專利名稱：：檢測(cè)百菌清農(nóng)藥殘留的方法及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)果蔬中百菌清農(nóng)藥殘留的方法，以及百菌清ELISA檢測(cè)試劑盒，同時(shí)，本發(fā)明還涉及百菌清人工完全抗原的制備方法和百菌清多克隆抗體，屬于酶聯(lián)免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：百菌清(chlorothakmil)是一種廣譜性殺菌劑，在植物表面有良好的黏著性，不易受雨水沖刷，藥效穩(wěn)定。其純品為白色結(jié)晶，無臭味,不溶于水，微溶于丙酮等有機(jī)溶劑，對(duì)高等動(dòng)物低毒，但對(duì)魚類及甲殼類動(dòng)物毒性較大,主要用于防治蔬菜的霜霉病、炭疽病、疫病等(農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.新編農(nóng)藥手冊(cè)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社，1989,316-317.)。我國(guó)無公害蔬菜中規(guī)定百菌清殘留量不得超過1mg/kg，歐盟則規(guī)定百菌清的殘留不能高于0.01mg/kg(中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室.無公害食品標(biāo)準(zhǔn)匯編，蔬菜巻[M].北京中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003,第1版，41.)。現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要了色譜法、光譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、色譜-光譜聯(lián)用法、多維氣相色譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳法等(康長(zhǎng)安，何娟，楊柳，高會(huì)云，劉德倉(cāng)，盧奎.色譜、光譜及聯(lián)用技術(shù)在多農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用.環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù).2007，19(4):9-13,31;李海燕，施銀桃，曾慶福.毛細(xì)管電泳法直接測(cè)定化工廢水中鄰苯二甲酸二丁酯[J].環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)，2006,18(4):19-20.)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。應(yīng)用這些理化技術(shù)對(duì)糧油、果蔬樣品中痕量的百菌清殘留進(jìn)行分析，其儀器化程度要求高，而且要經(jīng)過繁瑣的分離、提取、凈化、衍生等前處理，分析速度慢且成本高。隨著待檢樣品量的增加，傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析手段難以適應(yīng)要求，因此，研制開發(fā)一種快速、高效、廉價(jià)的百菌清檢測(cè)方法就顯得尤為重要。80年代以來，免疫學(xué)技術(shù)在農(nóng)藥殘留中的檢測(cè)應(yīng)用越來越深入，ELISA法測(cè)定農(nóng)藥殘留以其特異性強(qiáng)、靈敏度高及快速準(zhǔn)確而得到廣泛的應(yīng)用，尤其是現(xiàn)場(chǎng)控制水果、蔬菜、食品中的農(nóng)藥殘留，對(duì)發(fā)展無污染農(nóng)產(chǎn)品，保障人體健康起到積極作用。有關(guān)ELISA法檢定農(nóng)殘的試劑盒層出不窮，但關(guān)于檢測(cè)百菌清的ELISA試劑盒還未見報(bào)道。本發(fā)明百菌清ELISA檢測(cè)試劑盒的研制填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是研制開發(fā)一種檢測(cè)果蔬中百菌清農(nóng)藥殘留的ELISA試劑盒及用該試劑盒檢測(cè)果蔬中百菌清農(nóng)藥殘留的方法，該方法能夠快速、高效地檢測(cè)果蔬中百菌清的農(nóng)藥殘留，而且成本廉價(jià)。同時(shí)，本發(fā)明還提供百菌清人工完全抗原的制備方法和百菌清多克隆抗體。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種百菌清人工完全抗原的制備方法，包括如下步驟1)將百菌清和氟化鉀溶解于乙二醇溶液中，油浴反應(yīng)；2)將反應(yīng)液冷卻到室溫后，傾入冰水中，沉淀完全后，經(jīng)后處理得白色粉末，即為半抗原；3)將上述半抗原溶解于DMF中，再加入咪唑酮進(jìn)行反應(yīng)，加入牛血清白蛋白，攪拌；4)進(jìn)行透析，離心，干燥，獲得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末。其中，半抗原的具體合成過程是一定量的百菌清(干燥)和氟化鉀溶解于乙二醇溶液中，在攪拌下，90。C油浴，36小時(shí)停止反應(yīng)，將反應(yīng)液冷卻到室溫后，傾入適量冰水中，沉淀完全后，經(jīng)后處理得白色粉末，將獲得的白色粉末于硅膠柱(300-400目)層析得目標(biāo)產(chǎn)物2,4,5-三氯-6-(2-羥基乙氧基)間苯二腈，即半抗原。人工完全抗原的具體合成過程是將獲得的上述半抗原(白色粉末)適量溶解于適量DMF中，于室溫?cái)嚢瑁蛊渫耆芙?，再加入適量咪唑酮，于室溫緩慢攪拌3h;于上述反應(yīng)液中加入適量牛血清白蛋白，再加入適量pH7.4PBS，于4。C攪拌14h左右；透析，離心，干燥，獲得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末。一種百菌清多克隆抗體，由上述方法制備的百菌清人工完全抗原免疫動(dòng)物得到，其中，免疫動(dòng)物優(yōu)選家兔。一種ELISA檢測(cè)百菌清農(nóng)藥殘留的方法，采用上述的百菌清多克隆抗體作為一抗。所述的ELISA檢測(cè)百菌清農(nóng)藥殘留的方法，包括如下步驟(1)抗原包被對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行包被；(2)封閉用封閉液進(jìn)行封閉；(3)加一抗加入權(quán)利要求2的多克隆抗體；(4)加入酶標(biāo)羊抗兔二抗，進(jìn)行孵育；(5)加底物液顯色加入新鮮配制的TMB底(6)終止反應(yīng)加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)；(7)結(jié)果判定將測(cè)定的OD值與陰性對(duì)照比較，或者在白色背景下，直接用肉眼觀察來確定陽(yáng)性或陰性結(jié)果。上述第(7)步的結(jié)果判定是用酶標(biāo)儀于450nrn和655nrn處進(jìn)行雙波長(zhǎng)掃描，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性，或在白色背景下，直接用肉眼觀察結(jié)果，反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺。上述第(1)步中待測(cè)樣品為蔬菜汁。一種百菌清ELISA檢測(cè)試劑盒，包括PBS的濃縮洗滌緩沖液、百菌清標(biāo)準(zhǔn)液、如權(quán)利要求2的抗百菌清的多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體、包被緩沖液、封閉緩沖液、底物溶液、濃縮底物緩沖液、反應(yīng)終止液、H202。所述百菌清標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為10100ug'mL"。所述PBS的濃縮洗滌緩沖液的pH7.4，包被緩沖液的pH9.6，濃縮底物緩沖液的pH5.5。ELISA檢測(cè)百菌清農(nóng)藥殘留的方法，其具體操作過程是(1)抗原包被將某一列的第一孔加O.lmL百菌清標(biāo)準(zhǔn)樣品和O.lmL包被緩沖液，以下各孔按行進(jìn)行倍比稀釋，作為陽(yáng)性對(duì)照，其余各孔則包被待檢樣品，37'C包被0.5h。再洗滌，瀝干。其中，洗滌是用稀釋成1X洗滌緩沖液洗滌35次，每次3分鐘。(2)封閉每孔用3%的明膠液進(jìn)行封閉。每個(gè)包被孔中加入0.3mL的封閉液，溫育0.5h。清洗并瀝干。(3)加一抗每個(gè)反應(yīng)孔加入O.lmL—抗于上述已包被之反應(yīng)孔中，37。C包被0.5h，然后洗滌。(4)加酶標(biāo)羊抗兔二抗各反應(yīng)孔中加入二抗O.lmL，37'C孵育0.5h，洗滌。(5)加底物液顯色于各孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液O.lmL，37'C孵育1030min。(6)終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05mL。在實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)計(jì)空白對(duì)照孔，即空白孔只在最后一步加底物緩沖液和終止液。(7)結(jié)果判定用酶標(biāo)儀于450nm和655nm處進(jìn)行雙波長(zhǎng)掃描，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照0D值的2.1倍，即為陽(yáng)性。也可在白色背景下，直接用肉眼觀察結(jié)果反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，根據(jù)所呈顏色的深淺，以"+"、"一"號(hào)表示。其中，上述第(1)、(3)、(4)步中所述的洗滌是用稀釋成1X洗滌緩沖液洗滌35次，每次3分鐘。本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明利用乙二醇取代百菌清分子6位碳原子上的氯原子合成半抗原，再采用咪唑酮法將半抗原連接到載體牛血清白蛋白分子上形成人工完全抗原，用該抗原免疫家兔制備多克隆抗體并和相關(guān)試劑組裝ELISA試劑盒，以抗原-一抗-酶標(biāo)二抗的ELISA間接法檢測(cè)百菌清農(nóng)藥殘留。本發(fā)明的方法具有成本低、效率高、檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn)，一次檢測(cè)96個(gè)樣品可在4h內(nèi)完成，檢測(cè)的最低限為0.016mg'kg—1。圖1百菌清半抗原、人工完全抗原的合成路線圖圖2百菌清半抗原的紅外光譜圖圖3百菌清半抗原的質(zhì)譜圖圖4百菌清半抗原的^-NMR圖5百菌清半抗原的13C-NMR(CD3COCD3)圖6百菌清半抗原(左)、BSA(中)、人工抗原(右)紫外光譜圖圖7百菌清半抗原、BSA、人工完全抗原的紅外光譜圖，其中，1半抗原；2人工抗原；3BSA。具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施方式的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限制，僅作示例說明。1.半抗原的分子設(shè)計(jì)及合成百菌清半抗原及人工完全抗原的合成路線見圖1。精密稱取干燥的百菌清500mg(1.9鵬ol)和氟化鉀273mg(4.7mmol)，溶解于20mL乙二醇溶液中，在90°C油浴條件下攪拌，36小時(shí)后停止反應(yīng)，將反應(yīng)液冷卻到室溫后，傾入50g冰水中，沉淀完全后，經(jīng)抽濾、冰水洗滌、真空干燥得262mg白色粉末。以石油醚丙酮=9:1(V/V)為洗脫液洗脫，硅膠柱(300-400目)柱層析分離，等體積(lOmL)收集餾分，TLC檢測(cè)合并相同流分，得到目標(biāo)產(chǎn)物97mg，具有如圖2所示紅外光譜圖，如圖3所示的質(zhì)譜圖，如圖4所示的^-NMR，如圖5所示的"C-NMR，故鑒定為2，4,5-三氯_6-(2-羥基乙氧基)-間苯二氰，為百菌清半抗原。2.人工完全抗原的合成稱取16.3mg百菌清半抗原溶解于2mLDMF中，于室溫?cái)嚢?，使其完全溶解，再加?.1mg咪唑酮，于室溫緩慢攪拌3h;于上述反應(yīng)液中加入37.7mg牛血清白蛋白，再加入6mLpH7.4PBS，于4。C攪拌14h左右；用7000D的透析袋透析，沉淀，12000卬m離心10min，干燥，獲得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末，百菌清人工完全抗原的結(jié)構(gòu)表征參見圖7和圖8。3.特異性抗體的制備用免疫學(xué)的方法免疫家兔，人工抗原的用量0.1mg/kg兔子，第一次免疫與第二次之間隔12天，第二次與第三次之間隔13天，第三次免疫結(jié)束后第18天采集血清。4.ELISA法檢測(cè)蔬菜中百菌清的殘留(1)包被用包被緩沖液將百菌清農(nóng)藥稀釋至10100ug'mL"作為百菌清標(biāo)準(zhǔn)液，于反應(yīng)孔中加入O.lmL，再加入0.lmL包被緩沖液，同時(shí)在其它孔加入待檢樣品如蔬菜汁和包被緩沖液各0.lmL，混勻，37'C包被0.5h。再用洗滌緩沖液洗滌35次，每次3分鐘，瀝干。(2)封閉用3%的明膠液進(jìn)行封閉。每個(gè)包被孔中加入0.3mL的封閉液，溫育0.5h。瀝干。(3)加上述方法制備得到的多克隆抗體作為一抗于上述已包被的反應(yīng)孔中加入用洗滌緩沖液稀釋的血清抗體(1:1000)0.lmL，37。C溫育0.5h，然后用洗滌緩沖液洗滌35次，每次3分鐘，瀝干。(4)加酶標(biāo)羊抗兔二抗于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)羊抗兔二抗(按l:1000稀釋)0.1mL，37'C孵育0.5h，用洗滌緩沖液洗滌35次，每次3分鐘，瀝干。(5)加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液O.lmL，37'C孵育1030min。此時(shí)陽(yáng)性反應(yīng)孔呈藍(lán)色。(6)終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。此時(shí)原來的藍(lán)色孔變成棕黃色或黃色。在實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)計(jì)空白對(duì)照孔，即空白孔只在最后一步加底物緩沖液和終止液。(7)結(jié)果判定用酶標(biāo)儀于450nm和655nm處進(jìn)行雙波長(zhǎng)掃描，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)定各孔的光吸收值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照光吸收值的2.l倍，即為陽(yáng)性。也可在白色背景下，直接用肉眼觀察結(jié)果反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，根據(jù)所呈顏色的深淺，以"+"、"一"號(hào)表示。多次重復(fù)平均結(jié)果見下表l:表1用該ELISA試劑盒檢測(cè)待檢樣品中百菌清殘留的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表l結(jié)果可知，該試劑盒可用于檢測(cè)糧油和果蔬中的百菌清農(nóng)藥殘留量，肉眼檢測(cè)最低限為0.032mg/kg，酶標(biāo)儀檢測(cè)最低限0.016mg/kg。權(quán)利要求1.一種百菌清人工完全抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)將百菌清和氟化鉀溶解于乙二醇溶液中，油浴反應(yīng)；2)將反應(yīng)液冷卻到室溫后，傾入冰水中，沉淀完全后，經(jīng)后處理得白色粉末，即為半抗原；3)將上述半抗原溶解于DMF中，再加入咪唑酮進(jìn)行反應(yīng)，加入牛血清白蛋白，攪拌；4)進(jìn)行透析，離心，干燥，獲得百菌清人工完全抗原的乳白色粉末。2.—種百菌清多克隆抗體，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備的百菌清人工完全抗原免疫動(dòng)物得到。3.—種ELISA檢測(cè)百菌清農(nóng)藥殘留的方法，其特征在于采用如權(quán)利要求2所述的多克隆抗體作為一抗。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于包括如下步驟(1)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行包被；(2)用封閉液進(jìn)行封閉；(3)加入權(quán)利要求2的多克隆抗體作為一抗；(4)加入酶標(biāo)羊抗兔二抗，進(jìn)行孵育；(5)加入新鮮配制的TMB底物溶液；(6)加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)；(7)結(jié)果判定將測(cè)定的OD值與陰性對(duì)照比較，或者在白色背景下，直接用肉眼觀察來確定陽(yáng)性或陰性結(jié)果。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于第(7)步結(jié)果判定是用酶標(biāo)儀于450nm和655nm處進(jìn)行雙波長(zhǎng)掃描，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照0D值的2.1倍，即為陽(yáng)性，或在白色背景下，直接用肉眼觀察結(jié)果，反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺。6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述待測(cè)樣品為蔬菜汁。7.—種百菌清ELISA檢測(cè)試劑盒，包括PBS的濃縮洗滌緩沖液、百菌清標(biāo)準(zhǔn)液、如權(quán)利要求2的抗百菌清的多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體、包被緩沖液、封閉緩沖液、底物溶液、濃縮底物緩沖液、反應(yīng)終止液、H202。8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述百菌清標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為10lOOug-mL"。9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述PBS的濃縮洗滌緩沖液的pH7.4，包被緩沖液的pH9.6，濃縮底物緩沖液的pH5.5。全文摘要本發(fā)明涉及一種百菌清農(nóng)藥殘留ELISA檢測(cè)方法及其試劑盒。利用乙二醇取代百菌清分子6位碳原子上的氯原子合成半抗原，再采用咪唑酮法將半抗原連接到載體牛血清白蛋白分子上形成人工完全抗原，用該抗原免疫家兔制備多克隆抗體并和相關(guān)試劑組裝ELISA試劑盒，以抗原-一抗-酶標(biāo)二抗的ELISA間接法檢測(cè)百菌清農(nóng)藥殘留。本發(fā)明具有成本低、效率高、檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn)，一次檢測(cè)96個(gè)樣品可在4h內(nèi)完成，檢測(cè)的最低限為0.016mg·kg^-1。文檔編號(hào)G01N33/543GK101412756SQ20081022723公開日2009年4月22日申請(qǐng)日期2008年11月25日優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日發(fā)明者萬傳星,波井,劉文杰,張利莉,王彥芹,白紅進(jìn),趙小亮,偉陳申請(qǐng)人:塔里木大學(xué)