專利名稱：肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)及肌酐濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定肌酐濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測(cè)定肌酐主要有化學(xué)測(cè)定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細(xì)管電泳法 等。 化學(xué)測(cè)定法成本低廉，操作簡(jiǎn)便，是目前國(guó)內(nèi)測(cè)定肌酐最常用的方法之一。標(biāo)本中 的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物。此法的缺點(diǎn)是特異性不高，維生 素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢 西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應(yīng)生成紅色。 高效液相層析法(HPLC)，肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽(yáng)離子交換層析柱 可與其他成分很好分離，在234nm測(cè)定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法 不適于大批量臨床標(biāo)本分析，通常作為肌酐測(cè)定的參考方法，用于評(píng)價(jià)市售肌酐測(cè)定的試 劑盒和某些科研目的。檢索發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?0106198. 0、申請(qǐng)日為1990. 12. 18的中國(guó)專利 申請(qǐng)公開了用高效液相色譜直接測(cè)定人尿中假尿嘧啶核苷(簡(jiǎn)稱假尿苷)，再通過分光光 度法同時(shí)測(cè)出肌酐，分別用假尿苷和假尿苷/肌酐作為鼻咽癌和肺癌的標(biāo)志物。(這個(gè)專利 和我們的無關(guān)) 毛細(xì)管電泳法，血清標(biāo)本用高速離心作預(yù)處理，尿液標(biāo)本可用低速離心，除去有形 成分，上清液用膠束動(dòng)電毛細(xì)管電泳分離后測(cè)定235nm處吸光度。本法測(cè)定線性范圍寬，操
作較為簡(jiǎn)便，但需用特殊設(shè)備和進(jìn)行血清標(biāo)本的預(yù)處理，臨床常規(guī)使用困難。 酶學(xué)測(cè)定法主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶
(Creatininase)兩大類。 檢索發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?2139298. 6、申請(qǐng)日為2002. 11. 15的專利申請(qǐng)公開了應(yīng)用 酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測(cè)定試劑。該發(fā)明所指的酶法測(cè)定試劑并不加入測(cè) 定反應(yīng)所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類 似物及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶_底物-NAD 或酶_底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙 酰胺輔酶或其類似物，當(dāng)被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達(dá)到一定的濃度時(shí)，該發(fā) 明所指的酶法試劑就可達(dá)到測(cè)定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、 氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測(cè)試提供一個(gè)內(nèi)源合成 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二 氧化碳試劑等反應(yīng)所需要的底物-還原型煙酰胺輔酶。其缺點(diǎn)之一為，這個(gè)系統(tǒng)在生成反 應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時(shí)，也抵消了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測(cè)試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二
3是，該試劑在正式測(cè)試前必須事先反應(yīng)一段時(shí)間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶， 這樣一來就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果，給測(cè)試帶來很大的不便。 據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?2139298. 6、申請(qǐng)日為2002. 11. 15的專利介紹，該系統(tǒng)由于不斷生成 測(cè)定所需的NADH或NADPH，從而大大提高了試劑的穩(wěn)定性，并大大降低試劑的生產(chǎn)成本。其 實(shí)在試劑中加入NADH或NADra的穩(wěn)定劑已經(jīng)不是困難或增加成本的問題，反而比在試劑中 增加一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)要經(jīng)濟(jì)得多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定肌酐濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn) 該方法的肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行肌酐濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推 廣應(yīng)用。 本發(fā)明肌酐濃度測(cè)定方法如下 肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨 氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶/Ca21亞硝酸+ 6亞鐵細(xì)胞色素c 亞硝酸+3還原型輔酶亞硝酸還原酶氫氧化銨+3輔酶+水這種方法應(yīng)用肌酐脫亞胺酶(creatinine deaminase ;EC 3. 5. 4. 21)酶
(偶)聯(lián)亞硝酸還原酶(nitrite reductase ;EC 1. 7. 2. 2)、另 一 種亞硝酸還原酶
(nitritereductase ;EC 1. 7. 1. 4)酶促反應(yīng)比色法。肌酐脫亞胺酶酶解肌酐反應(yīng)產(chǎn)生氨，
再通過(偶)聯(lián)合二個(gè)不同的亞硝酸還原酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸
收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光
度下降的程度，通過測(cè)量340nm處吸光度下降的程度，可以測(cè)算肌酐的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L還原型輔酶0. 25,1/L肌酐脫亞胺酶6000U/L亞硝酸還原酶8000U/L亞硝酸還原酶10000U/L高鐵細(xì)胞色素c6mmol/L氯化鈣3mmol/L鈣離子是亞硝酸還原酶(EC 1.7.2.2)的激活劑，因此氯化鈣可用其它鈣鹽取代。
本發(fā)明的肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣。
4
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶。 還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在
試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使
用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶。 還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在 試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定肌酐濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的肌酐診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 肌酐脫亞胺酶 6000U/L
亞硝酸還原酶 8000U/L
亞硝酸還原酶 10000U/L
高鐵細(xì)胞色素C 6mmol/L
氯化f丐 3mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢效
主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。 實(shí)施例二













本實(shí)施例的肌酐診斷/; 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
高鐵細(xì)胞色素C
氯化鈣
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
肌酐脫亞胺酶 亞硝酸還原酶 亞硝酸還原酶
J定試劑為雙試劑，包括
鹽酸緩沖液 100mmol/L 50mmol/L 0. 25,1/L 6mmol/L 3mmol/L
鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 500,1/L 6000U/L 8000U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)肌酐樣品與試劑1 、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。
實(shí)施例三 本實(shí)施例的肌酐診斷/ ; 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 高鐵細(xì)胞色素C 氯化牽丐 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑 亞硝酸還原酶 亞硝酸還原酶 試劑3 三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
J定試劑為三試劑，包括
鹽酸緩沖液 lOOmmol/ 50mmol/L 0. 25,1/L 6mmol/L 3mmol/L
鹽酸緩沖液 lOOmmol/ 500,1/L 8000U/L 10000U/L
鹽酸緩沖液 lOOmmol/ 500,1/L
肌酐脫亞胺酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定肌酐濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始
吸光度1. 8±0. 7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)肌酐樣品與試劑1、試劑2、試
劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，
檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下 降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)2mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度， 其相對(duì)偏差不超過±4%;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈 敏度可達(dá)O. 5±0. 2 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏 度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的肌酐濃度測(cè)定方法，其方法如下肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶/Ca2+亞硝酸+6亞鐵細(xì)胞色素c亞硝酸+3還原型輔酶亞硝酸還原酶氫氧化銨+3輔酶+水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，測(cè)算出肌酐的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種肌酐診斷 緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 肌酐脫亞胺酶 亞硝酸還原酶 亞硝酸還原酶 高鐵細(xì)胞色素C 氯化f丐 1-50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。鈣離子是亞硝酸還原酶(EC 1.7.2.2)的激活劑，因此氯化鈣可用其它鈣鹽取 代。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶組成。還原型輔 酶、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 肌酐脫亞胺酶組成。還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素 C、氯化f丐在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定肌酐濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣、肌酐脫亞胺酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度，從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/17GK101762498SQ20081023569
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司