專利名稱：一種用親和素化的熒光量子標(biāo)記的免疫印跡定量檢測(cè)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用親和素化熒光量子團(tuán)做標(biāo)記的免疫印跡分析檢測(cè)微量蛋白的 方法，特別強(qiáng)調(diào)了用親和素化熒光量子團(tuán)做標(biāo)記時(shí)的高靈敏度及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可 保存性，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫印跡法(Western blotting)是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析 技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等 優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法，如組織抗原的定 性定量檢測(cè)、多肽分子的質(zhì)量測(cè)定及病毒的抗體或抗原檢測(cè)等。但傳統(tǒng)的免疫 印跡方法只能做定性或半定量分析，在做更深入的分析時(shí)受到一定限制，本發(fā) 明在傳統(tǒng)免疫印跡方法的基礎(chǔ)上引入CdTe (635nm)熒光量子點(diǎn)，把待測(cè)目標(biāo) 蛋白量的信號(hào)轉(zhuǎn)化為光信號(hào)，最后轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達(dá) 到定量分析的目的。

發(fā)明內(nèi)容
(一) 要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明旨在建立一個(gè)以CdTe熒光為信號(hào)的免疫印跡(western blotting)蛋 白分析方法。本發(fā)明利用量子點(diǎn)的熒光信號(hào)，提高免疫印跡分析方法的靈敏度、 準(zhǔn)確度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到蛋白定量分析的目的。
(二) 技術(shù)解決方案 一種用親和素化的熒光量子標(biāo)記的免疫印跡定量檢測(cè)蛋白的方法，首先將
待測(cè)蛋白跑電泳，跑完電泳的凝膠進(jìn)行半干式western blotting蛋白轉(zhuǎn)移，將凝 膠中的待測(cè)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜PVDF上，然后對(duì)轉(zhuǎn)移完的PVDF膜進(jìn) 行封閉，加抗待測(cè)蛋白的一抗反應(yīng)，加生物素標(biāo)記的二抗反應(yīng)，再加入親和素 標(biāo)記的熒光量子團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，最后進(jìn)行結(jié)果鑒定； (一)親和素化熒光量子團(tuán)的制備
(1) BSA變性
將16.5mg BSA溶于lOmL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4,室溫下 反應(yīng)lh, 60-80。C下加熱20min分解過量的NaBH4， BSA變性后成dBSA， 二硫 鍵打開成-SH，最終的dBSA水溶液的濃度為5xl0-5M;
(2) dBSA的琥珀酰胺生物素化，即制備NHS-biotin-dBSA: 將琥珀酰胺生物素NHS-biotin按20mg/mL溶于二甲亞砜中，dBSA與麗S-biotin摩爾比1 : 30進(jìn)行混合，攪拌反應(yīng)2h，反應(yīng)完成后紫外掃描進(jìn)行鑒定；
(3) 生物素化的dBSA包裹量子點(diǎn) 將dBSA和量子點(diǎn)分別按摩爾比1 : 1， 1 : 2， 1 : 4， 1 : 6混合，60-80。C水
浴加熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全，即為熒光量子團(tuán)；
(4) 親和素化熒光量子團(tuán)的制備 將親和素與熒光量子團(tuán)按摩爾比4 : 1反應(yīng)lh， 4000r/min離心5min，去上
清，用pH7.4PBS復(fù)溶沉淀即得親和素標(biāo)記的熒光量子團(tuán)；
(二)免疫印跡分析目標(biāo)蛋白
(1) SDS凝膠電泳 根據(jù)待測(cè)蛋白樣品分子量選擇合適的分離膠及濃縮膠濃度；配制相應(yīng)濃度 的分離膠、濃縮膠，在恒壓條件進(jìn)行電泳；
(2 ) western blotting轉(zhuǎn)移蛋白 將凝膠電泳去除濃縮膠部分，于電極緩沖液中浸泡15min， PVDF膜與濾紙 切成凝膠一樣大小，PVDF膜于電極緩沖液中浸泡至少5min，濾紙于電極緩沖 液中浸濕即可，按3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙疊放，置于半干式轉(zhuǎn)印 槽中，以2mA/cm2，轉(zhuǎn)移40min，即達(dá)到轉(zhuǎn)移蛋白的目的；
(3)蛋白質(zhì)鑒定，即免疫檢測(cè) 轉(zhuǎn)移成功后的PVDF膜在37'C烘箱中干燥lh，取出后用甲醇浸泡數(shù)分鐘， 超純水洗凈，加5%BSA+0.05%Tween對(duì)膜進(jìn)行封閉，室溫lh，用pH7.4 PBS 5min 洗滌3遍；加稀釋1000倍的一抗3mL在室溫下反應(yīng)lh，用pH7.4 PBS 5min洗 凈3遍；加稀釋1000倍的生物素標(biāo)記的二抗3mL室溫反應(yīng)lh，用pH7.4 PBS 5min 洗滌3遍；再加稀釋1000倍的親和素標(biāo)記的熒光量子團(tuán)3mL反應(yīng)2h，用pH7.4 PBS5min洗凈3遍；洗滌后用熒光成像儀進(jìn)行檢測(cè)；待測(cè)蛋白量越多，所得熒 光值越高；
標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將己知蛋白含量的待測(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)品配成由高到低6個(gè) 濃度，進(jìn)行(一)、(二)步驟的反應(yīng)，根據(jù)熒光成像儀測(cè)定結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量 為橫坐標(biāo)，以所測(cè)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
所用的量子點(diǎn)是指能夠發(fā)射熒光的納米粒子，即發(fā)光微粒，購(gòu)于博陽生物 科技(上海)有限公司。
所述的SDS凝膠電泳待測(cè)蛋白樣品為蛋白A,配制質(zhì)量濃度10%的分離 膠、質(zhì)量濃度5%的濃縮膠，在恒壓條件進(jìn)行電泳先80V電壓下跑至濃縮膠與 分離膠界面，然后100V電壓下跑完。
所說的電泳凝膠進(jìn)行半干式western blotting蛋白轉(zhuǎn)移是在半干式western blotting轉(zhuǎn)印槽中利用電流作用將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以便做進(jìn)一 步分析。所說的PVDF膜的封閉是將PVDF上未結(jié)合蛋白的位點(diǎn)進(jìn)行封閉，以保證 在后續(xù)免疫反應(yīng)中一抗、二抗與待測(cè)蛋白的特異性結(jié)合，避免其非特異性地吸 附到PVDF膜上，以至背景值過高。
所說的加一抗、二抗反應(yīng)是指加入待測(cè)目標(biāo)蛋白特異的多克隆抗體，二抗 是生物素化的羊抗兔抗體。
所說的結(jié)果鑒定是最后加入親和素化的熒光量子團(tuán)，反應(yīng)后用熒光凝膠成 像儀進(jìn)行檢測(cè)分析。 (三)有益效果
(1) 本發(fā)明在傳統(tǒng)免疫印跡分析的基礎(chǔ)上引入親和素化的熒光量子點(diǎn)，簡(jiǎn) 化了操作步驟，靈敏度很高，利于進(jìn)行微量目標(biāo)蛋白的檢測(cè)分析。
(2) 本法突破了免疫印跡方法半定量分析的局限，將微量蛋白量的信號(hào)轉(zhuǎn) 化為光信號(hào)，再將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá)到定量分析 微量蛋白的目的。
(3) 量子點(diǎn)的光信號(hào)在一定溶液中可以長(zhǎng)時(shí)間保存。
(4) 對(duì)于珍貴的蛋白樣品，本法還適用于進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。


圖l變形BSA (dBSA)的生物素化。1.琥珀酰胺生物素，2.變性BSA，
3. 生物素化dBSA。
圖2生物素化的dBSA包裹量子點(diǎn)。l.標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2.量子點(diǎn)；3.變性BSA;
4. 變性BSA-量子點(diǎn)(摩爾比6 : 1); 5.變性BSA-量子點(diǎn)(摩爾比4 : 1);6.變 性BSA-量子點(diǎn)(摩爾比2 : 1); 7.變性BSA-量子點(diǎn)(摩爾比1 : 1)。
圖3生物素化的dBSA包裹量子點(diǎn)熒光掃描圖。圖中數(shù)值為變性BSA與 量子點(diǎn)摩爾比值。
圖4 protein A的熒光免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線 具體實(shí)施方法
(一)親和素化熒光量子團(tuán)的制備
(1) BSA變性
將16.5mgBSA溶于lOmL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mgNaBH4,室溫下反 應(yīng)lh,60-8(TC下加熱20min，分解過量的NaBHp BSA變性，二硫鍵打開成-SH， 最終的dBSA水溶液的濃度為5xl0_5M。
(2) dBSA的琥珀酰胺生物素化(NHS-biotin-dBSA的制備) 將琥珀酰胺生物素(NHS-biotin)按20mg/mL溶于二甲亞砜中，dBSA與
NHS-biotin摩爾比1 : 30進(jìn)行混合，攪拌反應(yīng)2h，反應(yīng)完成后紫外掃描進(jìn)行鑒 定。
(3) 生物素化的變性BSA包裹量子點(diǎn)將dBSA和量子點(diǎn)按一定的摩爾比(l : 1， 1 : 2， 1 : 4， 1 : 6)混合，60-80°C 水浴加熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全。 用SDS-PAGE熒光掃描鑒定包裹結(jié)果。 SDS-PAGE條件10°/。分離膠，4%濃縮膠，電壓120V。
(4)親和素化熒光量子團(tuán)的制備 將親和素與熒光量子團(tuán)按摩爾比4 : 1反應(yīng)lh， 4000r/min離心5min，去上 清，用pH7.4PBS復(fù)溶沉淀即得。 (二)免疫印跡分析目標(biāo)蛋白
(1) SDS凝膠電泳
取待測(cè)樣品蛋白A，配制10%濃度的分離膠、5%濃度的濃縮膠，在恒壓條 件進(jìn)行電泳先80V電壓下跑至濃縮膠與分離膠界面，然后100V電壓下跑完。
(2) western blotting轉(zhuǎn)移蛋白
將凝膠電泳去除濃縮膠部分，于電極緩沖液中浸泡15min， PVDF膜與濾紙 切成凝膠一樣大小，PVDF膜于電極緩沖液中浸泡至少5min，濾紙于電極緩沖 液中浸濕即可，按3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙疊放，置于半干式轉(zhuǎn)印 槽中，以2mA/cm2，轉(zhuǎn)移40min，即可達(dá)到轉(zhuǎn)移蛋白的目的。
(3) 蛋白質(zhì)鑒定(免疫檢測(cè)) 轉(zhuǎn)移成功后的PVDF膜在37"C烘箱中干燥lh，取出后用甲醇浸泡數(shù)分鐘，
超純水洗凈，加5%BSA+0.05%Tween對(duì)膜進(jìn)行封閉，室溫lh。用pH7.4 PBS 5min 洗滌3遍，加一抗(稀釋1000倍)3mL在室溫下反應(yīng)lh， 5min洗凈3遍，加生物 素標(biāo)記的二抗(稀釋1000倍)3mL室溫反應(yīng)lh， 5min洗滌3遍，最后加親和素標(biāo) 記的熒光量子團(tuán)(稀釋1000倍)3mL反應(yīng)2h，洗滌后用熒光成像儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行處 理。待測(cè)蛋白量越多，所得熒光值越高。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將已知含量的待測(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)品配成由高到低6個(gè)濃度， 進(jìn)行(一)、(二)步驟的反應(yīng)，根據(jù)熒光成像儀測(cè)定結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量為橫坐 標(biāo)，以所測(cè)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
權(quán)利要求
1、一種用親和素化的熒光量子標(biāo)記的免疫印跡定量檢測(cè)蛋白的方法，其特征是首先將待測(cè)蛋白跑電泳，跑完電泳的凝膠進(jìn)行半干式western blotting蛋白轉(zhuǎn)移，將凝膠中的待測(cè)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜PVDF上，然后對(duì)轉(zhuǎn)移完的PVDF膜進(jìn)行封閉，加抗待測(cè)蛋白的一抗反應(yīng)，加生物素標(biāo)記的二抗反應(yīng)，再加入親和素標(biāo)記的熒光量子團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，最后進(jìn)行結(jié)果鑒定；(一)親和素化熒光量子團(tuán)的制備(1)BSA變性將16. 5mg BSA溶于10mL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4，室溫下反應(yīng)1h，60-80℃下加熱20min分解過量的NaBH4，BSA變性后成dBSA，二硫鍵打開成-SH，最終的dBSA水溶液的濃度為5×10-5M；(2)dBSA的琥珀酰胺生物素化，即制備NHS-biotin-dBSA將琥珀酰胺生物素NHS-biotin按20mg/mL溶于二甲亞砜中，dBSA與NHS-biotin摩爾比1∶30進(jìn)行混合，攪拌反應(yīng)2h，反應(yīng)完成后紫外掃描進(jìn)行鑒定；(3)生物素化的dBSA包裹量子點(diǎn)將dBSA和量子點(diǎn)分別按摩爾比1∶1，1∶2，1∶4，1∶6混合，60-80℃水浴加熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全，即為熒光量子團(tuán)；(4)親和素化熒光量子團(tuán)的制備將親和素與熒光量子團(tuán)按摩爾比4∶1反應(yīng)1h，4000r/min離心5min，去上清，用pH7.4PBS復(fù)溶沉淀即得親和素標(biāo)記的熒光量子團(tuán)；(二)免疫印跡分析目標(biāo)蛋白(1)SDS凝膠電泳根據(jù)待測(cè)蛋白樣品分子量選擇合適的分離膠及濃縮膠濃度；配制相應(yīng)濃度的分離膠、濃縮膠，在恒壓條件進(jìn)行電泳；(2)westernblotting轉(zhuǎn)移蛋白將凝膠電泳去除濃縮膠部分，于電極緩沖液中浸泡15min，PVDF膜與濾紙切成凝膠一樣大小，PVDF膜于電極緩沖液中浸泡至少5min，濾紙于電極緩沖液中浸濕即可，按3層濾紙、凝膠、PVDF膜、3層濾紙疊放，置于半干式轉(zhuǎn)印槽中，以2mA/cm2，轉(zhuǎn)移40min，即達(dá)到轉(zhuǎn)移蛋白的目的；(3)蛋白質(zhì)鑒定，即免疫檢測(cè)轉(zhuǎn)移成功后的PVDF膜在37℃烘箱中干燥1h，取出后用甲醇浸泡數(shù)分鐘，超純水洗凈，加5％BSA+0.05％Tween對(duì)膜進(jìn)行封閉，室溫1h，用pH7.4 PBS 5min洗滌3遍；加稀釋1000倍的一抗3mL在室溫下反應(yīng)1h，用pH7.4 PBS 5min洗凈3遍；加稀釋1000倍的生物素標(biāo)記的二抗3mL室溫反應(yīng)1h，用pH7.4 PBS 5min洗滌3遍；再加稀釋1000倍的親和素標(biāo)記的熒光量子團(tuán)3mL反應(yīng)2h，用pH7.4PBS 5min洗凈3遍；洗滌后用熒光成像儀進(jìn)行檢測(cè)；待測(cè)蛋白量越多，所得熒光值越高；標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將已知蛋白含量的待測(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)品配成由高到低6個(gè)濃度，進(jìn)行(一)、(二)步驟的反應(yīng)，根據(jù)熒光成像儀測(cè)定結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以所測(cè)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用的量子點(diǎn)是指能夠發(fā)射 熒光的納米粒子，即發(fā)光微粒。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于SDS凝膠電泳待測(cè)蛋白樣品 為蛋白A，配制質(zhì)量濃度10%的分離膠、質(zhì)量濃度5%的濃縮膠，在恒壓條件進(jìn) 行電泳先80V電壓下跑至濃縮膠與分離膠界面，然后100V電壓下跑完。
全文摘要
一種用親和素化的熒光量子標(biāo)記的免疫印跡定量檢測(cè)蛋白的方法，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先將待測(cè)蛋白跑電泳，跑完電泳的凝膠進(jìn)行半干式western blotting蛋白轉(zhuǎn)移，將凝膠中的待測(cè)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜PVDF上，然后對(duì)轉(zhuǎn)移完的PVDF膜進(jìn)行封閉，加抗待測(cè)蛋白的一抗反應(yīng)，加生物素標(biāo)記的二抗反應(yīng)，再加入親和素標(biāo)記的熒光量子團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，最后進(jìn)行結(jié)果鑒定；本發(fā)明在傳統(tǒng)免疫印跡分析的基礎(chǔ)上引入親和素化的熒光量子點(diǎn)，簡(jiǎn)化了操作步驟，靈敏度很高，利于進(jìn)行微量目標(biāo)蛋白的檢測(cè)分析。本法將微量蛋白量的信號(hào)轉(zhuǎn)化為光信號(hào)，再將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá)到定量分析微量蛋白的目的。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101413958SQ20081023413
公開日2009年4月22日 申請(qǐng)日期2008年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月3日
發(fā)明者劉麗強(qiáng), 彭池方, 胥傳來, 媛 袁, 許定花, 金征宇, 偉 陳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)