專利名稱：基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥的試劑盒。
背景技術(shù)：
在男性不育的病例中，無精子癥占有較大的比例，文獻報道其最高發(fā)生率 達24.3%。其發(fā)病原因很多，包括內(nèi)分泌因素、遺傳因素、理化因素、藥物因素 及疾病因素等。無精子癥可由多種病因引起，但概括起來可分為兩大類， 一類 為睪丸有正常生精功能，由于輸精管道梗阻，精子不能排出體外，即所謂梗阻 性無精子癥(OA);另一類為睪丸生精功能障礙，精子不能發(fā)生，即所謂非梗 阻性無精子癥(NOA)，其病因甚多，有遺傳因素、內(nèi)分泌因素、藥物因素、理 化因素及疾病因素等。
既往用果糖定性實驗鑒別梗阻性無精子癥，精道梗阻患者精漿果糖陰性， 但需排除是否有輸精管及精囊缺如；若輸精管正常，則可能系獲得性射精管梗 阻。精漿果糖陽性，則需行精道造影。若無精道梗阻，則需作睪丸活檢，以明 確睪丸原發(fā)性生精障礙的診斷。精道造影及睪丸活檢有一定的創(chuàng)傷，并且可引 起一些并發(fā)癥，如陰囊血腫、疼痛和感染，且對生精上皮有一定的損傷，也不 能完全排除活檢損傷引起的免疫反應即免疫性睪丸炎的可能性。
近年來，用查找精液中生精細胞來鑒別梗阻性與原發(fā)性無精子癥的研究受到 關(guān)注，研究認為，同一病人精液生精細胞檢查結(jié)果與睪丸活檢所反應的細胞發(fā) 育水平相一致，并認為是替代睪丸活檢的理想方法。然而，未査見生精細胞的無精子癥患者，仍有相當比例屬于非梗阻性無精子癥。
目前，對于臨床上睪丸容積正常，性激素水平亦正常的無精子癥患者，為
了鑒別是梗阻性無精子癥(OA)還是非梗阻性(NOA)即原發(fā)性生精障礙，最 終只有依靠操作復雜，損傷嚴重的輸精管造影和診斷性外科取精手術(shù)，如經(jīng)皮 附睪精子抽吸術(shù)(PESA)和睪丸精子抽吸術(shù)(TESA)，這些都是創(chuàng)傷性的、破壞 性的診斷性檢查，病人有恐懼感，不易接受，不經(jīng)濟且不實用。所以，尋找簡 便易行、無創(chuàng)傷及副作用的鑒別方法顯得十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
Eppin (SPINLW1; GenelD57119)是睪丸和附睪特異性分泌的具有絲氨酸 蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，存在于睪丸和附睪中，射精后的人類精漿中及精 子表面均分布大量的Eppin。梗阻性無精子癥患者精漿中將不含Eppin，非梗阻 性無精子患者精漿中含有Eppin,本發(fā)明的目的在于利用上述這一特點，提供一 種具有重要的臨床實用價值的一種基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精 子癥的試劑盒，它由下述技術(shù)方案來實施.-
包括牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液、TBST洗脫液、兔抗人Eppin抗體、羊 抗兔IgG抗體、顯色劑、微量過濾器及置于其間的硝酸纖維素膜，測試時待檢 精漿經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋后吸附固定在微量過濾器中的硝酸纖維素膜上并用牛 血清白蛋白封閉，用TBST洗脫液對經(jīng)所述蛋白封閉的硝酸纖維素膜進行第一 次洗滌，再經(jīng)兔抗人Eppin抗體孵育后用TBST進行第二次洗滌，爾后經(jīng)羊抗兔 IgG抗體孵育，最后用顯色劑顯色鑒別。
所述羊抗兔IgG抗體采用堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG抗體。
所述堿性磷酸酶標記的羊抗兔的第二抗體的滴度為1: 2000。
所述牛血清白蛋白的濃度為3%。所述兔抗人抗體的滴度為1: 2000。
所述顯色劑采用氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。
本發(fā)明的用抗Eppin抗體檢測精漿中Eppin的診斷試劑盒，以鑒別梗阻性 (OA)和非梗阻性(NOA)無精子癥，無創(chuàng)傷，以此可減輕病人接受精道造影和 睪丸活檢的痛苦，同時可節(jié)省原精道造影等相關(guān)檢測所需的大量的檢測費用； 用本發(fā)明試劑盒來鑒別梗阻性(OA)和非梗阻性(NOA)無精子癥其抗原抗體反 應特異性強，靈敏度高，可達分子水平，并且簡單易行和快速，只需一滴精液， 2小時內(nèi)出結(jié)果；由于臨床上有大量無精子癥患者，而本發(fā)明試劑盒能簡單易行 地鑒別梗阻性(OA)和非梗阻性(NOA)無精子癥，所以本發(fā)明在臨床上具有重 要的應用前景和實用價值。


圖1是本發(fā)明試劑盒檢測非梗阻性無精癥患者和梗阻性無精癥患者精漿的 情形。
圖2是精漿的相差圖像。
圖3是附睪管腔上皮細胞顯微圖像。
圖4是將Eppin的DNA插入PET100D/TOP質(zhì)粒，體外重組6-His-Eppin蛋 白質(zhì)，Western blotting印跡圖。
圖5是正常人、非梗阻性無精癥患者和梗阻性無精癥患者精槳中Eppin蛋 白的Western blotting印跡圖。
圖6是Bio-Dot微量過濾器的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
本實施例的Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥的試劑盒主要由硝 酸纖維素膜、3%牛血清白蛋白(BSA)、磷酸鹽緩沖液、TBST洗脫液、1: 2000兔抗人Eppin抗體(購自美國SANTA CRUZ公司)、堿性磷酸酶(AP)標記的 1: 2000山羊抗兔IgG抗體(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)和氮藍四唑 /5-溴-4-氯-3-n引噪磷酸顯色劑組成。TBST是一種常用的生物洗滌液，由PH為 7.5、濃度為lOOmM的Tris-HCl (三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽)和濃度為150mM 的NaCl及濃度為0.05%的Tween-20配制而成。
測試時一般先將硝酸纖維素膜置于Bio-Dot微量過濾器上。Bio-Dot微量過 濾器的結(jié)構(gòu)見圖6，主要由模板1、密封墊2、密封墊支板3和設有抽真空管6 的底座4組成。模板1、密封墊2和密封墊支板3上均布有相互對應的若干孔7， 硝酸纖維素膜5置于密封墊2上。
本實施例分別取3例無精癥患者的精漿，分別用lOul磷酸緩沖液稀釋，稀 釋后分別從模板1的三個孔中滴入Bio-Dot微量過濾器中，用密封墊支板3上的 抽真空管6抽氣，使該微量過濾器的內(nèi)部形成負壓，從而使上述精漿吸附固定 于硝酸纖維素膜上。用3%牛血清白蛋白封閉該硝酸纖維素膜30分鐘后，用上 述TBST對牛血清白蛋白封閉后的硝酸纖維素膜洗滌3次。洗滌后，用滴度l: 2000兔抗人Eppin抗體(第一抗體)孵育1小時。再次用TBST洗滌3次。爾 后加入堿性磷酸酶(AP)標記的l: 2000山羊抗兔的IgG二抗，孵育1小時， 最后用氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)顯色劑顯色鑒別，其結(jié)果 如圖1所示Eppin陽性(Lane 1， Lane 2)為非梗阻性無精癥患者；Eppin陰性 (Lane 3)，為梗阻性無精癥患者。
用抗Eppin抗體行免疫熒光和免疫組織化學研究，附睪管腔上皮細胞及精子 表面、精漿中均含有大量的Eppin蛋白，如圖2、 3。
將Eppin的DNA插入PET100D/TOP質(zhì)粒，體外重組6-His-Eppin蛋白質(zhì)， Western blotting印跡結(jié)果如圖4。取正常人、非梗阻性無精癥和梗阻性無精癥患者的精漿各20ul進行Western blotting檢測，結(jié)果參見圖5，正常人和非梗阻性無精癥患者精漿中含有Eppin 蛋白(圖中的Lanel、 Lane2所示，Eppin蛋白顯色呈陽性)，特異性高。而 梗阻性無精癥患者精漿中未檢測到Eppin蛋白(圖中的Lane3所示，Eppin蛋 白顯色呈陰性)。Western blotting印跡法進一步證實了試劑盒鑒別無精癥的可 行性。
所以，用抗Eppin抗體檢測梗阻性無精子癥和非梗阻性無精子癥特異性高， 靈敏度高，準確性高，再加上無創(chuàng)傷性；快速方便和檢測費用低，具有廣闊的 臨床應用前景。
本發(fā)明應不限于上述實施例，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，睪丸和附睪的其它 特異性蛋白如HE、 PH2()、 P34H、 GP20、 GP83、 GP39、 Ubiquitin等也可以做成 上述的試劑盒用于檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥。
權(quán)利要求
1. 基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥的試劑盒，其特征在于包括牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液、TBST洗脫液、兔抗人Eppin抗體、羊抗兔IgG抗體、顯色劑、微量過濾器及置于其間的硝酸纖維素膜，測試時待檢精漿經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋后吸附固定在微量過濾器中的硝酸纖維素膜上并用牛血清白蛋白封閉，用TBST洗脫液對經(jīng)所述蛋白封閉的硝酸纖維素膜進行第一次洗滌，再經(jīng)兔抗人Eppin抗體孵育后用TBST緩沖液進行第二次洗滌，爾后經(jīng)羊抗兔IgG抗體孵育，最后用顯色劑顯色鑒別。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥 的試劑盒,其特征在于所述羊抗兔IgG抗體采用堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG抗 體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥 的試劑盒，其特征在于所述堿性磷酸酶標記的羊抗兔的第二抗體的滴度為1: 2000。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥 的試劑盒，其特征在于所述牛血清白蛋白的濃度為3%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥 的試劑盒，其特征在于所述兔抗人抗體的滴度為h 2000。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥 的試劑盒，其特征在于所述顯色劑采用氮藍四唑/5-溴-4-氯-3』引哚磷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于Eppin抗體檢測梗阻性和非梗阻性無精子癥的試劑盒。包括牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液、TBST洗脫液、兔抗人Eppin抗體、羊抗兔IgG抗體、顯色劑、微量過濾器及置于其間的硝酸纖維素膜，測試時待檢精漿經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋后吸附固定在微量過濾器中的硝酸纖維素膜上并用牛血清白蛋白封閉，用TBST洗脫液對經(jīng)所述蛋白封閉的硝酸纖維素膜進行第一次洗滌，再經(jīng)兔抗人Eppin抗體孵育后用TBST進行第二次洗滌，爾后經(jīng)羊抗兔IgG抗體孵育，最后用顯色劑顯色鑒別。其優(yōu)點是無創(chuàng)傷，以此可減輕病人接受精道造影和睪丸活檢的痛苦，同時可節(jié)省原精道造影等相關(guān)檢測所需的大量的檢測費用；靈敏度高，可達分子水平，并且簡單易行和快速，具有重要的應用前景和實用價值。
文檔編號G01N33/543GK101435820SQ20081023457
公開日2009年5月20日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者劉邊疆, 煒 張, 王增軍, 蘇仕峰 申請人:江蘇省人民醫(yī)院