專利名稱：創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋環(huán)境中創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷弧菌(W^7'ow/my cw)是近海、河口和海灣的海水及沉積物中分布 極廣的海洋細菌，同時在海洋貝類和魚類等生物的體表和體內(nèi)可大量寄生。創(chuàng) 傷弧菌可通過腸道和外傷感染導(dǎo)致人類食物中毒和敗血癥等嚴重疾病，牡蠣等 貝類是創(chuàng)傷弧菌感染的主要媒介，多由于生食受到污染的貝類引起，近年來在 我國沿海地區(qū)發(fā)現(xiàn)由創(chuàng)傷弧菌引起的急性腹瀉和敗血癥的病例逐漸增多，同時 創(chuàng)傷弧菌也是危害我國海水貝類和魚類養(yǎng)殖的主要病原，給相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了嚴 重的經(jīng)濟損失。但目前對海洋環(huán)境中創(chuàng)傷弧菌的定性、定量檢測研究主要是利 用PCR方法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法進行檢測。但在實際應(yīng)用中，PCR 技術(shù)易出現(xiàn)假陽性結(jié)果而利用ELISA法檢測靈敏度一般為105CFU/mL，靈 敏性不夠3'4。因此建立一種靈敏度高而特異性好的方法可提高實際應(yīng)用中對環(huán) 境里創(chuàng)傷弧菌的檢測可信度，對于豐富微生物檢測方法和完善相關(guān)食品衛(wèi)生和 海水水質(zhì)檢測標(biāo)準具有重要意義。
目前對實際環(huán)境中創(chuàng)傷弧菌的檢測研究較少，究其原因，可能存在以下幾個 方面的問題
1. 目前海水水質(zhì)檢測指標(biāo)中微生物主要檢測大腸桿菌菌群，而忽視了創(chuàng)傷弧 菌等其他重要的病原菌，因而一直以來未得到足夠的重視。
2. 在實際應(yīng)用中對于創(chuàng)傷弧菌等病原菌的主要外膜蛋白的定量檢測研究較 少，特別是應(yīng)用靈敏度更高的點酶聯(lián)免疫吸附(dot-ELISA)法進行檢測的報道 很少。
3.目前對創(chuàng)傷弧菌的檢測研究多為實驗室條件下進行的，而對實際應(yīng)用中 方法的靈敏性、可行性等因素考慮不足。
參考文獻
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在建立一種能夠快速檢測創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的方法，通過制 備高效價特異性抗血清和優(yōu)化點-酶聯(lián)免疫吸附(dot-ELISA)方法實現(xiàn)對目標(biāo) 蛋白的檢測其具體方法和步驟為
1. 兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清制備用蒸餾水稀釋體積比為0.5%的福爾馬林4°。 滅活純培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌菌體，離心洗滌后調(diào)整濃度1()SCFU/mL,耳緣靜脈注射雄 性新西蘭大白兔，每周一次，6周后心臟取血，室溫靜置lh， 4。C靜置過夜，4°C 3000 rpm離心15 min，小心分離上清液。為了獲得高效價的抗血清，本發(fā)明中 初次免疫劑量較大，為lxl09CFU/mL，較其他報道的免疫原量高出1個數(shù)量級， 且本發(fā)明中免疫時間長達8周。高劑量抗原，長程免疫，是本發(fā)明較其他免疫 過程的不同之處，保證了高效價抗血清的獲得。經(jīng)檢測創(chuàng)傷弧菌免疫新西蘭大 白兔所得的抗血清效價高達1 : 2048000。與其他菌(副溶血弧菌、溶藻弧菌、 河流弧菌)的交叉反應(yīng)較低，最高僅為L : 640。經(jīng)4"C過夜吸附，離心去除交 叉反應(yīng)菌體后，抗血清效價略有降低，但與其他菌均無交叉反應(yīng)，因此具有高 度專一性。
2. 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白的制備收集TSA (胰胨大豆瓊脂，下同)培養(yǎng)基平板 新鮮培養(yǎng)48h的創(chuàng)傷弧菌菌體，PBS緩沖液洗滌3次，將菌體重懸于2mLPBS 緩沖液中，并在PBS緩沖液中加入終濃度為10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA) 和2mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)， 45。C水浴30min，然后，置于冰浴中，采 用超聲波破碎(功率200 W，超5s，停5s)。 14000 rpm4。C離心15min收集上清， 分裝后-2(TC保存?zhèn)溆谩？偟鞍缀坑肂radford法測定。超聲緩沖液50mMPBS 或者是Tris-HCl buffer, pH 8.0左右。
3. 反應(yīng)中所用緩沖液PBS緩沖液(pH7.4): NaC18g， KCl 0.2g， KH2P04 0.24g， Na2HP04—12 H20 2.9g，蒸餾水定容至1000 ml;
包被液Na2CO30.15g， NaHC03 0.293g，蒸餾水定容至100 ml; 洗滌液(PBST): lOOOmlPBS緩沖液加吐溫-20 (Tween—20) 0.5 ml; 稀釋液PBST加1%牛血清白蛋白(BSA); 封閉液PBS加2X牛血清白蛋白(BSA);
底物溶液DAB(二氨基聯(lián)苯胺，下同)底物溶液(9 mL 0.01M Tris.Cl (pH 7.6), 6 mg DAB, 10 30% H202);
終止液2M濃度的H2S04 ;
二抗購買辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)標(biāo)記的羊抗兔抗血清。
兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清稀釋度為1 : 128000; 二抗稀釋度為1 : 10000。
具體檢測方法為
(1) 將PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜，下同)用鉛筆打出0.5 cmxO.5 cm的小方 格，根據(jù)樣品數(shù)及左右兩側(cè)的空白方格數(shù)用剪刀剪下所需的方格數(shù)。
(2) 用小鑷子除去PVDF膜兩側(cè)的保護層后，將膜放入100%甲醇中浸泡608。 將膜從甲醇中取出后，放到濾紙上，待膜干燥后點樣。
(3) 向每個小方格中點樣制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白1.0 pL。
(4) 待樣品干燥后，將膜放入合適的容器中，加入25 50mL封閉液，于37°C 搖床中，輕微搖動，封閉60min或4'C冰箱中封閉過夜。
(5) 封閉完成后，將處理的PVDF膜用洗滌液搖動洗滌3次，每次3min。
(6) 將制備的兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清用稀釋液稀釋128000倍，將處理的PVDF 膜置于25 50mL的抗血清稀釋液中，于37'C搖床中，輕微搖動，反應(yīng)45 min。
(7) 與兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清反應(yīng)完成后，將反應(yīng)之后的膜用洗滌液搖動洗滌 3次，每次3 min。
(8) 將購買的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗血清用稀釋液稀釋 10000倍，將洗滌后的PVDF膜置于羊抗兔抗體稀釋液中，于37'C臺式搖床中， 輕微搖動，反應(yīng)45min。
(9) 與羊抗兔抗體稀釋液反應(yīng)完成后，將此PVDF膜用洗滌液搖動洗滌3次， 每次3 min。
(10) 將反應(yīng)后的PVDF膜放入DAB顯色液中顯色2 3min。顯色時間不能過長，以免背景顏色過深。
(11)蒸餾水終止顯色反應(yīng)。反應(yīng)后當(dāng)PVDF膜上出現(xiàn)肉眼可見的棕色圓形沉
淀時，即可判斷反應(yīng)結(jié)果為陽性。
本檢測方法，主要是做定性檢測，雖然在加入已知量的陽性對照樣品后也 可以做一般定量檢測，但在需要精確定量檢測時，不建議采用此法。
本發(fā)明適用于實驗室培養(yǎng)樣品或野外樣品處理后的創(chuàng)傷弧菌的快速檢測，
具有以下優(yōu)點
1. 具有極高的靈敏度和專一性。經(jīng)過初步純化抗血清后，應(yīng)用dot-ELISA 法檢測創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的靈敏度為15 ng/mL。
2. 所需試劑配制方便。所有試劑均為常用鹽類，沒有毒性，各種溶液常溫 保存即可。
3. 檢測過程操作簡單。不需要使用復(fù)雜的儀器，反應(yīng)結(jié)果肉眼即可進行判斷。


附圖1為dot-ELISA法檢測創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白掃描顯色圖。 檢測多個創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白樣品，形成棕色沉淀的為陽性結(jié)果。
附圖2為dot-ELISA法對創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的實測掃描顯色圖 檢測不同含量的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白樣品，靈敏度達15ng/mL具體實施方式
實施例1
1. 創(chuàng)傷弧菌抗血清制備用0.5%的福爾馬林4°<:滅活純培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌菌
體，離心洗滌后調(diào)整濃度l()SCFU/mL,耳緣靜脈注射雄性新西蘭大白兔，每周一 次，6周后心臟取血，室溫靜置lh， 4。C靜置過夜，4°C 3000rpm離心15min， 小心分離上清液。經(jīng)檢測創(chuàng)傷弧菌免疫新西蘭大白兔所得的抗血清效價高達1 :2048000。
2. 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白的制備:收集TSA平板新鮮培養(yǎng)48 h的創(chuàng)傷弧菌菌體， PBS緩沖液洗滌3次，將菌體重懸于2 mL PBS緩沖液中(含10 mmol/EDTA和 2mmol/LPMSF)， 45'C水浴30min，然后置于冰浴中，采用超聲波破碎(功率200 W，超5s，停5s)。 14000 rpm4。C離心15 min收集上清，分裝后-20。C保存?zhèn)溆谩?總蛋白含量用Bradford法測定。超聲緩沖液50mMPBS或者是Tris-HCl buffer,pH8.0左右。
3.反應(yīng)中所用緩沖液 PBS緩沖液(pH7.4): NaCl 8g， KCl 0.2g， KH2P04 0'24g， Na2HP04-12 H20 2.9g， 蒸餾水定容至1000 ml;
包被液Na2CO30.15g， NaHC03 0.293g，蒸餾水定容至100 ml; 洗滌液(PBST): 1000 ml PBS緩沖液加Tween-20 0.5 ml; 稀釋液PBST加1%牛血清白蛋白(BSA); 封閉液PBS加2XBSA (牛血清白蛋白，下同)；
底物溶液DAB底物溶液(9 mL 0.01M Tris.Cl (pH 7.6), 6 mg DAB, 10 30%H2O2);
終止液2M濃度的H2S04 ; 二抗HRP標(biāo)記羊抗兔抗體。
創(chuàng)傷弧菌抗血清稀釋度為l : 128000; 二抗稀釋度為l : ioooo
具體檢測方法為
(1) 將PVDF膜用鉛筆打出0.5 cmx0.5 cm的小方格，根據(jù)樣品數(shù)及左右兩 側(cè)的空白方格數(shù)用剪刀剪下所需的方格數(shù)。
(2) 用小鑷子除去PVDF膜兩側(cè)的保護層后，將膜放入100%甲醇中浸泡60s。 將膜從甲醇中取出后，放到濾紙上，待膜干燥后點樣。
(3) 向每個小方格的中心位置點樣l.OpL。
(4) 待樣品干燥后，將膜放入合適的容器中，加入50ml封閉液，于37'C搖床 中，輕微搖動，封閉60min或4。C冰箱中封閉過夜。
(5) 封閉完成后，將處理的PVDF膜用洗滌液搖動洗滌3次，每次3min。
(6) 將制備的兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清用稀釋液稀釋128000倍，將處理的PVDF 膜置于50mL的抗血清稀釋液中，于37。C搖床中，輕微搖動，反應(yīng)45min。
(7) 與兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清反應(yīng)完成后，將反應(yīng)之后的膜用洗滌液搖動洗滌 3次,每次3 min。
(8) 將HRP標(biāo)記的羊抗兔抗血清用稀釋液稀釋5000倍，將洗滌后的PVDF 膜置于羊抗兔抗體稀釋液中，于37"C臺式搖床中，輕微搖動，反應(yīng)45min。
(9) 與羊抗兔抗體稀釋液反應(yīng)完成后，將此PVDF膜用洗滌液搖動洗滌3次， 每次3 min。
(抑將反應(yīng)后的PVDF膜放入DAB顯色液中顯色3 min。(11)蒸餾水終止顯色反應(yīng)。陽性結(jié)果為肉眼可見的棕色圓形沉淀。
實施例2
將培養(yǎng)24 h的創(chuàng)傷弧菌菌液25-50 mL用PBS緩沖液洗滌3次，將菌體重 懸于2 mL PBS緩沖液中，加入終濃度為10 mmol/EDTA (乙二胺四乙酸)和2 mmol/LPMSF (苯甲基磺酰氟)，45"水浴30min，然后，置于冰浴中，采用超 聲波破碎(功率200W，超5s，停5s)。 14000 rpm4。C離心15 min收集上清，分 裝后-20。C保存?zhèn)溆??？偟鞍缀坑肂radford法測定，并將此上清液10倍系列 稀釋后作為陽性對照樣品。然后按照以下步驟進行定量檢測
(1) 將PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜，下同)用鉛筆打出0.5 cmx0.5 cm的小方
格，根據(jù)樣品數(shù)剪下所需的方格數(shù)。
(2) 除去PVDF膜兩側(cè)的保護層后，將膜放入100M甲醇中浸泡60s。將膜從 甲醇中取出后，放到濾紙上，待膜干燥后點樣。
(3) 向每個小方格的中心位置點樣1.0 待檢樣品。
(4) 待樣品干燥后，將膜放入合適的容器中，加入25 50ml封閉液，于37°C 搖床中，輕微搖動，封閉60min或4"C冰箱中封閉過夜。
(5) 封閉完成后，將處理的PVDF膜用洗滌液搖動洗滌3次，每次3min。
(6) 將制備的兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清用稀釋液稀釋128000倍，將處理的PVDF 膜置于25 50mL的抗血清稀釋液中，于37。C搖床中，輕微搖動，反應(yīng)45 min。
(7) 與兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清反應(yīng)完成后，將反應(yīng)之后的膜用洗滌液搖動洗滌 3次，每次3 min。
(8) 將HRP標(biāo)記的羊抗兔抗血清用稀釋液稀釋10000倍，將洗滌后的PVDF 膜置于羊抗兔抗體稀釋液中，于37'C搖床中，輕搖反應(yīng)45min。
(9) 與羊抗兔抗體稀釋液反應(yīng)完成后，將此PVDF膜用洗滌液搖動洗滌3次， 每次3 min。
卿將反應(yīng)后的PVDF膜放入DAB顯色液中顯色2 3 min。 (11)蒸餾水終止顯色反應(yīng)。檢測結(jié)果，檢測靈敏度可達15ng/mL (如附圖2 所示)。同時利用間接ELISA (酶聯(lián)免疫吸附)法檢測創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白， 靈敏度為78ng/mL。由此可見，利用dot-ELISA (點酶聯(lián)免疫吸附)法檢測創(chuàng)傷 弧菌主要外膜蛋白靈敏度明顯提高，因此本方法特別適合檢測含量較低的蛋白 樣品。
9
權(quán)利要求
1. 創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA檢測方法，其特征在于具體檢測方法為(1)將PVDF膜用鉛筆打出0.5cm×0.5cm的小方格，根據(jù)樣品數(shù)及左右兩側(cè)的空白方格數(shù)用剪刀剪下所需的方格數(shù)；(2)除去PVDF膜兩側(cè)的保護層后，將膜放入甲醇中浸泡60s，取出放到濾紙上，待膜干燥后點樣；(3)向每個小方格的中心位置點樣1.0μL；(4)待樣品干燥后，將膜放入容器中，加入25～50ml封閉液，于37℃搖床中，輕微搖動，封閉60min；(5)將處理的PVDF膜用洗滌液搖動洗滌3次，每次3min；(6)將制備的兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清用稀釋液稀釋128000倍，將處理的PVDF膜置于25～50mL的抗血清稀釋液中，于37℃搖床中，輕微搖動，反應(yīng)45min；(7)與兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清反應(yīng)完成后，將反應(yīng)之后的膜用洗滌液搖動洗滌3次，每次3min；(8)將HRP標(biāo)記的羊抗兔抗血清用稀釋液稀釋5000倍，將洗滌后的PVDF膜置于羊抗兔抗體稀釋液中，于37℃臺式搖床中，輕微搖動，反應(yīng)45min；(9)與羊抗兔抗體稀釋液反應(yīng)完成后，將此PVDF膜用洗滌液搖動洗滌3次，每次3min；(10)將反應(yīng)后的PVDF膜放入DAB顯色液中顯色2～3min；(11)蒸餾水終止顯色反應(yīng)。陽性結(jié)果為肉眼可見的棕色圓形沉淀；其中所述兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清為用0.5％的福爾馬林4℃滅活純培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌菌體，離心洗滌后調(diào)整濃度108CFU/mL，耳緣靜脈注射雄性新西蘭大白兔，每周一次，6周后心臟取血，室溫靜置1h，4℃靜置過夜，4℃3000rpm離心15min，小心分離上清液而得，經(jīng)檢測創(chuàng)傷弧菌免疫新西蘭大白兔所得的抗血清效價高達1∶2048000；所述創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白是用以下方法制備收集TSA平板新鮮培養(yǎng)48h的創(chuàng)傷弧菌菌體，PBS緩沖液洗滌3次，將菌體重懸于2mL含10mmol/EDTA和2mmol/L PMSF的PBS緩沖液中，45℃水浴30min，然后置于冰浴中，采用超聲波破碎，14000rpm4℃離心15min收集上清，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?；總蛋白含量用Bradford法測定；超聲緩沖液50mM PBS或者是Tris-HCl buffer，pH8.0左右；所述反應(yīng)中所用緩沖液及其它液體為PBS緩沖液NaCl 8g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，蒸餾水定容至1000ml，pH7.4；包被液Na2CO3 0.15g，NaHCO30.293g，蒸餾水定容至100ml；PBST洗滌液1000ml PBS緩沖液加Tween-200.5ml；稀釋液PBST洗滌液加1％牛血清白蛋白；封閉液PBS加2％BSA；底物溶液DAB底物溶液由9mL pH7.60.01M Tris.Cl，6mg DAB，和10μL30％H2O2組成；終止液2M濃度的H2SO4；二抗羊抗兔IgG—HRP酶標(biāo)抗體；創(chuàng)傷弧菌抗血清稀釋度為1∶128000；二抗稀釋度為1∶10000。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA檢測方法，其 特征在于步驟(4)中，待樣品干燥后，將膜放入容器中，加入25 50ml封閉液， 于37X:搖床屮，輕微搖動，4'C冰箱中封閉過夜。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA檢測方法，其 特征在于所述創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白的制備中所述的采用超聲波破碎為功率200W， 超5 s，停5 s而成。
全文摘要
創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的dot-ELISA檢測方法。將培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌經(jīng)超聲波破碎(功率200W，超5s，停5s)，離心收集上清。在聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上點樣1.0μL，將點樣PVDF膜用2％BSA(牛血清白蛋白)37℃封閉之后，分別與兔抗創(chuàng)傷弧菌抗血清和HRP(辣根過氧化物沒)標(biāo)記的羊抗兔抗血清反應(yīng)，最后與底物溶液反應(yīng)，在PVDF膜上形成肉眼可見的棕黃色圓形沉淀的即為陽性結(jié)果。本方法對創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白的檢測靈敏度可達15ng/mL，比酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法高3-5倍，2-3個小時得出結(jié)果，可保證靈敏快速的檢出海洋環(huán)境中的創(chuàng)傷弧菌。
文檔編號G01N33/543GK101451996SQ20081024693
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者張振冬, 琳 朱, 王淑芬, 王秀娟, 鄒亞男 申請人:張振冬