專利名稱：肌酐診斷試劑(盒)及肌酐濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種肌酐診斷試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定肌酐濃度的方法，屬
于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
測定肌酐主要有化學測定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細管電泳法 等。 化學測定法成本低廉，操作簡便，是目前國內(nèi)測定肌酐最常用的方法之一。標本中 的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復合物。此法的缺點是特異性不高，維生 素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢 西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應生成紅色。 高效液相層析法(HPLC)，肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽離子交換層析柱 可與其他成分很好分離，在234nm測定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法 不適于大批量臨床標本分析，通常作為肌酐測定的參考方法，用于評價市售肌酐測定的試 劑盒和某些科研目的。檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?0106198. 0、申請日為1990. 12. 18的中國專利 申請公開了用高效液相色譜直接測定人尿中假尿嘧啶核苷(簡稱假尿苷)，再通過分光光 度法同時測出肌酐，分別用假尿苷和假尿苷/肌酐作為鼻咽癌和肺癌的標志物。(這個專利 和我們的無關) 毛細管電泳法，血清標本用高速離心作預處理，尿液標本可用低速離心，除去有形 成分，上清液用膠束動電毛細管電泳分離后測定235nm處吸光度。本法測定線性范圍寬，操
作較為簡便，但需用特殊設備和進行血清標本的預處理，臨床常規(guī)使用困難。 酶學測定法主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶
(Creatininase)兩大類。 檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?2139298. 6、申請日為2002. 11. 15的專利申請公開了應用 酶反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測定試劑。該發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測 定反應所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類 似物及其相應的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶_底物-NAD 或酶_底物-NADP等慢反應系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙 酰胺輔酶或其類似物，當被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時，該發(fā) 明所指的酶法試劑就可達到測定樣本中丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、尿素、 氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點在于為丙氨酸氨基轉移酶試劑、天門冬氨酸氨 基轉移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測試提供一個內(nèi)源合成 丙氨酸氨基轉移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二 氧化碳試劑等反應所需要的底物-還原型煙酰胺輔酶。其缺點之一為，這個系統(tǒng)在生成反 應所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時，也抵消了部分丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基 轉移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測試的準確性大大降低。其缺點之二是，該試劑在正式測試前必須事先反應一段時間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶， 這樣一來就造成了緩不濟急的結果，給測試帶來很大的不便。 據(jù)申請?zhí)枮?2139298. 6、申請日為2002. 11. 15的專利介紹，該系統(tǒng)由于不斷生成 測定所需的NADH或NADPH，從而大大提高了試劑的穩(wěn)定性，并大大降低試劑的生產(chǎn)成本。其 實在試劑中加入NADH或NADra的穩(wěn)定劑已經(jīng)不是困難或增加成本的問題，反而比在試劑中 增加一個反應系統(tǒng)要經(jīng)濟得多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出 一 種利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶 (還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定肌酐濃度的方法，同時，本發(fā)明還將 給出用以實現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動生化分析儀上進行肌酐濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切 實的推廣應用。 本發(fā)明肌酐濃度測定方法如下 肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨 氨+ (吲哚-3-基)丙酮酸+還原型輔酶色胺酸脫氡酶/Ca2+ 色胺酸+輔酶 這種方法應用肌酐脫亞胺酶(creatinine deaminase ;EC 3. 5. 4. 21)酶(偶)聯(lián) 色氨酸脫氫酶(Tryptophan dehydrogenase ;EC 1.4. 1. 19)酶促反應比色法。肌酐脫亞胺 酶酶解肌酐反應產(chǎn)生氨，再通過(偶)聯(lián)合色氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算肌酐的濃度大 小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明肌酐診斷試劑(盒)較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L 肌酐脫亞胺酶 6000U/L 色氨酸脫氫酶 8000U/L(卩引哚-3-基)丙酮酸 12mmol/L 氯化f丐 3mmol/L 本發(fā)明的肌酐診斷試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶、(吲哚_3-基)丙酮 酸、氯化鈣。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
4
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定齊U、還原型輔酶、(吲哚_3-基)丙酮酸、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶、(吲哚-3-基)丙酮酸、氯化鈣在試劑 l或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定齊U、還原型輔酶、(吲哚_3-基)丙酮酸、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶。 還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶、(吲哚_3-基)丙酮酸、氯化鈣在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定肌酐濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的肌酐診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 肌酐脫亞胺酶 6000U/L
色氨酸脫氫酶 8000U/L
(噴哚-3-基)丙酮酸 12mmol/L
氯化f丐 3mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向
為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。 實施例二
本實施例的肌酐診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L(卩引哚-3-基)丙酮酸 12mmol/L 氯化鈣 3mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 肌酐脫亞胺酶 6000U/L 色氨酸脫氫酶 8000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐樣品與試劑1 、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。 實施例三 本實施例的肌酐診斷試劑為三試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L(噴哚-3-基)丙酮酸 12mmol/L 氯化鈣 3mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 色氨酸脫氫酶 8000U/L 試劑3 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 肌酐脫亞胺酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定肌酐濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始
吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐樣品與試劑1、試劑2、試
劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，
檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時間反應曲線應呈下 降曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達2mmol/L ;試劑測試的不準確度， 其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈 敏度可達O. 2±0. 1 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏 度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的肌酐濃度測定方法，其方法如下肌酐+水 肌酐脫亞胺酶 N-甲基海因+氨氨+(吲哚-3-基)丙酮酸+還原型輔酶 色胺酸脫氫酶/Ca2+ 色胺酸+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出肌酐的濃度大小測定結果。
2. —種肌酐診斷試劑(盒)，主要成分包括緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑1-4000mmol/L還原型輔酶0.1-0.35mmol/L肌酐脫亞胺酶1000-80000U/L色氨酸脫氫酶1000-80000U/L(吲哚_3-基)丙酮酸1-50mmol/L氯化鈣1-50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。鈣離子是色氨酸脫氫酶的激活劑，因此氯化鈣可用其它鈣鹽取代。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權利要求2所述肌酐診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶、(吲哚_3-基)丙酮酸、 氯化鈣組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述肌酐診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶、(吲哚_3-基)丙酮酸、 氯化鈣組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、(吲哚_3-基)丙酮酸、氯化 鈣組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、肌酐脫 亞胺酶、色氨酸脫氫酶、(吲哚-3-基)丙酮酸、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。
5. 根據(jù)權利要求2所述肌酐診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶、(吲哚_3-基)丙酮酸、 氯化鈣組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、(吲哚_3-基)丙酮酸、氯化 鈣組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞 胺酶組成。還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶、(吲哚-3-基)丙酮酸、氯化鈣在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權利要求2所述肌酐診斷試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmo1/ L或O. 1%_100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的肌酐診斷試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定肌酐濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、(吲哚-3-基)丙酮酸、氯化鈣、肌酐脫亞胺酶、色氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。
文檔編號G01N21/17GK101762506SQ20081024420
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司