專(zhuān)利名稱(chēng)：一種大豆11s球蛋白含量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白含量的方法，具體地說(shuō)，涉及一種ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)定量檢測(cè)大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白含量的方法。
背聚技術(shù)
大豆IIS球蛋白是大豆的主要抗原蛋白，當(dāng)其進(jìn)入幼年動(dòng)物及疾病導(dǎo)致的免疫力低下和遺傳性過(guò)敏體 質(zhì)動(dòng)物體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其主要臨床表現(xiàn)為腹瀉。
大豆脫脂后的產(chǎn)品為豆粕，其粗蛋白含量在46%左右，且約60%為大豆球蛋白。大豆球蛋白由7S球蛋 白和11S球蛋白組成，后者約占全部球蛋白的60%。雖然豆粕是重要的蛋白飼料原料，但是由于其抗原蛋 白的存在，在一定程度上限制了它在幼年動(dòng)物日糧中的添加量。由于不同品種、不同來(lái)源大豆及不同加工 工藝均影響豆粕中抗原蛋白的量，因此不能對(duì)大豆抗原蛋白進(jìn)行有效的定量分析，就不能準(zhǔn)確把握豆粕在 幼年動(dòng)物日糧中的安全添加量。建立準(zhǔn)確、快速、靈敏和方便的大豆抗原檢測(cè)方法，對(duì)有效監(jiān)控豆粕中大 豆抗原蛋白水平，促進(jìn)豆粕在幼年動(dòng)物中的安全使用具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明就是應(yīng)用ELISA(嗨 聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)建立大豆11S球蛋白的準(zhǔn)確、快速、靈敏和方便的定量檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
在分析比較了間接抑制酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大豆球蛋白靈敏度不夠布的不足后，發(fā)明人采用雙抗體夾心酶 聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆IIS球蛋白的含量。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的以等電點(diǎn)沉淀和凝膠層析等方法純化的大豆IIS球蛋內(nèi)為抗原免疫動(dòng)物 獲得抗體，將抗體與辣根過(guò)氣化物酶連接作為酶標(biāo)抗體，再將其用作雙抗體夾心ELISA檢測(cè)大豆、豆粕及
相關(guān)產(chǎn)品中大豆iis球蛋白含量。
本發(fā)明的優(yōu)越性靈敏度高。本發(fā)明的大豆llS球蛋白的檢測(cè)限為2.5ng,而間接抑制酶聯(lián)免疫法檢 測(cè)大豆球蛋白的檢測(cè)限則為16ng，此外，常用的SDS-PAGE方法只能進(jìn)行大豆球蛋白的定性檢測(cè)，不能定 量。


圖1為雙抗體夾心ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。其中，檢測(cè)孔OD值為縱軸，抗原濃度為橫軸。
具體實(shí)施例方式
1) 脫脂大豆粉在緩沖液A中提取得到含大豆球蛋白的溶液，
2) 將溶液pH調(diào)至6. 4得到沉淀1和上清液，
3〉將沉淀1溶解在緩沖液B中，并加固^9R酸銨制得51-66繊酸銨沉淀組分，過(guò)凝膠過(guò)濾柱'得到 純化的大豆球蛋白，
4)用大豆球蛋白免疫動(dòng)物，獲得抗血清， 5)鹽析和凝膠過(guò)濾層析純化抗體，檢測(cè)抗體效價(jià)，
6)將純化抗體與辣根過(guò)氧化物酵連接作為酶標(biāo)抗體，7)用雙抗體夾心嘛聯(lián)免疫法檢測(cè)大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白含量。
本發(fā)明所述的緩沖液A為0.01-0. 03mol/L的Tris-HCl的緩沖液，含10咖ol/L 2-巰基乙醇，p朋.0 。
本發(fā)明所述的緩沖液B為磷酸鹽緩沖液(2.6咖ol/L KH2P0,， 32.5 mmol/L K2HP0J，含0. 4mol/L的 NaCl, 10mmol/L 2-巰基乙酵，pH7.6 。
本發(fā)明所述的凝膠過(guò)濾介質(zhì)為S印harose CL-6 B。
本發(fā)明所述的免疫動(dòng)物為健康雄性新西蘭大白兔。
本發(fā)明所述的純化抗體凝膠介質(zhì)為S印hadex G-200。
本發(fā)明所述的酶標(biāo)法采用過(guò)碘酸鈉改良法標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶。
本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫方法為雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法。
詳細(xì)描述本發(fā)明大豆US球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法的建立過(guò)程和檢測(cè)過(guò)程如下
1) 將脫脂大豆粉與0.01-0.03raol/L, p朋.0的Tris-HC1緩沖液A混合，料水比1: 15-25, 25-37X: 提取l-2小時(shí)。收集上清液l。將上淸液l pH調(diào)至6.4 , 5000rmp離心20min。得到沉淀1。
2) 將沉淀1用磷酸鹽緩沖液B (含0. 4raol/L的NaCl, 10咖ol/L 巰基乙醇，PH7.6 )溶解，加硫 酸銨制得51-66%硫酸銨沉淀組分,離心收集上清過(guò)S印harose CL-6 B，用磷酸鹽緩沖液B(0.26-0. 52,ol/L KftPO,, 3. 25酺ol/L K,HPO。洗脫，收集對(duì)應(yīng)吸收峰的溶液，即純化的大豆11S球蛋A。
3) 將純化的大豆11S球蛋白裝入截留分子量8,000-14,000的透析袋，對(duì)PBS緩沖液透析過(guò)夜。收集 透析液，濃縮，小份分裝。
4) 取上述純化濃縮的11S球蛋白用PBS緩沖液配成200ug/mL的溶液，分別與等量的弗氏完全佐劑 乳化，初次免疫健康雄性新西蘭大白兔，每只大白兔劑紫l-1.5raL，免疫部位為背部皮下。兩周后用以上 蛋白溶液與弗氏不完全佐劑的乳化液加強(qiáng)免疫，免疫劑量為l-1.5mL/只人白兔，免疫部位為背部皮下。再 —周后用以上蛋白溶液再次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為l-1.5mL/只大白兔，免疫部位為腹腔。瓊脂糖雙擴(kuò)成間 接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。效價(jià)合適后心臟采血收集抗血清。
5) 將收集的抗大豆11S球蛋白的抗血清用鹽析和凝膠過(guò)濾層析法純化，再次檢測(cè)效價(jià)后小量分裝。
6) 將純化抗體與辣根過(guò)氧化物,結(jié)合制得酶標(biāo)抗體。
7) 雙抗體夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。其方法是方陣滴定法檢測(cè)血清IgG最佳濃度包被酶標(biāo)板，4 ^C包被過(guò)夜，次日洗板，然后各孔中加入封閉液lOOlil， 28-37 1C孵育30-60min，洗板，然后將大豆11S 球蛋白分別做10000、 5000、 2500、 1250、 625、 312、 156、 78、 39、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625 、 0.312 ng/mL的系列稀釋?zhuān)?00ul依次加入酶標(biāo)板孔中，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，每孔加入最佳稀釋度酶標(biāo)抗體IgG 各100 W,解育1小時(shí)后洗板，每孔加入TMB底物100 W， 37 T顯色10-30 min后，每孔加入50u 1 2 mol/L 的琉酸終止液。然后送入酵標(biāo)儀中在450咖波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔0D值。用以上梯度稀釋的抗原檢測(cè)到的0D 值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以檢測(cè)孔OD值為縱軸，抗原濃度為橫軸。
大豆球蛋白的定量檢測(cè)。按方法7)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)蛋白溶液稀釋到合適濃度后也按方法7)做3 個(gè)重復(fù)后檢測(cè)0D值。根據(jù)待測(cè)蛋白的0D值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中査出蛋白溶液的實(shí)際濃度。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于這種方法檢測(cè)準(zhǔn)確、過(guò)程簡(jiǎn)單、靈敏度極髙，可滿足實(shí)際生產(chǎn)的檢測(cè)需求。
4具體實(shí)施方法
按本發(fā)明大豆US球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法，A體實(shí)施操作步驟如下-
1) 將豆粕粉碎與0. 01-0.03邁ol/L, p朋.0的Tris-HCl緩沖液混合，料水比h 25, 25TC提取2小 時(shí)。收集上清液。將上清液pH調(diào)至6.4 , 5000 rmp離心20 min。得到沉淀1。
2) 將沉淀1用磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L的NaCl, 10酺ol/L 2-巰基乙醇，pH 7. 6)溶解，加 硫酸銨制得51-66繊酸銨沉淀組分，離心收集上清過(guò)S印harose CL-6 B，用磷酸鹽緩沖液(同前)洗脫， 收集對(duì)應(yīng)吸收峰的溶液，即純化的大豆球蛋白(IIS蛋白)。
3) 將純化的大豆球蛋白(IIS蛋白)裝入截留分子量8,000-14,000的透析袋，對(duì)PBS緩沖液透析過(guò) 夜。收集透析液，濃縮，小份分裝，冷凍干燥保存。
4) 取適量大豆球蛋白用PBS緩沖液配成200 Mg/mL的溶液，與等量的弗氏完全佐劑乳化，初次免疫 健康雄性新西蘭大白兔，每只大白兔劑量lraL,免疫部位為背部皮下。兩周后用以上蛋白溶液與弗氏不完 全佐劑的乳化液加強(qiáng)免疫，免疫劑量為1 mL/只大白兔，免疫部位為背部皮下。再一周后用以上蛋白溶液 再次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為l mL/只大白兔，免疫部位為腹腔。瓊脂糖雙擴(kuò)或間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。 效價(jià)合適后心臟采血收集抗血清。
5) 將收集的抗大豆球蛋白的抗血清用鹽析和凝膠過(guò)濾層析法純化，間接ELISA檢測(cè)效價(jià)后小量分裝。
6) 雙抗體夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。其方法是方陣滴定法檢測(cè)血清IgG最佳包被濃度包被酶標(biāo) 板，每孔IOO W, 4 1C包被過(guò)夜，次日洗板，然后各孔中加入封閉液100 W, 28-37匸孵育30~60 min， 洗板，并將大豆球蛋白分別做10000、 5000、 2500、 1250、 625、 312、 156、 78、 39、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.312 ng/mL的系列稀釋?zhuān)?00 W依次加入酶標(biāo)板孔中，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，每孔加入 最佳稀釋度酶標(biāo)抗體IgG各lOO W，孵育l小時(shí)，然后洗板，每孔加入TMB底物lOOlil， 371C顯色15min 后，每孔加入50ul 2mol/L的硫酸終止液。然后送入酶標(biāo)儀中在450咖波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔OD值。用以上 梯度稀釋的抗原檢測(cè)到的OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以檢測(cè)孔OD值為縱軸，抗原濃度為橫軸。
7) 大豆11S球蛋白的定量檢測(cè)。按方法7)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)蛋A溶液稀釋到合適濃度后也按方法 7〉做3個(gè)重復(fù)后檢測(cè)OD值。根據(jù)待測(cè)蛋白的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中汽出蛋白溶液的實(shí)際濃度。
權(quán)利要求
1、大豆11S球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法，在于它使用等電沉淀、鹽析和凝膠過(guò)濾層析純化大豆11S球蛋白作為抗原免疫動(dòng)物獲得抗體，將其用作雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白含量，其具體步驟如下1)脫脂大豆粉在緩沖液A中提取得到含大豆球蛋白的溶液；2)將溶液pH調(diào)至6.4得到沉淀1和上清液；3)將沉淀1溶解在緩沖液B中，并加固體硫酸銨制得51-66％硫酸銨沉淀組分，過(guò)凝膠過(guò)濾柱，得到純化的大豆11S球蛋白；4)用大豆11球蛋白免疫動(dòng)物，獲得抗血清；5)鹽析和凝膠過(guò)濾層析，檢測(cè)抗體效價(jià)；6)將純化抗體與辣根過(guò)氧化物酶連接作為酶標(biāo)抗體；7)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆球蛋白含量。
2、 按權(quán)利要求1所述的大豆11S球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于緩沖液A為0.01-0. 03mol/L的Tris-HCl的緩沖液，含10,ol/L 2-巰基乙醉，p朋.0 。
3、 按權(quán)利要求l所述的大豆US球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于緩沖液B為磷酸鹽緩沖液，含0.4mol/L的NaCl， 10,ol/L 2-巰基乙醉，pH7.6 。
4、 按權(quán)利要求1所述的大豆US球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于凝膠過(guò)濾介質(zhì)為S印harose CL—6 B。
5、 按權(quán)利要求1所述的大豆IIS球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于免疫動(dòng)物為兔。
6、 按權(quán)利要求1所述的大豆球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于純化抗體凝膠介質(zhì)為S印hadex G~200。
7、 按權(quán)利要求1所述的大豆球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于采用過(guò)碘酸鈉改良法標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶。
8、按權(quán)利要求1所述的大豆球蛋白含量的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于酶聯(lián)免疫方法為雙抗體夾心法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定檢測(cè)大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中11S球蛋白含量的ELISA方法。本發(fā)明采用等電點(diǎn)沉淀與凝膠層析純化大豆11S球蛋白作為抗原，并免疫動(dòng)物獲得抗血清，然后提取抗大豆球蛋白抗體與辣根過(guò)氧化物酶連接作為酶標(biāo)抗體，用作雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大豆、豆粕及相關(guān)產(chǎn)品中大豆11S球蛋白的含量。本發(fā)明的優(yōu)越性在于該法檢測(cè)快速、準(zhǔn)確且靈敏度極高。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101482567SQ200810246198
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者宋國(guó)福, 張邦輝, 李呂木, 韓景華 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);安徽天邦飼料科技有限公司;安徽天邦生物技術(shù)有限公司