專利名稱：氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)及氨基酸的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定氨基酸濃度
的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基酸含量的測(cè)定在醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測(cè)定項(xiàng)目。 現(xiàn)有的測(cè)定方法有色譜法、電化學(xué)法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計(jì)等方法，這 些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備成本較高等缺點(diǎn)。 氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測(cè)定出17種氨基酸(儀器價(jià) 格昂貴，不能普遍使用)，對(duì)于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說，多數(shù)情況下，都是很 多種氨基酸同時(shí)存在，所以需要測(cè)定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只 能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時(shí)尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基 酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能 衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分解加速的疾病，遺傳性疾病所導(dǎo)致的代謝異常 均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測(cè)定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法 簡便、成本低的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用間接酶循環(huán)擴(kuò)增法 (IndirectlyEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method) 及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔 酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測(cè)定氨基酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用 以實(shí)現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀 或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行氨基酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得 到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明氨基酸濃度測(cè)定方法如下 氨基酸+水+氧氨某酸氧化酶氧代酸+氧+過氧化氫
氨+丙酮酸+過氧化氫甘氨酸氧化酶丙氨酸+水+氫
丙氨酸+水+輔酶丙氨酸脫氡酶氨+丙酮酸+還原型輔酶
這種方法應(yīng)用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC 1.4.3.3)酶(偶)聯(lián)甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ;EC 1. 4. 3. 19)、丙氨酸脫氫酶 (alaninedehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 1)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。氨基酸氧化酶及甘氨酸氧化 酶都作為作用酶，功能為將氨基酸酶解產(chǎn)生氨后，再產(chǎn)生丙氨酸。丙氨酸脫氫酶作為循環(huán) 酶丙氨酸脫氫酶的酶促作用使丙氨酸再次變回氨，使氨不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。丙氨酸脫
3氫酶作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有 吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測(cè)量340nm處吸光 度上升的速度，可以測(cè)算出氨基酸的濃度。如果反應(yīng)的成分用胺鹽取代過氧化氫，反應(yīng)仍然 可以進(jìn)行，但不會(huì)發(fā)生循環(huán)擴(kuò)增效果。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)較為理想 緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 氨基酸氧化酶 10000U/L 甘氨酸氧化酶 12000U/L 丙氨酸脫氫酶 12000U/L 丙酮酸 15mmol/L 過氧化氫 12mmol/L 本發(fā)明的氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸、過氧 化氫。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸、過氧化氫。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。 輔酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸、過氧化氫在試劑1或 試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸、過氧化氫。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶。 輔酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸、過氧化氫在試劑1、試 劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定氨基酸濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括 [OO42]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3mmol/L
氨基酸氧化酶 10000U/L
甘氨酸氧化酶 12000U/L
丙氨酸脫氫酶 12000U/L
丙酮酸 15mmol/L
過氧化氫 12mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)
試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向
為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出氨基酸的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
丙酮酸 15mmol/L
過氧化氫 12mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 氨基酸氧化酶 10000U/L 甘氨酸氧化酶 12000U/L 丙氨酸脫氫酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. 1，
測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
5主波長340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出氨基酸的濃度大小
實(shí)施例三
本實(shí)施例的氨基酸診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/l 丙酮酸 15mmol/L 過氧化氫 12mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑
甘氨酸氧化酶
















IOO,I, 500,1/L 12000U/L 12000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
鹽酸緩沖液
1
100,1/ 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定氨基酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起
始吸光度《0. 1，測(cè)試主波長340nm，測(cè)試副波長405nm，被測(cè)氨基酸樣品與試劑1、試劑2、試 劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右， 檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出氨基酸的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)40mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確 度，其相對(duì)偏差不超過±4% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 08±0. 04 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā) 明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法氨基酸的濃度測(cè)定方法，其方法如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫氨+丙酮酸+過氧化氫甘氨酸氧化酶丙氨酸+水+氧丙氨酸+水+輔酶丙氨酸脫氫酶氨+丙酮酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出氨基酸的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種氨基酸診斷/領(lǐng)U定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液20———500,1/L穩(wěn)定劑1——-4000mmol/L輔酶1——6mmol/L氨基酸氧化酶1000-—80000U/L甘氨酸氧化酶1000-—80000U/L丙氨酸脫氫酶1000-—80000U/L丙酮酸1——50mmol/L過氧化氫1——50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。成分中的過氧化氫可以用胺鹽取代，如此一來，反應(yīng)不會(huì)發(fā)生循環(huán)擴(kuò)增作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸、過氧化氫組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸、過氧化氫組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸、過氧化氫組成；試劑2，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成。輔酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸 氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸、過氧化氫在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸、過氧化氫組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸、過氧化氫組成；試劑2，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶組 成。輔酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸、過氧化氫在試劑1、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、丙酮酸、過氧化氫、氨基酸氧化酶、甘氨酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101750324SQ20081023566
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司