專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶
活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免疫抑制法和化學(xué)分光光度法。熒光法是以e-苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化酶，其依據(jù)是e-苯乙胺在10 lOOmg時(shí)反應(yīng)速度最大，高于芐胺和5-羥色胺的反應(yīng)速度。免疫學(xué)方法則利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng)，測定反應(yīng)后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應(yīng)用較多的單克隆抗體有MA0-A3C9、MA0-A4F10、MA0-A7B10、MA0-A7E10和MA0-B1C2等。
相對(duì)而言，化學(xué)分光光度法應(yīng)有更為普遍?？梢杂脝伟费趸复呋奉愥尫懦龅倪^氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)等發(fā)色劑進(jìn)行測定，也可以應(yīng)用芐胺(Benzylamine)、對(duì)苯甲胺-l3-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine) 、 |3 -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyr咖ine，又稱"3-對(duì)羥基苯乙胺，，，3-pa:rahdroxyphenylethyl咖ine) 、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine)等作為反應(yīng)底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應(yīng)用苯甲胺類型底物測得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物測得的活性約為3-對(duì)羥基苯乙胺作底物的30%。目前，單胺氧化酶測定多用芐胺和對(duì)苯甲胺-e-偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛，然后在強(qiáng)堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng)，生成醛苯腙，這在生化儀上測定較困難；對(duì)苯甲胺-P _偶氮萘酚方法則需要用環(huán)乙烷提取，限制了該方法的實(shí)用性，且不能應(yīng)用全自動(dòng)生化儀分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用酶倍增法(EnzymaticDoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定單胺氧化酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的單胺氧化酶診斷試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行單胺氧化酶活性濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法如下 胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫
氨+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氡酶丙氨酸+水+輔酶
過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水
這種方法應(yīng)用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase ;EC 1. 4. 3. 4 ;EC 1. 4. 3. 6)酶 (偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 1) 、 NADH過氧化物酶(NADH peroxidase ;EC 1. 11. 1. 1 ;EC 1. 11. 1. 2)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。單胺氧化酶酶解胺類化合 物反應(yīng)產(chǎn)生氨及過氧化氫，再分別通過(偶)聯(lián)合丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶的作用， 最終二次將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)， 從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的 速度，可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷/測定試劑較為理想 緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L 丙氨酸脫氫酶 10000U/L NADH過氧化物酶 10000U/L 胺類化合物 12mmol/L 丙酮酸 15mmol/L 本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以
下物質(zhì)之一 芐胺、對(duì)苯甲胺_ P _偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、P _苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺
或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。 本發(fā)明的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、丙酮 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、NADH過氧化物酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶。
還原型輔酶、丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、丙酮酸在試劑1、試劑 2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定單胺氧化酶活性濃度的方法，其還原型輔 酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷_鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 丙氨酸脫氫酶 10000U/L
NADH過氧化物酶 10000U/L
節(jié)胺 12mmol/L
丙酮酸 15mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1/25， 反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右，理論K 值-4180。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實(shí)施例二 本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷_鹽酸緩沖液100mmol/L
50mmol/L 0. 25,1/L 12mmol/L 15mmol/L 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 節(jié)胺 丙酮酸 試劑2 穩(wěn)定劑 丙氨酸脫氫酶 NADH過氧化物酶
鹽酸緩沖液lOOmmol/L 500,1/L 10000U/L 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
5
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右， 理論K值-2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液10Ommol/L
50mmol/L 0. 25,1/L 12mmol/L 15mmol/L















穩(wěn)定劑 還原型輔酶 芐胺 丙酮酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
NADH過氧化物酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 10000U/L
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定單胺氧化酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間 10分鐘，起始吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品 與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí) 間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右，理論K值-2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直 線下降；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)600U/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏 差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑的靈敏度可 達(dá)0. 0005±0. 0003 AA/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈 敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法如下胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫氨+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶丙氨酸+水+輔酶過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出單胺氧化酶的活性濃度大小結(jié)果。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 20-500mmol/L穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L還原型輔酶 0. 1-0. 35mmol/L丙氨酸脫氫酶 1000——80000U/LNADH過氧化物酶 1000——80000U/L胺類化合物 1——50mmol/L丙酮酸 1-50mmol/L本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對(duì)苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、丙酮酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、丙酮酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶組成。還原型輔酶、丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、丙酮酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、NADH過氧化物酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶、胺類化合物、丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、胺類化合物、丙酮酸、丙氨酸脫氫酶、NADH過氧化物酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/17GK101762480SQ200810235640
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司