專利名稱：：一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫檢測領(lǐng)域，屬于一種利用主要組織相容性復(fù)合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)—抗原肽五聚體(Pentamer)技術(shù)檢測乙型肝炎病毒(HBV)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的方法。
背景技術(shù)：
：我國是HBV感染的高流行區(qū)，慢性HBV感染與肝硬化、原發(fā)性肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系，但迄今尚無徹底清除乙型肝炎病毒和治愈慢性乙型肝炎(chronicalhepatitisB,CHB)的藥物和方法。造成慢性HBV持續(xù)感染的機制，國內(nèi)外研究公認(rèn)的最重要的因素是機體缺乏多克隆、強有力的抗HBV特異性CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)。HBV感染者產(chǎn)生多克隆特異性的CTL應(yīng)答是清除病毒，尤其是清除肝細(xì)胞內(nèi)病毒最重要的機制。HBV感染后不同個體的免疫學(xué)應(yīng)答模式不同，其臨床轉(zhuǎn)歸也不同(ThioCL，ThomasDL，KarackiP，etal.ComprehensiveanalysisofclassiandclassIIHLAantigensandchronichepatitisBvirusinfection.JVirol,2003，77:2083-12087.),這是宿主的HLA等免疫遺傳背景和HBV自身特性共同作用的結(jié)果。人類MHC首先發(fā)現(xiàn)在白細(xì)胞表面，故稱其為人白細(xì)胞相關(guān)抗原(HLA),編碼HLA的基因群稱為HLA復(fù)合體。HLA是人體最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，有幾十個基因座位，每個基因座位又有幾十個等位基因。它能夠獨特地結(jié)合細(xì)胞內(nèi)多肽并呈遞至細(xì)胞表面，進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞，由此形成T細(xì)胞對抗原肽和MHC分子的雙重識別，其意義是使T細(xì)胞受體(TCR)只能識別自身MHC分子遞呈的抗原，與特異性CTL密切相關(guān)的主要是HLA-A類基因，CTL通過識別HLA-1類分子遞呈的HBV抗原表位識別靶細(xì)胞，HLA-I類基因的型別和HBV抗原的序列特點，共同決定某一宿主的抗原遞呈細(xì)胞將誘導(dǎo)的HBV特異性CTL應(yīng)答類型。不同HLA-1等位型的個體可以有不同的抗原表位，與抗原肽結(jié)合的頻率亦不同。金士正等(金士正，吳國光，藍(lán)欲曉，等.廣東漢族人群人類白細(xì)胞抗原-A,B及DRB1基因多態(tài)性和單倍型分布.廣東醫(yī)學(xué),2006,27:11.)在20012004年8月之間，對3275名廣東漢族登記加入中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者進(jìn)行HLA分型，發(fā)現(xiàn)人群中最常見的HLA-A基因是HLA-All、A2、A24和A33,分布率分別為32.1%、31.9%、14.2%和11.4%。HLA—A2和A24在我國江蘇地區(qū)基因頻率達(dá)分別高達(dá)50.87%和30.56%(梁文飚，薛敏，潘芹芹，等.中華(江蘇)骨髓庫人群HLA-I類抗原的PCR-SSP分型.中國輸血雜志，2005,3:199-201.)。HBV感染肝細(xì)胞后，病毒抗原被蛋白酶裂解成小分子寡肽，并與肝細(xì)胞內(nèi)HLA-I類分子結(jié)合成復(fù)合物，表達(dá)到細(xì)胞表面，成為T細(xì)胞表位。CTL通過表面的CD8+分子與HLA-I類分子產(chǎn)生粘附，并由TCR識別上述的寡肽表位。已有研究顯示特異性CD8+CTL對清除肝細(xì)胞內(nèi)的乙型肝炎病毒發(fā)揮著主要的功能(mainiMK，BoniC，HeeCK,etal.Theroleofvirus-specificCD8+cellsin.liverdamageandviralcontrolduringpersistenthepatitisBvirusinfection.JEXPMed，2000，191:1269-1280.)，然而不同臨床類型的乙型肝炎患者的特異性CTL細(xì)胞免疫應(yīng)答狀況也不相同。在急性自限性乙型肝炎患者體內(nèi)存在多克隆、多特異性CTL，能識別多個抗原靶位，識別范圍廣，應(yīng)答性強，而在慢性HBV感染患者中體內(nèi)常呈現(xiàn)特異性CTL的缺乏，特異性CTL只能識別單一抗原耙位，應(yīng)答范圍窄而弱(WebsterGJM,ReignatS,BertolettiA,etal.IncubationphaseofacutehepatitisBinman:dynamicofcellularimmunemechanisms.Hepatology,2000,32:1117-1124.KakimiK,LaneTE,WielandS,etal.Blockingchemokineresponsivetogamma-2/interferon(IFN)-gammainducibleproteinandmonokineinducedbyIFN-gammaactivityinvivoreducesthepathogeneticbutnottheantiviralpotentialofhepatitisBvirus-specificcytotoxicTlymphocytes.JExpMed,2001;194:1755-1766.SchuurhuisDH,Ioan-FacsinayA,NagelkerkenB,etal.Antigen-antibodyimmunecomplexesimprovedendriticcellstoefficientlyprimespecificCD8+CTLresponseinvivo.JImmunol,2002;168:2240-2246.)。CTL一旦被激活，釋放穿孔素、顆粒酶或者誘導(dǎo)Fas與相應(yīng)配體結(jié)合，引起感染的肝細(xì)胞損傷或凋亡；也可在特異抗原刺激下產(chǎn)生IFN-y，促進(jìn)肝細(xì)胞對MHC的表達(dá)，使肝細(xì)胞對CTL的免疫攻擊敏感。上述機制可以直接殺傷受感染的肝細(xì)胞，或釋放抗病毒的細(xì)胞因子抑制病毒，尤其是在清除肝細(xì)胞內(nèi)HBV共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)中發(fā)揮關(guān)鍵作用(SeegerC,MasonW.HepatitisBvirusbiology.MicrobiolMolBiolRev，2000;64:51-68.)。因此，對HBV特異性CTL的數(shù)量及其功能研究，對探討乙型肝炎的發(fā)病機制和新的治療途徑具有重要的意義。對于HBV感染后的轉(zhuǎn)歸預(yù)測以及如何進(jìn)行臨床干預(yù)和阻斷慢性化一直是臨床治療備受關(guān)注的問題?，F(xiàn)有的干擾素或者核苷類藥物的抗病毒治療都不能有效抑制HBVcccDNA和清除病毒。限制進(jìn)行現(xiàn)有治療方案的優(yōu)化和聯(lián)合免疫治療的"瓶頸"問題是，缺乏對慢性乙型肝炎免疫病理機制的正確的認(rèn)識和有價值的檢測指標(biāo)。鑒于特異性CTL在免疫發(fā)病機制和預(yù)測療效和預(yù)后方面的特殊價值，目前認(rèn)為HBV特異性CTL檢測是解決臨床這一瓶頸的重要手段和措施。由于外周血中抗原特異性CTL的數(shù)量極低，建立特異性強和靈敏度高的CTL檢測方法是近年來的研究熱點。長期以來抗原特異性CTL的檢測是采用51Cr釋放分析法和有限稀釋法等，它們屬于間接檢測抗原特異性CTL功能的方法，尚需要7天以上的體外培養(yǎng)擴增過程，敏感性較低也很難得到與MHC—致的靶細(xì)胞。近年來出現(xiàn)的MHC-肽多聚體可以特異性結(jié)合抗原特異性的T細(xì)胞，能對特異性CD8+的T細(xì)胞進(jìn)行直接計數(shù)。但是外周血單個核細(xì)胞中HBV特異性CTL的數(shù)量低于1%(Sun-LungTsaia,Tzong-HsienLeeb,Rong-NanChien，etal.AmethodtoincreasetetramerstainingefficiencyofCD8+TcellswithMHC-peptidecomplexes:therapeuticapplicationsinmonitoringcytotoxicTlymphocyteactivityduringhepatitisBandCtreatment.JImmunolMethods.2004Febl;285(l):71-87.),且CTL的活化以及生物學(xué)效應(yīng)都嚴(yán)格受MHC-I類分子的限制，用低分辯方法作為篩選HLA基因分型的檢測基礎(chǔ)，對數(shù)量極低的CTL來說極有可能影響其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。MHC—肽五聚體是人工制備的MHC-1肽復(fù)合物，每個五聚體的5個MHC-多肽都能識別并與T細(xì)胞亞群中特異性CTL結(jié)合，與TCR的親和力大大增加，同時標(biāo)記5個熒光分子，由于其高親和力，使此技術(shù)能夠檢測低親和力的T細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀的熒光檢測和分揀，不僅可以定量地測定T細(xì)胞亞群中特異性CTL的頻數(shù)，還可以通過計算特異性CDS陽性細(xì)胞分泌IFN-Y的比例來了解其功能。該技術(shù)簡便、可靠地檢測特異性CTL的數(shù)量和殺傷功能的特性，使其成為研究特異性CTL的免疫功能的重要手段。可溶性-MHC五聚體，相對于以往的四聚體而言，其熒光信號更強，隨C分子與病毒抗原表位之間的結(jié)合更為緊密，采用FACS技術(shù)直接檢測外周血或者肝組織內(nèi)特異性CD8>T細(xì)胞數(shù)量，可以準(zhǔn)確地反應(yīng)體內(nèi)特異性CD8，細(xì)胞的實際情況，而檢測技術(shù)往往是準(zhǔn)確提示患者體內(nèi)特異性CTL的數(shù)量和功能狀態(tài)的基礎(chǔ)Hoffmann等認(rèn)為MHC-PeptideTetramers(MHC-肽四聚體)對TCR的結(jié)合，可以導(dǎo)致T細(xì)胞立體空間變化，從而競爭抗-CD3特異性的結(jié)合(Hoffmann,T.K.,V.S.Donnenberg，U.Friebe-Hoffmann,etal.Competitionofpeptide-MHCclassItetramericcomplexeswithanti-CD3providesevidenceforspecificityofpeptidebindingtotheTCRcomplex.Cytometry.2000.41:321-328.);Galit等發(fā)現(xiàn)CD8抗體可以阻斷MHC-PeptideTetramers(MHC-肽四聚體)與TCR的結(jié)合(GalitDenkberg，CyrilJ.Cohen,andYoramReiter.CriticalRoleforCD8inBindingofMHCTetramerstoTCR:CD8AntibodiesBlockSpecificBindingofHumanTumor-SpecificMHC-PeptideTetramerstoTCR1.TheJournaloflmmunology，2001，167:270~276.)，并比較了CD3單克隆抗體和CD8單克隆抗體的加入次序?qū)μ禺愋运木垠w檢測結(jié)果的影響。因此，目前檢測特異性CTL的方法在特異性、敏感性和穩(wěn)定性都還有待進(jìn)一步提咼。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高檢測的特異性、敏感性和穩(wěn)定性的定量檢測乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法。本發(fā)明是基于Hoffmann以及GalitDenkberg等學(xué)者的設(shè)計思想并加以進(jìn)一步優(yōu)化首先在標(biāo)記試劑的顏色選擇上采用PE標(biāo)記的MHC-Pentamer和APC標(biāo)記的CD8單克隆抗體，在多參數(shù)流式細(xì)胞檢測中，前者為第二熒光通道，后者為第四熒光通道，第二、四通道之間基本沒有熒光補償；再通過調(diào)整設(shè)門策略等思想，即利用CD3設(shè)門來限制目的細(xì)胞只能是T淋巴細(xì)胞，排除了單核細(xì)胞、CD3'CD8+細(xì)胞、死細(xì)胞的干擾，用于設(shè)門的PercpCY5.5標(biāo)記熒光是目前非特異熒光染色最少、與上述兩種顏色之間熒光補償最小、重疊熒光最少的標(biāo)記熒光染料；本發(fā)明是利用PE標(biāo)記的MHC-Pentamer，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的三色標(biāo)記多參數(shù)分析法對HBV特異性CTL進(jìn)行定量檢測，旨在減少或者避免CD3單抗及CD8單抗對人HBV特異性CTL檢測的影響，目的是提高特異性CTL檢測方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。本發(fā)明運用人類白細(xì)胞抗原(humanleucoyteantigen,HLA)-A0201型陽性或HLA-A2402型陽性者抗凝外周血，按次序分別加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的乙型肝炎核心抗原(hepatitisBcoreantigen,HBcAg)18-27MHC-Pentamer或HBcAgll7-125MHC-Pentamer、葉綠素蛋白偶聯(lián)物(PerCPCy5.5)標(biāo)記的小鼠抗人表面抗原分化群3(clusterofdifferentiation,CD3)以及別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的小鼠抗人CD8，完成T細(xì)胞對抗原肽和MHC分子特異性的雙重識別，裂解紅細(xì)胞后運用多參數(shù)流式細(xì)胞分析技術(shù)，采用CD3設(shè)門策略，定量檢測乙型肝炎患者外周血中HBcAgMHC-Pentamer和CD8雙陽性細(xì)胞即乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)頻數(shù)。我們選用在我國漢族人群中具有較高表達(dá)率的HLA-A2和HLA-A24基因亞型，使用高分辯序列特異引物聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對受檢標(biāo)本的HLA等位基因進(jìn)行分析，再用特異性MHC抗原一肽五聚體的方法直接分析外周血中HBV特異性CTL的頻數(shù)，以最大限度地降低因HLA分型中不完全匹配所造成的CTL檢測率偏差的現(xiàn)狀，動態(tài)分析HBV感染患者不同病程中HBV特異性CTL頻數(shù)差異，揭示HBV患者體內(nèi)對特異性CTL在病毒清除中的作用。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法，該方法是用HLA-A0201型或HLA-A2402型陽性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，分別與不同熒光素標(biāo)記的主要組織相容性復(fù)合物一抗原肽五聚體、小鼠抗人CD3單克隆抗體及小鼠抗人CD8單克隆抗體共孵育；孵育次序依次為先將熒光素標(biāo)記的主要組織相容性復(fù)合物一抗原肽五聚體與外周血共孵育適當(dāng)時間，離心，棄去上清，洗滌后再加入熒光素標(biāo)記的小鼠抗人CD3單克隆抗體和小鼠抗人CD8單克隆共孵育適當(dāng)時間，經(jīng)裂解紅細(xì)胞、離心洗滌、固定細(xì)胞后，在流式細(xì)胞儀上利用CD3設(shè)門技術(shù)，定量檢測乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。所述的方法，其中熒光素標(biāo)記采用如下方式主要組織相容性復(fù)合物一抗原肽五聚體采用藻紅蛋白標(biāo)記，小鼠抗人CD3單克隆抗體采用葉綠素蛋白偶聯(lián)物標(biāo)記，小鼠抗人CD8單克隆抗體采用別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記。所述的方法，其中藻紅蛋白為PE，葉綠素蛋白偶聯(lián)物為PerCPCY5.5，藻藍(lán)蛋白為APC。所述的方法，其中采用HLA-A0201型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復(fù)合物一抗原肽五聚體采用HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體；采用HLA-A2402型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復(fù)合物一抗原肽五聚體采用HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體。所述的方法，其中HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體的氨基酸序列為PheLeuProSerAspPhePheProSerVal;HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體的氨基酸序列為GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp。所述的方法，其中共孵育溫度均為22-25'C，孵育時間為20min,避光反應(yīng)。所述的方法，其中洗滌液采用pH為7.2含0.1。/。(w/v)的牛血清白蛋白的PBS。所述的方法，其中設(shè)門是采用以下方式進(jìn)行的根據(jù)流式細(xì)胞儀的前向散射光和側(cè)向散射光雙參數(shù)點圖，設(shè)R1"門"圈出樣本中淋巴細(xì)胞群體，再設(shè)R2"門"圈出R1門中CD3陽性的群體，目的是將檢測細(xì)胞的范圍縮小到T淋巴細(xì)胞，而不是整個的外周血單個核細(xì)胞或所有的淋巴細(xì)胞，用CellQuest軟件定量分析MHC-抗原肽五聚體-PE及CD8—APC雙陽性細(xì)胞的百分率，即為乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的檢測頻數(shù)。所述的方法，其中要求在細(xì)胞固定后的3h-20h之間的時間范圍內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，并獲取30萬個細(xì)胞，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。所述的方法，其中以T淋巴細(xì)胞設(shè)門，計算R2"門"內(nèi)MHC-抗原肽五聚體和CD8雙陽性的細(xì)胞數(shù)，HLA-A0201陽性HBV感染者檢測HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的細(xì)胞為其特異細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞頻數(shù)，HLA-A2402陽性HBV感染者檢測HBcAgI17-125MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的細(xì)胞為其特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞頻數(shù)；特異細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞率(％)=MHC抗原肽五聚體和CD8雙陽性的細(xì)胞數(shù)除以CD8陽性細(xì)胞數(shù)X100Q/c)。(是看CD8中的比例。CD3只是設(shè)門，保證細(xì)胞的相對純度)本發(fā)明的CTL檢測方法，更換不同的MHC-Pentamer時，可以對不同感染性疾病的特異性CTL進(jìn)行檢測，如丙型肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、艾滋病病毒感染等，具有方法學(xué)的通用性。本發(fā)明的CTL檢測方法，除了用于檢測外周血中特異性CTL外，也可對不同組織細(xì)胞中特異性CTL進(jìn)行檢測，具有檢測標(biāo)本的廣泛性。本發(fā)明的CTL檢測方法，還可觀察細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)，如IFN-a、IFN-Y、TNF-a、IL-4等，可以同時完成對特異性CTL的數(shù)量和功能研究。本發(fā)明的術(shù)語解釋如下CTL:細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，其特征是表達(dá)特異性抗原五聚體的殺傷性T淋巴細(xì)胞，即通常所說的MHC-Pentamer/CD8雙陽性細(xì)胞，HBV特異性CTL應(yīng)答是清除病毒，尤其是清除感染肝細(xì)胞內(nèi)病毒最重要的環(huán)節(jié)。HBcAgl8-27MHC-Pentamer或HBcAgll7-125MHC-Pentamer:主要組織相容性復(fù)合物-乙型肝炎核心抗原肽-五聚體，來源屬于商品化的現(xiàn)有技術(shù)。孵育即細(xì)胞與抗體或標(biāo)記試劑的反應(yīng)過程，細(xì)胞需要在一定PH和離子強度的反應(yīng)液中，并維持一定的溫度和時間才能與相應(yīng)的抗體等結(jié)合。洗滌用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)含0.1%的牛清白蛋白(BSA)，500g離心5min,棄去上清，目的是去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片或多余的標(biāo)記抗體及游離的熒光素等。設(shè)門是流式細(xì)胞檢測技術(shù)中的術(shù)語，即根據(jù)細(xì)胞的體積大小和顆粒的多少，或結(jié)合細(xì)胞顏色的標(biāo)記技術(shù)，圈定出待檢標(biāo)本中目的細(xì)胞群的一種方法。本發(fā)明的有益效果.-1.利用流式細(xì)胞儀的分揀體系，運用流式細(xì)胞術(shù)的三色標(biāo)記、多參數(shù)分析法對HBV特異性CTL進(jìn)行定量檢測，采用CD3(T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志)設(shè)門策略，以純化目的細(xì)胞，從而來減少外周血中其它細(xì)胞群體的影響，降低了背景染色，使結(jié)果更可靠，有效地降低了Pentamer非特異性結(jié)合。2.按一定的次序先后加入三種標(biāo)記試劑，從而避免了由于MHC-Pentamer和CD3抗體競爭結(jié)合TCR復(fù)合物的可能，同時避免了CD8抗體可以阻斷MHC-Pentamer與TCR的結(jié)合的現(xiàn)象，該步驟是本技術(shù)的主要特色。3.在標(biāo)記試劑的顏色選擇上采用PE標(biāo)記的MHC-Pentamer、PercpCy5.5標(biāo)記的CD3單克隆抗體和APC標(biāo)記的'CD8單克隆抗體，在多參數(shù)流式細(xì)胞檢測中，前者為第二熒光通道，后者為第四熒光通道，第二、四通道之間基本沒有熒光補償，而用于設(shè)門的PercpCy5.5-CD3與上述兩種顏色之間也是熒光補償最小，重疊熒光最少的標(biāo)記熒光。4.直接應(yīng)用抗凝外周血進(jìn)行HBV特異性CTL檢測，既不需要分離外周血單個核細(xì)胞也不需要體外培養(yǎng)等繁瑣的操作，可以真實地反應(yīng)各型乙型肝炎患者體內(nèi)特異性CTL的動態(tài)變化以及患者體內(nèi)對抗原表位特異性CTL頻率的差異，它不僅能夠靜態(tài)地評價乙型肝炎患者的特異性細(xì)胞免疫功能，而且為開展特異性細(xì)胞免疫治療和抗病毒藥物治療的療效評估和動態(tài)觀察提供了臨床可行的檢測方法，具有取材方便病人痛苦小而易于接受等優(yōu)點。5.應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，不僅可以對HBV特異性CTL的數(shù)量進(jìn)行研究，還可以結(jié)合特異性CTL的功能分析，能夠更深入地揭示特異性CTL與肝臟病理損傷以及HBV清除的機制。6.檢測結(jié)果對臨床的指導(dǎo)作用包括不同HBV感染狀態(tài)或臨床類型病人特異性細(xì)胞免疫功能的檢測指標(biāo)；抗病毒治療或免疫治療后的療效評估及預(yù)后判斷；抗病毒治療或免疫治療后的免疫評估指標(biāo)及臨床轉(zhuǎn)歸的檢測指標(biāo)。本發(fā)明可揭示特異性CTL應(yīng)答與感染轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，建立HBV感染后的轉(zhuǎn)歸評估，供臨床醫(yī)生參考。并可用于探索特異性CTL應(yīng)答與藥物療效之間的關(guān)系，比較慢性乙型肝炎病人不同治療方法對特異性CTL的影響，從而建立乙型病毒性肝炎的治療療效評估。7.本發(fā)明方法不僅避免了CD3單克隆抗體和CD8單克隆抗體競爭抑制MHC-五聚體與TCR的結(jié)合，還使檢測背景清晰，確保了檢測結(jié)果的特異性和敏感性。本發(fā)明在更換特異性MHC-肽五聚體后，可廣泛用于臨床多種病毒感染性疾病的特異性CTL檢測，具有檢測方法的通用性。圖l:HBV特異性CTL設(shè)門策略圖。圖1A:前向散射光和側(cè)向散射光雙參數(shù)點圖，其中Rl門中為淋巴細(xì)胞群體；圖1B:為CD3設(shè)門圖，其中R2門中為T淋巴細(xì)胞；圖1C:為未經(jīng)CD3設(shè)門，圖中細(xì)胞來自于Rl門，其中右上象限即五聚體和CD8雙陽性細(xì)胞中可能含有T淋巴細(xì)胞陰性的其它細(xì)胞；圖1D:采用CD3設(shè)門策略，圖中細(xì)胞來自于R1門和R2門，右上象限即五聚體和CD8雙陽性細(xì)胞即為特異性CTL。圖2:CD3設(shè)門對HBV特異性CTL檢測結(jié)果的影響，患者為一例急性乙型肝炎。圖2A:為未用PerCPCy5,CD3單抗標(biāo)記的CTL檢測結(jié)果；圖2B:為用PerCPCy5.-CD3單抗標(biāo)記后的CTL檢測結(jié)果。圖3:標(biāo)記試劑的加樣次序?qū)BV特異性CTL檢測結(jié)果的影響，患者為同時表達(dá)HLA-A0201和HLA-A2402等位基因的雜合子的急性乙型肝炎。圖3A、圖3B:為同時加入MHC/Pentamer-PE、小鼠抗人CD3-PercpCy5.5及小鼠抗人CD8-APC標(biāo)記后的結(jié)果；圖3C、圖3D:為先加入MHC/Pentamer-PE后同時加小鼠抗人CD3-PercpCy5.5及小鼠抗人CD8-APC的結(jié)果；其中圖3A、圖3C為HBcAg18-27CTL結(jié)果，圖3B、圖3D為HBcAg117-125CTL結(jié)果。具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實施例l:本發(fā)明的檢測過程1.HLA-A2、HLA-A24基因亞型標(biāo)記目的是對乙型肝炎患者進(jìn)行HLA-A2、HLA-A24基因亞型初篩，檢測按說明書要求進(jìn)行方法是在對照管中分別加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的小鼠抗人免疫球蛋白Gl(IgGl)-和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的小鼠抗人IgGl各10iU，試劑均為美國BD公司產(chǎn)品；在檢測管中分別加入小鼠抗人HLA-A2-FITC(試劑為美國BDPharmingen公司產(chǎn)品)10y1和小鼠抗人HLA-A24-PE10u1(試劑為日本MBL公司產(chǎn)品)混勻后22—25'C避光孵育20-30min，以3ml0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)含0.1%的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA),500g離心5min，棄去上清，再以每分鐘1000轉(zhuǎn)速振蕩30秒以重懸細(xì)胞；每管各加入lml紅細(xì)胞裂解液(美國BD公司產(chǎn)品)，充分混勻后22—25'C避光反應(yīng)10-12min，以裂解紅細(xì)胞并保護(hù)及維持白細(xì)胞膜的穩(wěn)定，500g離心5min，棄去上清，再用pH7.2PBS含0.1%的BSA洗滌2次，去除上清。2.FACS分析HLAA2、HLA-A24基因亞型標(biāo)記好的標(biāo)本立即在流式細(xì)胞儀(FluorescenceActivatedCellSorting,FACS)上檢測，用CeIIQuest軟件分析淋巴細(xì)胞表達(dá)HLA-A2和HLA-A24分子的百分?jǐn)?shù)，凡HLA-A2表達(dá)率》50%或者HLA-A24》80%者則認(rèn)為是陽性，選取陽性標(biāo)本進(jìn)一步作HLA-A0201和HLA-A2402等位基因的高分辨分析，初選陰性的HBV感染者作為實施對象的對照組。3.HLA-A0201和HLA-A2402等位基因序列特異引物聚合酶鏈反應(yīng)高分辯方法分析(1)模板DNA抽提試劑購自美國QUIGEN公司小提商品化成套試劑盒，貨號為Cat.No.12143，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，具體為取經(jīng)過HLA流式細(xì)胞術(shù)初篩確認(rèn)的枸櫞酸鈉抗凝全血200u1和20^1蛋白酶K混勻于1.5ml離心管中，再加入AL液200(al，混勻后56'C反應(yīng)10min,加入200jal無水乙醇，再次混勻后將其移入過濾柱子中，6000g離心lmin，棄去收集管；加入AW1液500(il，6000g離心lmin，棄去收集管，加入AW2液500ial，20000g離心3min進(jìn)行過柱；將柱子放入1.5ml離心管中，加入20(V1三蒸水，室溫靜置lmin，6000g離心lmin，收集過柱內(nèi)容，此即為抽提的模板DNA溶液。(2)DNA的濃度測定及純度判定取DNA溶液用三蒸水做適量稀釋，以三蒸水液作空白對照，在紫外分光光度計上讀取A260和A280的光密度值。按下面公式計算濃度DNA濃度Og/ial)-A260X50X稀釋倍數(shù)/1000。DNA純度的判定A260/A280比值在1.7-2.0之間為DNA純度良好，如純度小于1.7或大于2.0則視為蛋白質(zhì)或RNA污染，應(yīng)重新提取DNA。(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增序列特異引物聚合酶鏈反應(yīng)高分辯方法試劑均為美國Invitrogeng公司提供的商品化成套試劑盒(LocusSSPUniTray，Highresolutionkits,貨號為LOT:008Batch:27463),操作嚴(yán)格按廠家以下說明書進(jìn)行其反應(yīng)總體積為23ul，包括正向及反向引物各2(2.5pmol/ul)，熱啟動Taq酶0.5"1(5U/U1)，Taq酶緩沖液(10X)2ul，dNTPs0.5y1(lOmM)'PCR專用zK6ul，模板DNAIO"1，將上述反應(yīng)體系加入96孔中進(jìn)行PCR反應(yīng)，每孔5nl，放入PCR儀中，96'Cl分鐘1個循環(huán)，96'C25秒、70。C50秒、72'C45秒5個循環(huán)，96'C25秒、65。C50秒、72°C45秒21個循環(huán)，96'C25秒、55'C60秒、72°C120秒4個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后PCR反應(yīng)產(chǎn)物在4'C冰箱中保存。(4)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳PCR反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，以確定HLA等位基因，首先制備瓊脂糖凝膠稱取lg瓊脂糖，置于三角瓶中，力Q入50mL0.5XTBE緩沖液，隔水加熱全部融化后，取出搖勻，將冷卻至65'C左右的瓊脂糖凝膠液，小心倒入凝膠制備槽中，使凝膠液緩慢展開，直到在整個制備槽中形成均勻的膠層，室溫下靜置30min,待凝固完全后，輕輕拔出樣品槽模板，取PCR產(chǎn)物10ul分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)，準(zhǔn)備進(jìn)行電泳，樣品進(jìn)膠前電流控制在20mA,樣品進(jìn)膠后電壓控制在60—80V，電流為40—50mA。當(dāng)指示前沿移動至距離膠板1一2cm處，終止電泳，將電泳后的膠板在溴乙錠染色液中染色后，在波長為254nm的紫外燈下，觀察瓊脂糖凝膠中的DNA條帶，DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶者，與標(biāo)準(zhǔn)條帶的電泳圖譜進(jìn)行比對，確認(rèn)為HLA-A0201型或HLA-A2402型陽性結(jié)果的病人作為本發(fā)明檢測的實施對象。4.HBV特異性CTL標(biāo)記在確定患者HLA等位基因為A0201型或HLA-A2402型以后，按以下次序?qū)颖具M(jìn)行CTL的特異性標(biāo)記取HLA等位基因為A0201型患者的新鮮肝素抗凝外周血300ul，加入PE標(biāo)記的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)18-27MHC-PentamerlO(il，其氨基酸序列為PheLeuProSerAspPhePheProSerVal，如為HLA-A2402型陽性患者的抗凝外周血則加入PE標(biāo)記的HBcAg117-125MHC-Pentamer10(il(試劑均為英國Proimmune公司產(chǎn)品)，其氨基酸序列為GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp，混合在流式檢測專用試管中，22-25'C避光孵育20min，500g離心5min，棄去上清，用pH7.2PBS含0.1%的BSA洗滌1次，再加入PerCPCy5.5標(biāo)記的CD3單克隆抗體(美國BD公司產(chǎn)品)20pl和APC標(biāo)記的小鼠抗人CD8單克隆抗體(美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品)20jal，對血液中的T細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記；混勻后22-25'C避光孵育20min,最后加入3ml紅細(xì)胞裂解液(美國BD公司產(chǎn)品)，充分混勻后室溫避光10-12min，(目的是裂解紅細(xì)胞并保護(hù)及維持白細(xì)胞膜的穩(wěn)定)500g離心5min，棄去上清，用pH7.2PBS含0.1%的BSA洗滌2次，目的是徹底去除上清中裂解的紅細(xì)胞碎片及游離的熒光標(biāo)記試劑，在上述標(biāo)記試管中加入1%多聚甲醛500ul,目的是固定標(biāo)記好的白細(xì)胞，防止白細(xì)胞裂解，4'C保存直至FACS檢測。5.HBV特異性CTL定量分析用流式細(xì)胞儀檢測時，根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光雙參數(shù)點圖，按照細(xì)胞大小和顆粒多少，先設(shè)Rl"門"來圈定出淋巴細(xì)胞，再設(shè)R2"門"圈出R1"門"中的CD3陽性群體(目的是將檢測細(xì)胞的范圍縮小到T淋巴細(xì)胞，而非整個的PBMC或所有的淋巴細(xì)胞)，用CellQuest軟件統(tǒng)計分析CD8—APC和MHC-Pentamer—PE雙陽性細(xì)胞的百分率，即為HBV特異性CTL的檢測頻數(shù)，特異細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞率(％)-MHC-Pentamer和CD8雙陽性的細(xì)胞數(shù)除以CD8陽性細(xì)胞數(shù)X100Y。。固定后的細(xì)胞會有一個皺縮的過程，因此，要求在固定后的3h-20h之間的時間范圍內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，由于外周血中特異性CTL的數(shù)量極少，應(yīng)獲取30萬個細(xì)胞以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。(CD8陽性細(xì)胞總數(shù)包括圖的右上象限與右下象限的總和)以下比較實施例采用的檢測方法與步驟除了在比較項目上作相應(yīng)的改變，其余均同實施例1。比較實施例1.FACS檢測時設(shè)門與檢測圖形及結(jié)果的關(guān)系禾IJ用流式細(xì)胞儀前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)雙參數(shù)點圖，根據(jù)細(xì)胞的體積大小和顆粒的多少，設(shè)Rl"門"先圈出標(biāo)本中的淋巴細(xì)胞群體，目的是排除單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片等，再設(shè)R2"門"圈出R1"門"中的CD3陽性細(xì)胞即為T淋巴細(xì)胞，目的是排除B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等，通過CellQuest軟件統(tǒng)計Rl門和R2門中MHC-Pentamer-PE和CD8—APC雙陽性細(xì)胞的百分率，作為HBV特異性CTL陽性細(xì)胞，以此來限定特異性CTL只是來自于T淋巴細(xì)胞，而并非是其它群體細(xì)胞與MHC-Pentamer或單克隆抗體的非特異性結(jié)合，見圖1A-圖1B;在本實施例中，比較了用或不用CD3設(shè)門對特異性CTL檢測結(jié)果的差異，經(jīng)使用優(yōu)化的設(shè)門策略后，去除了T淋巴細(xì)胞以外可能與Pentamer結(jié)合的其它細(xì)胞，明顯提高檢測頻數(shù)的特異性，見圖1C-圖1D。比較實施例2.不加CD3單抗對結(jié)果的影響目前國內(nèi)外學(xué)者通常使用同時標(biāo)記MHC-Pentamer和小鼠抗人CD8兩種試劑來檢測特異性CTL，并沒有注意到非CD3陽性細(xì)胞與MHC-Pentamer的結(jié)合對檢測結(jié)果的影響；本實施例中首先比較了加或不加CD3熒光抗體對CTL頻數(shù)的差異，結(jié)合設(shè)門策略，明顯增加了CTL結(jié)合的特異性，見圖2A-圖2B，由圖2A左上象限可見，不經(jīng)CD3染色時，無法采用CD3設(shè)門策略，其Pentamer非特異性染色細(xì)胞多，檢測背景較深，經(jīng)CD3設(shè)門后的圖2B左上象限情況則明顯改善其非特異性染色細(xì)胞較少，背景清晰，圖形美觀。比較實施例3.標(biāo)記試劑的加入次序?qū)Y(jié)果的影響由于特異性CTL在外周血中的含量非常低，相對于其它特異性CTL檢測方法而言，MHC-Pentamer是比較敏感的檢測方法，為避免CD3單克隆抗體或CD8單克隆抗體阻斷MHC-肽五聚體與TCR的結(jié)合，進(jìn)一步觀察加樣次序是否對實驗結(jié)果的特異性和敏感性有影響，在本實施例中我們對同一份標(biāo)本分別按以下不同的加樣次序?qū)υ囼灧椒ㄟM(jìn)行優(yōu)化，其中孵育溫度均為22-25'C，每個步驟的孵育時間為20min,病例數(shù)為6例慢性乙型肝炎患者的血清樣本。(1)先加入小鼠抗人CD3-PercpCy5.5后同時加入MHC/Pentamer-PE和小鼠抗人CD8-APC;(2)先加入小鼠抗人CD8-APC后同時加入MHC/Pentamer-PE和小鼠抗人CD3-PercpCy5.5;(3)先加入MHC/Pentamer-PE后同時加入小鼠抗人CD3-PercpCy5.5和小鼠抗人CD8-APC:(4)先加入小鼠抗人CD3-PercpCy5.5和小鼠抗人CD8-APC后加入MHC/Pentamer-PE;(5)同時加入MHC/Pentamer-PE、小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5和小鼠抗人CD8-APC。加樣次序?qū)μ禺愋訡TL結(jié)果的影響歸納為通過對熒光素標(biāo)記的HBcAg18-27MHC-Pentamer、CD3單抗和CD8單抗按照不同的加樣次序進(jìn)行組合，其特異性CTL檢測頻數(shù)見附表1，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對表中CTL頻數(shù)分析發(fā)現(xiàn)加樣次序?qū)TL檢測結(jié)果有明顯影響，其中先加APC-CD8組CTL頻數(shù)0.050±0.0405依次低于先加CD3-PerCPCy5.5組0.082±0.062和先加MHC-Pentamer組0.345±0.092;分別將該2組與先加入MHC-Pentamer組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為,=-7.567,尸=禱/，W.肌尸-O，),上述結(jié)果提示CD3單抗和CD8單抗都可以抑制MHC-Pentamer與TCR的結(jié)合，其中以CD8單抗對MHC-Pentamer的競爭抑制作用更明顯，從而使特異性CTL頻數(shù)明顯下降；同時加入MHC-Pentamer-PE、小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5及小鼠抗人CD8—APC組其CTL頻數(shù)0.203±0.045低于先加入MHC-Pentamer-PE后同時加入小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5及小鼠抗人CD8-APC組0.305±0.084,同樣具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=2.892，P=0.034)，再次證實CD3單抗和CD8單抗對MHC-Pentamer的抑制作用；因此，我們采用先加入PE標(biāo)記的MHC-Pentamer與檢測樣品共孵育20min后，再加入小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5和小鼠抗人CD8-APC孵育20min的標(biāo)記方法，作為臨床檢測HBV特異性CTL的使用方案。部分結(jié)果見圖3。表1:加樣次序?qū)BV特異性CTL的影響(6例慢性乙型肝炎的血清樣本)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>比較實施例4.不同MHC-肽Pentamer復(fù)合物對實驗要求的差異本發(fā)明顯示，不同HLA等位基因患者的外周血，對HBV特異性CTL檢測條件相似，它們同樣受到標(biāo)記試劑的加樣次序以及CD3設(shè)門的影響，圖3顯示的是同時表達(dá)HLA-A0201和HLA-A2402雜合子的一例急性乙型肝炎患者外周血，其標(biāo)記試劑的加樣次序和設(shè)門策略對HBV特異性CTL檢測結(jié)果影響的實例。比較實施例5.不同的HLA基因亞型及HBV感染與否樣本的比較實驗除HLA基因型陰性的樣本分別采用PE標(biāo)記的HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體及PE標(biāo)記的HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體檢測外，其他樣本操作方法同實施例1,結(jié)果見表2。由表2可見(1)在HLA基因亞型的比較實驗中，我們設(shè)立了三組檢測對照即HLA-A0201或HLA-A2402陽性的健康人(無HBV感染)、HLA-A2或HLA-A24陰性的健康人和HLA-A2或HLA-A24陰性的乙型肝炎患者(包括急性或者慢性)，上述三組對照樣本都檢測不到這2個表位的CTL。經(jīng)SPSS11.0統(tǒng)計軟件將上述樣本結(jié)果與HLA分型對應(yīng)的急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎患者的結(jié)果比較分析，P值均大于0.05;說明不同MHC的HBV特異性CTL沒有交叉，表明我們所建立的MHC-抗原肽五聚體的檢測方法具有很好的特異性。(2)HLA-A0201或HLA-A2402陽性的急性乙型肝炎患者，相對應(yīng)的特異性CTL均為高表達(dá)，說明急性乙型肝炎患者體內(nèi)較高的特異性CTL,有利于病毒的及時清除。(3)HLA-A0201或HLA-A2402陽性的慢性乙型肝炎患者體內(nèi)特異性CTL頻數(shù)明顯低于急性乙型肝炎，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(兩者分別為t=3.279,P=0.008和t=-3.405，P-0.027(前者表示A0201，后者為A2402),這種特異性CTL的低下，可能是造成病毒持續(xù)感染的重要原因之表2.不同類型樣本HBV特異性CTL檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表中第l，2，3，4各組之間相比P值均大于0.05;第7，8，9，IO各組之間相比P值均大于0.05，均未見統(tǒng)計學(xué)差異。其它沒有統(tǒng)計意義數(shù)值是1組和2組比1=-2.569,P=0.062，1組和3組比t=-1.24，P=0.283，1組和4組比t=-0.749，P=0.495，2組和3組比t=0.877，P=0.43;7組和8組比t=-2.419，P=0.075，7組和9組比t=-1.668,P-0.171,7組和10組比t;1.270，P=0.245，8組和9組比t=1.367，P=0.243。序列表〈110〉南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院〈120〉一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法<160>2<210〉1〈211〉10〈212〉PRT<213>HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體<400>PheLeuProSerAspPhePheProSerVal1510<210>1<211>9〈212〉PRT<213>HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體<400>GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp1權(quán)利要求1.一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法，其特征在于，用HLA-A0201型或HLA-A2402型陽性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，分別與不同熒光素標(biāo)記的主要組織相容性復(fù)合物—抗原肽五聚體、小鼠抗人CD3單克隆抗體及小鼠抗人CD8單克隆抗體共孵育；孵育次序依次為先將熒光素標(biāo)記的主要組織相容性復(fù)合物—抗原肽五聚體與外周血共孵育適當(dāng)時間，離心，棄去上清，洗滌后再加入熒光素標(biāo)記的小鼠抗人CD3單克隆抗體和小鼠抗人CD8單克隆共孵育適當(dāng)時間，經(jīng)裂解紅細(xì)胞、離心洗滌、固定細(xì)胞后，在流式細(xì)胞儀上利用CD3設(shè)門技術(shù)，定量檢測乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中熒光素標(biāo)記采用如下方式主要組織相容性復(fù)合物一抗原肽五聚體采用藻紅蛋白標(biāo)記，小鼠抗人CD3單克隆抗體采用葉綠素蛋白偶聯(lián)物標(biāo)記，小鼠抗人CD8單克隆抗體采用別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于藻紅蛋白為PE，葉綠素蛋白偶聯(lián)物為PerCPCY5.5,藻藍(lán)蛋白為APC。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用HLA-A0201型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復(fù)合物一抗原肽五聚體采用HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體；采用HLA-A2402型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復(fù)合物一抗原肽五聚體采用HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體的氨基酸序列為PheLeuProSerAspPhePheProSerVal;HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體的氨基酸序列為GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于共孵育溫度均為22-25'C，孵育時間為20min，避光反應(yīng)。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于洗滌液采用pH為7.2含0."/。(w/v)的牛血清白蛋白的PBS。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于設(shè)門是采用以下方式進(jìn)行的根據(jù)流式細(xì)胞儀的前向散射光和側(cè)向散射光雙參數(shù)點圖，設(shè)R1"門"圈出樣本中淋巴細(xì)胞群體，再設(shè)R2"門"圈出RI門中CD3陽性的群體，目的是將檢測細(xì)胞的范圍縮小到T淋巴細(xì)胞，而不是整個的外周血單個核細(xì)胞或所有的淋巴細(xì)胞，用CellQuest軟件定量分析MHC-抗原肽五聚體-PE及CD8一APC雙陽性細(xì)胞的百分率，即為乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的檢測頻數(shù)。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于要求在細(xì)胞固定后的3h-20h之間的時間范圍內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，并獲取30萬個細(xì)胞，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。10、根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于以T淋巴細(xì)胞設(shè)門，計算R2"門"內(nèi)MHC-抗原肽五聚體和CD8雙陽性的細(xì)胞數(shù)，HLA-A0201陽性HBV感染者檢測HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的細(xì)胞為其特異細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞頻數(shù)，HLA-A2402陽性HBV感染者檢測HBcAgl17-125MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的細(xì)胞為其特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞頻數(shù)；特異細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞率(％)=MHC抗原肽五聚體和CD8雙陽性的細(xì)胞數(shù)除以CD8陽性細(xì)胞數(shù)X100°/。。全文摘要本發(fā)明屬于免疫檢測領(lǐng)域，公開了一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法。該方法用HLA-A0201型或HLA-A2402型陽性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，按一定順序分別與不同熒光素標(biāo)記的主要組織相容性復(fù)合物—抗原肽五聚體、小鼠抗人CD3單克隆抗體及小鼠抗人CD8單克隆抗體共孵育適當(dāng)時間，經(jīng)裂解紅細(xì)胞、離心洗滌、固定細(xì)胞后，在流式細(xì)胞儀上利用CD3設(shè)門技術(shù)，定量檢測乙型肝炎病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明能提高檢測特異性CTL的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。文檔編號G01N33/576GK101424692SQ20081024372公開日2009年5月6日申請日期2008年12月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日發(fā)明者萬玉峰,源劉,山盧,周東輝,孔練花,軍李,邢益平,韓亞萍,黃祖瑚申請人:南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院