當(dāng)?shù)氐木€蟲(chóng)傳播到敏感植物種類(lèi)上。許多種類(lèi)的雜草是病毒主要的所在地，馬鈴薯以及其它一些農(nóng)作物是次要場(chǎng)所。TRV分布廣泛，可以侵染大量的植物種類(lèi)，在馬鈴薯、煙草、觀賞植物的塊莖上會(huì)引起重要的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒目前是我國(guó)的檢疫生物之一。煙草脆裂病毒是一類(lèi)應(yīng)用比較廣泛而且效率和持久性較好的病毒載體，能夠介導(dǎo)基因沉默同時(shí)不會(huì)帶來(lái)病毒誘導(dǎo)的癥狀。改造后的病毒能夠促進(jìn)非病毒序列的插入以及對(duì)植物的后續(xù)感染，也可以鑒定宿主植物生長(zhǎng)點(diǎn)的基因，因此TRV在植物基因功能鑒定中具有廣泛的應(yīng)用。目前，檢測(cè)TRV的方法主要采用進(jìn)口抗血清檢測(cè)試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)以及用電鏡直接觀察組織中的病毒粒子。從已有報(bào)道看，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)TRV的血清學(xué)檢測(cè)方法均基于TRV多抗血清而建立的，商品ELISA檢測(cè)試劑盒也是多抗血清，然而多抗存在非特異性高、準(zhǔn)確性和均質(zhì)性差、產(chǎn)量有限等不足，難以滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的花卉生產(chǎn)中對(duì)病毒的檢測(cè)需求；電鏡檢測(cè)需要昂貴的設(shè)備而不能普及應(yīng)用。因而迫切需要建立快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，為該病毒病的診斷提供技術(shù)支持。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)煙草脆裂病毒的單克隆抗體及分泌該抗體的單克隆細(xì)胞株。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種含上述單克隆抗體的檢測(cè)煙草脆裂病毒的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案檢測(cè)煙草脆裂病毒的單克隆抗體，由細(xì)胞株3C3分泌得到，該細(xì)胞株的保藏號(hào)為CGMCCN0.2679。單克隆細(xì)胞株3C3，保藏號(hào)為CGMCCN0.2679。單克隆細(xì)胞株3C3用于制備檢測(cè)煙草脆裂病毒的試劑的用途。檢測(cè)煙草脆裂病毒的試劑盒，由以下試劑組成TRV單克隆抗體0.lml(濃度為lmg/ml)AP標(biāo)記羊抗鼠IgG0.lml(Sigma公司產(chǎn)品，濃度為lmg/ml)對(duì)石肖基苯磷酸酉旨(p-nitrophenylphosphate,PNPP)0.15g陽(yáng)性對(duì)照(含煙草脆裂病毒煙草葉片汁液)2ml3陰性對(duì)照(健康煙草葉片汁液)2ml以上試劑均保存于4t:下96孔ELISA反應(yīng)板10塊樣品稀釋液ELISA封閉液(10X)l瓶(質(zhì)量-體積百分比濃度為20%的脫脂奶粉溶液，脫脂奶粉為光明公司產(chǎn)品)本研究通過(guò)TRV病毒的動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、篩選、克隆和腹水制備，獲得了l株TRV特異性單抗，并用這些單抗建立了對(duì)TRV有特異性反應(yīng)、而與BBWVl、BBWV2、CarMV、CMV、PVX、PVY、SCMV、TMV、ToMV和TuMV等病毒均無(wú)反應(yīng)的ACP-ELISA檢測(cè)方法。單克隆細(xì)胞株3C3，保存于中國(guó)普通微生物保藏中心，保藏號(hào)為CGMCCNO.2679，保藏日期2008年09月26日，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)免疫的BALB/C鼠脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗TRV單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細(xì)胞(3C3)，并制備它的單抗腹水。單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10—6，抗體類(lèi)型及亞類(lèi)均為IgGl，而單克隆抗體的輕鏈均為k鏈。Western-blot分析表明，該株單抗都能與TRV的22.3KD外殼蛋白亞基特異性結(jié)合。利用單克隆抗體建立了抗原包被間接ELISA(ACP-ELISA)檢測(cè)TRV的方法。病葉作1:400倍稀釋、提純TRV病毒濃度為18ng/mL(每孔的病毒絕對(duì)量為1.8ng)時(shí)，該方法仍能檢測(cè)到病毒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明首次制備了TRV的單克隆抗體，建立了抗原包被ELISA(ACP-ELISA)檢測(cè)方法。TRV特異性單克隆抗體，具有特異性強(qiáng)、均質(zhì)性好、可無(wú)限量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，從而使以單克隆抗體建立的ACP-ELISA血清學(xué)方法具有準(zhǔn)確性強(qiáng)、易標(biāo)準(zhǔn)化和大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)。此法也可有效用于田間TRV的檢測(cè)。盡管少有文獻(xiàn)報(bào)道TRV在我國(guó)的發(fā)生，但TRV作為檢疫性病害，TRV抗體的制備具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。TRV單克隆抗體的獲得及檢測(cè)方法的建立，將為該病毒病的快速診斷提供技術(shù)支持，同時(shí)為研究TRV侵染寄主的分子機(jī)理及基因沉默研究中打下基礎(chǔ)。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并非對(duì)發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本公開(kāi)內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為純化的TRV病毒粒子。圖2為T(mén)RV外殼蛋白Western-blot檢測(cè)，其中1:感病葉汁液；2:健康葉汁液。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:單克隆抗體的建立和篩選—.材料和方法1.病毒、培養(yǎng)基TRV，本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI-1640培養(yǎng)基、HT、HAT、抗體類(lèi)型及亞類(lèi)鑒定試劑盒、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG均為Sigma公司產(chǎn)品。2.煙草脆裂病毒的提純以實(shí)驗(yàn)室保存TRVPpK20株系的基因組RNA1和RNA2的菌液相同體積混合共浸潤(rùn)本氏煙，10-14d后收集病葉，并參照Hsu等(HsuHT，KimJY，LawsonRH.Purificationoflilysymptomlessvirusanddetectionofthevirusinlilies.PlantDisease,1995，79:912-916.，百合無(wú)癥病毒的純化及在百合中的病毒檢測(cè)，植物病害，1995，79:912-916)的提純方法略作修改提純病毒，即離心時(shí)在離心管底部加20%的蔗糖溶液墊，病毒提純液經(jīng)2%磷鴇酸(pH6.7)負(fù)染色后置日本JE0L公司的JEM-1200EX透射電鏡下觀察粒子形態(tài)。3.小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選與克隆參照青玲等(青玲，吳建祥，戚益軍，等.蠶豆萎蔫病毒單克隆抗體的研制及檢測(cè)應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào).2000,40(2):166-173.)報(bào)道的免疫程序用純化的TRV病毒粒子免疫8周齡的BALB/C小鼠。參照吳建祥等(吳建祥，林福呈，李德葆，等.稻瘟病菌單克隆抗體的研制及其對(duì)附著胞形成的影響[J].微生物學(xué)報(bào)，2000，40(6):638645.)的方法將免疫小鼠的脾細(xì)胞和鼠SP2/0細(xì)胞融合。融合細(xì)胞培養(yǎng)5d后，用HAT培養(yǎng)基再換液一次，第10d用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-30%時(shí)，取上清用間接ELISA方法篩選抗體陽(yáng)性？L篩選時(shí)包被抗原分別為提純的TRV、TRV感染的本氏煙病葉汁液(1:30稀釋)，并以健康葉汁液作陰性對(duì)照。選擇強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法連續(xù)克隆3次，最后一次克隆后檢測(cè)為陽(yáng)性的孔所得細(xì)胞株即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。4.腹水制備及抗體純化單克隆抗體腹水制備按照施曼玲等的方法(施曼玲，吳建祥，郭維，等.蕪菁花葉病毒單克隆抗體的制備及檢測(cè)應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào)，2004，44(2):185-188.)進(jìn)行，采用辛酸-硫酸銨方法(陳伯權(quán)，吳美英，葉群瑞.幾種部分純化單克隆抗體方法的比較[J].病毒學(xué)報(bào)，1990,6(2):122-126.)純化單抗腹水，獲得的純化單抗于-7(TC保存。5.抗體類(lèi)型及亞類(lèi)鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定采用Sigma公司的羊抗鼠IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM標(biāo)準(zhǔn)抗血清，將純化的腹水抗體作適當(dāng)稀釋后用瓊脂雙擴(kuò)散法測(cè)定，24h后觀察沉淀線，判斷單克隆抗體的抗體類(lèi)型及亞類(lèi)。以提純病毒(lPg/mL)包被ELISA板，倍比稀釋的腹水作一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行間接ELISA測(cè)定單克隆抗體的腹水效價(jià)。6.Western-blot檢測(cè)參照于翠等的方法(于翠，吳建祥，周雪平.番茄花葉病毒單克隆抗體的制備及檢測(cè)應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào)，2002，42(4):454-457.)進(jìn)行，用提純病毒進(jìn)行外殼蛋白亞基的SDS凝膠電泳，將電泳膠切割后一部分用于考馬斯亮藍(lán)染色觀察，另一部分進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，然后將電轉(zhuǎn)移所得的硝酸纖維素濾膜與不同的腹水單抗進(jìn)行Western-blot分析。7.TRV的ACP-ELISA檢測(cè)方法參照J(rèn)iang等(JiangJX，ChenZX，ZhouXP.ProductionofamonoclonalantibodytosugarcanemosaicvirusanditsapplicationforvirusdetectioninChina[J]JournalofPhytopathology.2003，151:361-364.，蔣軍喜，陳正賢，周雪平，甘蔗花葉病毒的單克隆抗體的制備及其在中國(guó)的病毒檢測(cè)應(yīng)用，植物病理學(xué)雜5志，2003，151:361-364)操作步驟進(jìn)行ACP-ELISA，用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)30倍稀釋的病葉汁液100yL/孔加入ELISA板，TRV提純病毒為陽(yáng)性對(duì)照，健康葉汁液為陰性對(duì)照，5000-10000倍稀釋單抗腹水為一抗，8000倍稀釋AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG結(jié)合物為二抗，硝基磷酸鹽(PNPP)為底物，用680酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-RAD)測(cè)OD，值，以P/N>2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。8.ACP-ELISA方法對(duì)TRV和不同病毒的特異性測(cè)定用提純的BBWV1(蠶豆萎蔫病毒I)、BBWV2(蠶豆萎蔫病毒II)、CarMV(香石竹斑駁病毒)、CMV(黃瓜花葉病毒)、PVX(馬鈴薯X病毒)、PVY(馬鈴薯Y病毒)、SCMV(甘蔗花葉病毒)、TMV(煙草花葉病毒)、ToMV(番茄花葉病毒)和TuMV(蕪菁花葉病毒)(均為浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所保存、提供)(lug/mL)包被ELISA反應(yīng)板，以免疫抗原TRV為陽(yáng)性對(duì)照，以包被緩沖液作陰性對(duì)照，用上述ACP-ELISA法，測(cè)定單克隆抗體的特異性反應(yīng)。9.ACP-ELISA方法檢測(cè)靈敏度檢測(cè)將TRV病葉汁液作1:101:10240倍比稀釋、提純的TRV病毒(5mg/mL)作1:10001:128000倍比稀釋后，分別作為抗原包被ELISA板，并以對(duì)應(yīng)稀釋度的健葉汁液和健葉提純液為陰性對(duì)照。將3C3單克隆抗體(最終篩選得到的單抗)腹水作l:5000倍稀釋后利用ACP-ELISA方法測(cè)定檢測(cè)靈敏度。二.結(jié)果1.煙草脆裂病毒的提純用改進(jìn)的方法提純本氏煙病葉樣品，在電鏡下觀察提純液中有高濃度的病毒粒子，形態(tài)呈兩種長(zhǎng)，短不同的桿狀，粒子完整(圖1)。2.雜交瘤細(xì)胞的融合、篩選、克隆免疫的BALB/C小鼠脾細(xì)胞和SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞按510:1的比例在50%PEG下融合，用HAT培養(yǎng)基篩選，6塊96孔細(xì)胞板的融合率為100%。融合10d后換用HT培養(yǎng)基，當(dāng)每孔雜交瘤細(xì)胞覆蓋孔底5%_30%時(shí)，采用間接ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體的分泌情況，有198孔表現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性率為35%。選擇8個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，最后獲得1株3C3能分泌抗TRV的特異性抗體雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，該株細(xì)胞株能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。進(jìn)行保藏，并用于下述實(shí)驗(yàn)。3.腹水抗體制備、抗體類(lèi)型及亞類(lèi)鑒定、效價(jià)測(cè)定注射單克隆雜交瘤細(xì)胞的BALB/C小鼠，約7-10d后腹部膨大，采集腹水，以后每天取一次，每只小鼠可取5-20mL腹水?？贵w類(lèi)型及亞類(lèi)鑒定結(jié)果表明3C3的抗體類(lèi)型及亞類(lèi)均為IgGl，而單克隆抗體的輕鏈均為k鏈；單抗腹水間接ELISA效價(jià)均達(dá)10—2(表1)。表lTRV單克隆抗體的特性單抗抗體類(lèi)型腹水效價(jià)IgG含量(mg/mL)-------------------------------------3C31gGl，K鏈l(T55.424.Western-blot分析對(duì)提純的TRV進(jìn)行Western-blot分析表明，該株單抗都能與TRV的22.3KD外殼蛋白亞基特異性結(jié)合(圖2)，說(shuō)明所制備的單抗是針對(duì)TRV的22.3KD外殼蛋白亞基的特異6性抗體。5.ACP-ELISA的特異性檢測(cè)ACP-ELISA檢測(cè)表明，該株單抗僅對(duì)TRV有特異性反應(yīng)，而與BBWVl、BBWV2、CarMV、CMV、PVX、PVY、SCMV、TMV、ToMV和TuMV等病毒均無(wú)反應(yīng)(表2)，說(shuō)明用這該株單抗建立的ACP-ELISA方法對(duì)TRV有很好的特異性。表2TRV單克隆抗體的特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>值。*加底物在室溫反應(yīng)30分鐘后的0D46.檢測(cè)靈敏度的確定靈敏度檢測(cè)表明，用3C3單克隆抗體建立的ACP-ELISA方法對(duì)1:5100倍稀釋的病葉汁液均呈陽(yáng)性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到l:ioo，對(duì)純病毒的檢測(cè)靈敏度可達(dá)18ng/mL，每孔的病毒絕對(duì)檢出量為1.8ng。實(shí)施例2:煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA檢測(cè)試劑盒一.試劑盒主要成分TRV單克隆抗體(純化后)0.1ml(IgG含量lmg/ml)AP標(biāo)記羊抗鼠IgG0.1ml(Sigma公司產(chǎn)品，濃度為lmg/ml)對(duì)硝基苯憐酸酯(p-nitrophenylphosphate,PNPP)陽(yáng)性對(duì)照(含煙草脆裂病毒煙草葉片汁液)陰性對(duì)照(健康煙草葉片汁液)以上試劑均保存于4t:下96孔ELISA反應(yīng)板樣品稀釋液即ELISA封閉液(10X)比濃度為20%的脫脂奶粉，脫脂奶粉為光明公司產(chǎn)^1.樣品準(zhǔn)備通常在樣品處理后立即進(jìn)行檢測(cè)，處理樣f樣品的損失。待測(cè)樣品假如是提取的植物汁液時(shí)，請(qǐng)用ELISA包被液以1:IO(汁液體積包被液體積)的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)灰部梢灾苯蛹尤隕LISA包被液研磨樣品，比例為1:10-30(樣品重量包被液體積)。應(yīng)準(zhǔn)備略多于檢測(cè)所需的待測(cè)樣品量，以確保加樣過(guò)程的順利進(jìn)0.15g2ml2ml10塊l瓶(質(zhì)j體積百分:所用容器應(yīng)當(dāng)不與樣品結(jié)合，以減少行。2.操作步驟(1)樣品包被稀釋好的樣品以100iil/孔加入ELISA板，在37t:下孵育2h，或4t:(2)洗滌甩掉板孔中的溶液后每孔加滿(mǎn)ELISA洗滌液(O.Olmol/LPBST，含體積_體積百分比濃度為0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液)，靜置3min后倒掉，重復(fù)三次。洗好的板置于吸水紙上拍干。(3)封閉ELISA封閉液200iU/孔加入ELISA板，37t:下孵育lh，以封閉掉抗原沒(méi)有結(jié)合的位點(diǎn)。(4)洗滌同(2)。(5)—抗將TRV單克隆抗體用ELISA封閉液以1:5000倍稀釋后，100y1/孔加入ELISA板，37。C下孵育lh。(6)洗滌同(2)。(7)酶標(biāo)二抗用ELISA封閉液將AP標(biāo)記羊抗鼠IgG以1:1000倍稀釋后，100ii1/孔加入ELISA板，37"下孵育lh。(8)洗滌用PBST洗滌4-6次后拍干。(9)PNPP顯色PNPP以1:1(mg/ml)溶于硝基苯磷酸酯(PNPP)底物緩沖液中，100ii1/孔加入ELISA板，室溫下顯色0.5-lh。(10)終止反應(yīng)3mol/L的NaOH50ii1/孔加入ELISA板。3.結(jié)果判定目測(cè)ELISA板，有明顯顏色變化的孔為T(mén)RV陽(yáng)性，而沒(méi)有明顯的顏色變化的孔為T(mén)RV陰性；也可用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀讀數(shù)，405nm波長(zhǎng)下測(cè)0D值。根據(jù)樣品孔0D405值/陰性孔0D405值大于2.1為陽(yáng)性，小于等于2.1為陰性。檢測(cè)結(jié)果只有在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果而陰性對(duì)照沒(méi)有顏色反應(yīng)時(shí)有效。4.保存及有效期于28t:避光保存，有效期12個(gè)月。5.緩沖液配方ELISA包被液碳酸鈉1.59g碳酸氫鈉2.93g疊氮化鈉0.2g加蒸餾水950溶解后調(diào)pH至9.6，定容至1000ml磷酸鹽緩沖液(PBS，O.01mol/L，pH7.4):NaCl8gKC10.2gKH2P040.2gNa2HP0412H203g疊氮化鈉0.2g加蒸餾水950溶解后調(diào)pH至7.4，定容至1000mlELISA洗滌液(O.01mol/LPBST):1000ml0.01mol/LPBS中力口0.5mlTween_20。ELISA封閉液0.Olmol/LPBST中加入脫脂奶粉至終濃度5%(W/V，質(zhì)量體積百分比濃度)硝基苯磷酸酯(PNPP)底物緩沖液乙二醇銨48.5ml8氯化鎂0.05g疊氮化鈉0.lg加蒸餾水400ml溶解，HC1調(diào)pH至9.8后加蒸餾水至500ml。4"保存。TRV單克隆抗體按照實(shí)施例1方法制備。陽(yáng)性對(duì)照含煙草脆裂病毒煙草葉片汁液冷凍干燥，使用時(shí)加入2毫升0.Olmol/LPBS。陰性對(duì)照健康煙草葉片汁液冷凍干燥，使用時(shí)加入2毫升0.Olmol/LPBS。實(shí)施例3:對(duì)田間及實(shí)驗(yàn)室樣品進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用1.用3C3單克隆抗體建立的ACP-ELISA方法，利用本專(zhuān)利生產(chǎn)的煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所提供的i:5100倍稀釋的病葉汁液檢測(cè)均呈陽(yáng)性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到i:ioo。2.用3C3單克隆抗體建立的ACP-ELISA方法，利用本專(zhuān)利生產(chǎn)的煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提供的l:5IOO倍稀釋的病葉汁液檢測(cè)均呈陽(yáng)性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到i:ioo。3.用3C3單克隆抗體建立的ACP-ELISA方法，利用本專(zhuān)利生產(chǎn)的煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)清華大學(xué)生物系病毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提供的l:5IOO倍稀釋的病葉汁液檢測(cè)均呈陽(yáng)性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到i:ioo。4.用3C3單克隆抗體建立的ACP-ELISA方法，利用本專(zhuān)利生產(chǎn)的煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)ACP-ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所提供的浸潤(rùn)發(fā)病的本氏煙提純病毒樣品，檢測(cè)靈敏度達(dá)18ng/mL，每孔的病毒絕對(duì)檢出量為1.8ng。權(quán)利要求檢測(cè)煙草脆裂病毒的單克隆抗體，由細(xì)胞株3C3分泌得到，該細(xì)胞株的保藏號(hào)為CGMCCNO.2679。2.單克隆細(xì)胞株3C3，保藏號(hào)為CGMCCNO.2679。3.單克隆細(xì)胞株3C3用于制備檢測(cè)煙草脆裂病毒的試劑的用途。4.一種檢測(cè)煙草脆裂病毒的試劑盒，由以下試劑組成TRV單克隆抗體0.1ml，IgG含量lmg/ml;AP標(biāo)記羊抗鼠IgG0.lml，濃度為lmg/ml;對(duì)石肖基苯磷酸酉旨(p-nitrophenylphosphate,PNPP)0.15g;陽(yáng)性對(duì)照(含煙草脆裂病毒煙草葉片汁液)2ml;陰性對(duì)照(健康煙草葉片汁液)2ml;以上試劑均保存于4t:下；96孔ELISA反應(yīng)板10塊；樣品稀釋液(10X)1瓶(20%的脫脂奶粉)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)煙草脆裂病毒的試劑盒，其特征在于，所述TRV單克隆抗體由細(xì)胞株3C3分泌得到，該細(xì)胞株的保藏號(hào)為CGMCCNO.2679。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測(cè)煙草脆裂病毒的細(xì)胞株、單克隆抗體和試劑盒，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。檢測(cè)煙草脆裂病毒的單克隆抗體，由細(xì)胞株3C3分泌得到，該細(xì)胞株的保藏號(hào)為CGMCCNo.2679本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明首次制備了TRV的單克隆抗體，建立了抗原包被ELISA(ACP-ELISA)檢測(cè)方法。TRV特異性單克隆抗體，具有特異性強(qiáng)、均質(zhì)性好、可無(wú)限量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，從而使以單克隆抗體建立的ACP-ELISA血清學(xué)方法具有準(zhǔn)確性強(qiáng)、易標(biāo)準(zhǔn)化和大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)。此法也可有效用于田間TRV的檢測(cè)。TRV單克隆抗體的獲得及檢測(cè)方法的建立，將為該病毒病的快速診斷提供技術(shù)支持，同時(shí)為研究TRV侵染寄主的分子機(jī)理及基因沉默研究中打下基礎(chǔ)。文檔編號(hào)G01N33/577GK101735318SQ20081022590公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月5日優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日發(fā)明者任魯風(fēng),呂玉峰,吳建祥,周琦,周雪平,李建光,梁新苗,武曉云,江麗輝,汪萬(wàn)春,汪琳,邊勇,鄧叢良,馬新穎,高文娜申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局;浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所