專利名稱：一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條
一、 技術(shù)領(lǐng)域
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)豬繁殖障礙性病毒傳染病抗體的器具，特別是涉 及一種一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條。
二、 技術(shù)背景
我國(guó)是生豬的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。隨著大中小型規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)、種豬場(chǎng)數(shù)量 的逐年增加，豬繁殖障礙性疾病已成為我國(guó)規(guī)模化豬場(chǎng)最重要的疾病之一，發(fā)病 率平均達(dá)30%以上，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。豬繁殖 與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬 瘟病毒和偽狂犬病毒等是造成豬繁殖障礙的重要病毒。PRRSV引起豬繁殖與呼 吸綜合癥(PRRS)，表現(xiàn)為感染母豬發(fā)熱、厭食，懷孕后期發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木 乃伊胎和弱仔等，感染仔豬發(fā)生呼吸困難(肺炎)、免疫機(jī)能障礙和高死亡率； 因部分病豬的耳朵發(fā)紫，又稱藍(lán)耳病。藍(lán)耳病近年來(lái)在我國(guó)廣為傳播，如2006 年我國(guó)南北10多個(gè)省(市、區(qū))的豬群發(fā)生的"高熱病"現(xiàn)認(rèn)為是高致病性PRRSV 毒株引起的，發(fā)病豬群達(dá)200萬(wàn)頭，死亡40萬(wàn)頭。PPV (代號(hào)P)引起豬細(xì)小病毒 病，主要表現(xiàn)為受感染的母豬，特別是初產(chǎn)母豬及血清學(xué)陰性經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)生流 產(chǎn)、死胎、畸形胎、木乃伊胎和弱仔以及屢配不孕，而其他年齡的豬感染后不 表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。目前豬細(xì)小病毒病在我國(guó)豬群中廣為傳播，在大多數(shù)感 染豬場(chǎng)呈地方性流行并且很難凈化，從而造成了持續(xù)的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了 養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。JEV (代號(hào)J)引起人畜共患病 一 流行性乙型腦炎。豬乙 型腦炎主要表現(xiàn)為感染豬發(fā)熱、厭食，母豬懷孕后期突然發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木 乃伊胎和弱仔等，新生仔豬良莠不齊、死亡率高，感染公豬出現(xiàn)睪丸炎。豬乙 型腦炎主要由帶病毒的蚊蟲(chóng)叮咬而傳播，主要分布在亞洲各國(guó)，我國(guó)大部分地 區(qū)均有本病發(fā)生。
生產(chǎn)中，PPV、 JEV與PRRSV等病毒引起的繁殖障礙性疾病，其臨床癥狀相似，而且經(jīng)?；旌细腥荆瑔螒{臨床病理變化往往不能及時(shí)正確診斷，最后確診 有賴于實(shí)驗(yàn)室檢查，如要檢測(cè)病豬樣品中病原或其特異抗體的存在、甚至用分
離到的病原復(fù)制出臨床病例。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)PPV和JEV抗體的方法有(1)病 毒培養(yǎng)與抗體檢測(cè)取標(biāo)準(zhǔn)病毒接種豬原代或傳代腎細(xì)胞等培養(yǎng)，用酶或熒光 素標(biāo)記二抗檢測(cè)待檢血清中的特異抗體，或直接檢測(cè)待檢血清中的中和抗體；
(2)多數(shù)情況下用血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)PPV或JEV感染豬血清中的特異抗 體，也有人用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)感染豬血清中的特異抗體。 病毒培養(yǎng)與抗體檢測(cè)技術(shù)操作復(fù)雜、需要儀器和較長(zhǎng)的時(shí)間，不適合生產(chǎn)或現(xiàn)
場(chǎng)的快速診斷需要。ELISA和HI比較簡(jiǎn)便、快速，常用來(lái)檢領(lǐng)llJEV和PPV的抗體， 但仍不便于我國(guó)基層或現(xiàn)場(chǎng)普遍推廣應(yīng)用。因?yàn)镋LISA仍需要酶標(biāo)儀和試劑，較 多的操作步驟和經(jīng)驗(yàn)，ffl也需要新鮮的豚鼠或鵝紅血球；這些儀器、試劑在基 層較為缺乏，或者缺乏操作人員和保存條件。為此，有人研究報(bào)道了用斑點(diǎn)免 疫金滲濾法來(lái)檢測(cè)PPV、 JEV及其抗體。這種方法利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛 細(xì)管作用，將抗原一抗體反應(yīng)由ELISA或ffl的傳統(tǒng)液相環(huán)境轉(zhuǎn)到固相濾膜上快速 進(jìn)行，并采用膠體金標(biāo)記代替酶標(biāo)記和紅血球標(biāo)記，憑肉眼直接觀察膠體金的 顯色狀況而判斷結(jié)果。因此，比f(wàn)fl或ELISA更簡(jiǎn)便、快速和實(shí)用。但目前報(bào)道的 斑點(diǎn)免疫金滲濾法一次只能檢測(cè)一種豬病抗體，而且至少需添加兩次試劑和洗 滌兩次才能獲得結(jié)果；其操作仍不夠簡(jiǎn)便，仍不便于非專業(yè)的基層人員使用。 因此，研究一種簡(jiǎn)便而快速、 一步可以檢測(cè)一種或多種豬病病毒抗體的實(shí)時(shí)在 線檢測(cè)器具，非常重要而迫切。 三、實(shí)用新型內(nèi)容-
本實(shí)用新型的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)豬細(xì)小病毒和豬乙型腦炎豬病抗 體存在的缺陷，提供一種特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)豬細(xì)小病毒、 豬乙型腦炎病毒抗體的免疫金標(biāo)試紙條。
本實(shí)用新型采用的技術(shù)方案是
本實(shí)用新型提供一種一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條， 該試紙條含有支撐層、吸附層和保護(hù)層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，保護(hù)層附著在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為樣品吸附纖維 層、吸附金標(biāo)物纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上 設(shè)有檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡；所述吸附金標(biāo)物纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的葡萄球 菌蛋白A即SPA，所述檢測(cè)印跡用純化的豬細(xì)小病毒PPV和豬乙型腦炎病毒JEV 抗原液中的任一種或兩種印制，所述對(duì)照印跡用羊或兔抗SPA的IgG溶液印制； 或者，所述吸附金標(biāo)物纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的純化豬細(xì)小病毒PPV和豬乙 型腦炎病毒JEV抗原液中的任一種或兩種，所述檢測(cè)印跡用純化的PPV和JEV 抗原液中對(duì)應(yīng)的任一種或兩種印制，所述對(duì)照印跡用羊或兔抗PPV和JEV中對(duì) 應(yīng)的任一種或兩種病毒的IgG溶液印制。
所述吸附金標(biāo)物纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的SPA，所述檢測(cè)印跡用純化的 PPV和JEV兩種抗原液印制，所述對(duì)照印跡用羊或兔抗SPA的IgG溶液印制； 或者，所述吸附金標(biāo)物纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的純化PPV和JEV兩種抗原液， 所述檢測(cè)印跡用純化的PPV和JEV兩種抗原液印制，所述對(duì)照印跡用羊或兔抗 PPV和JEV兩種病毒的IgG溶液印制。
所述支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑膠片條或硬紙條制成；所述測(cè)試端樣品吸附 纖維層用玻璃棉、或尼龍纖維、或聚酯纖維制成；所述吸附金標(biāo)物纖維層用玻 璃棉制成。
所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚
偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成；所述吸水材料層用吸水紙制成。
所述檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為直線式、或斜線式、或?qū)嵭膱A點(diǎn)，所述纖維素
膜層上含有一條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)， 一條或個(gè)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為 "I J ，， " = ，， " / / ，， " \ \ ，， — I ，， " I - ，， "+ ，，" 丄，，"t ，，
" "、 " ' "、 "' "中的任一種；纖維素膜層上含有兩條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)， 兩條或個(gè)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為"III "、"三"、"http:///"、 "\
\ \ 7， & 一參爭(zhēng)" "，， " ，， & ^ " " J ，， " I I 一 " " 1 I W
"IT "中的任一種。
在所述測(cè)試端樣品吸附纖維層、吸附金標(biāo)物纖維層及吸水材料層上覆蓋有 保護(hù)膜，在測(cè)試端樣品吸附纖維層與吸附金標(biāo)物纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上
6印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向測(cè)試端樣品吸附纖維層一側(cè)0.5cm處。
注明如果吸附金標(biāo)物纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A即SPA, 則檢測(cè)印跡用純化的PPV和JEV抗原液中的任一種或兩種印制，對(duì)照印跡用羊 或兔抗SPA的IgG溶液印制；如果吸附金標(biāo)物纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的純化 豬細(xì)小病毒PPV和豬乙型腦炎病毒JEV抗原液中的任一種或兩種，則檢測(cè)印跡 用純化的PPV和JEV抗原液中對(duì)應(yīng)的任一種或兩種印制，對(duì)照印跡用羊或兔抗 PPV和JEV中對(duì)應(yīng)的任一種或兩種病毒的IgG溶液印制。 本實(shí)用新型的積極有益效果
1、 檢測(cè)特異性強(qiáng)、敏感性高本實(shí)用新型快速檢測(cè)試紙條以膠體金標(biāo)記兩 種純化的豬病病毒(Wi)或SPA為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗原或SPA中的金顆粒 與抗原或SPA分子之間無(wú)共價(jià)鍵形成，二者通過(guò)異性電荷間的范德華力相結(jié)合， 膠體金對(duì)PPV和JEV這兩種純化豬病病毒(Wi)的特異性影響很小，也不影響 SPA與抗體的結(jié)合及抗體與抗原的結(jié)合，且具有較高的標(biāo)記率。因此，本實(shí)用 新型快速檢測(cè)試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測(cè)到2納克相應(yīng)的抗體 蛋白。
2、 操作簡(jiǎn)便、快速使用本實(shí)用新型試紙條檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需附加任何其它 儀器和試劑，只要將其測(cè)試端插入待檢血清中30秒左右，然后在5分鐘左右即 可判定檢測(cè)結(jié)果。
3、 檢測(cè)結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確本實(shí)用新型檢測(cè)試紙條以顯示棕紅色的檢測(cè) 印跡和對(duì)照印跡作為檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜層上只顯示一條
(個(gè))棕紅色對(duì)照印跡7，表示這兩種豬病抗體在被檢血清中均未檢出；在纖維 素膜層上顯示一條(個(gè))棕紅色對(duì)照印跡7和兩條(個(gè))棕紅色檢測(cè)印跡6-P 和6-J，則表示在被檢血清中檢出這兩種豬病的抗體；在纖維素膜層上顯示一條
(個(gè))棕紅色對(duì)照印跡7和兩條(個(gè))棕紅色檢測(cè)印跡6-P和6-J中的任一種， 則表示在被檢血清中檢出這兩種豬病抗體相對(duì)應(yīng)中的一種，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性； 結(jié)果判定直觀、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性誤判。
4、 減少投資和降低檢測(cè)成本使用本實(shí)用新型快速檢測(cè)試紙條，不需要另 配其它儀器、設(shè)備和試劑，節(jié)省大量?jī)x器、設(shè)備和附加試劑費(fèi)用； 一條試紙一次可以檢測(cè)一種或兩種豬病抗體，而且專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時(shí)隨地進(jìn)行實(shí) 時(shí)在線檢測(cè)，無(wú)需支付專家診斷檢查費(fèi)及其相關(guān)費(fèi)用。因此，可以節(jié)省檢測(cè)成 本，降低檢測(cè)費(fèi)用。
5、應(yīng)用范圍廣、便于推廣使用本實(shí)用新型快速檢測(cè)試紙條操作簡(jiǎn)單成"一 步式"或"傻瓜式"，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包 括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個(gè) 體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。


圖1一種一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體試紙條的側(cè)視結(jié)構(gòu)
示意圖。
圖2 —種一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體試紙條的俯視結(jié)構(gòu)
圖3 —種一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體試紙條的俯視結(jié)構(gòu)
圖4 一種一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體試紙條的俯視結(jié)構(gòu)
示意圖。
五具體實(shí)施方式
要制備一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，需先制備純
化的PPV (代號(hào)P)和JEV (代號(hào)J)，抗PPV和JEV的抗體IgG，以及抗SPA 的抗體IgG，用于制備吸附金標(biāo)物纖維層、檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡。 1、羊抗或兔抗SPA的IgG的制備
以50ug 100ug SPA/kg體重經(jīng)皮下和肌肉注射陰性健康羊或家兔3 4 次，末次免疫20天后靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1: 2000以上， 心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集其高免血清。取1份血清加2份PBS液(pH7.2) 混勻，加等體積飽和硫酸銨液混勻，置4。C冰箱內(nèi)2h，在4。C、 10000r/min離心 15min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其最終 濃度為33%，置4。C冰箱內(nèi)2h,在4。C、 10000r/min條件下離心15min，棄上清 液，以少量PBS液(pH7,2)溶解沉淀，置4°。冰箱內(nèi)用？88液^117.2)過(guò)夜透析，換液2 3次，在4。C、 10000r/min條件下離心15min，收集上清液，以紫外分 光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度。以飽和硫酸銨法提取的羊(或兔)抗SPA的IgG， 用來(lái)制備本實(shí)用新型快速檢測(cè)試紙條的對(duì)照印跡。
2、 羊抗或兔抗PPV和JEV的IgG (Xi)制備
采用國(guó)家批準(zhǔn)的PPV和JEV這兩種豬病的滅活疫苗或弱毒疫苗，多次免疫 接種抗體陰性健康羊或兔。末次免疫20天后靜脈采血，以HI測(cè)定其血清PPV 或JEV的抗體效價(jià)均在1:1024以上，'心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集其高免血清， 以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與提取抗SPA的IgG相同，不再重述)。
3、 純化PPV和JEV (Wi)的制備
3.1純化PPV的制備待ST細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄其生長(zhǎng)液，用PBS液洗2次， 接種適量PPV毒液，37t條件下吸附lh，加維持液后繼續(xù)于37"C培養(yǎng)，待細(xì)胞病 變(CPE)達(dá)80e/。時(shí)收獲病毒培養(yǎng)物，-2(TC和常溫下反復(fù)凍融3次，4°C、 8000r/min 離心30min,取上清。向上清液中分別緩慢加入NaCl和PEG-6000至其最終濃度 分別為0.5 mol/L和10。/。，用l mol/L的NaOH調(diào)其pH至8.0， 4'C條件下攪拌過(guò)夜后， 4°C、 10000 r/min離心30min，沉淀物以少量TNE緩沖液溶解，4。C條件下攪拌 過(guò)夜后再同上4。C離心，收集上清液。用TNE緩沖液配制成30%、 40%、 50%和 60%的不連續(xù)梯度蔗糖液，小心逐層加入離心管內(nèi)，將經(jīng)PEG濃縮的PPV液 加入離心管最上層，4°C、 39500 r/min離心2 h。將各離心管中的相同白色區(qū)帶 合并，測(cè)定各區(qū)帶血凝價(jià)，并用PPV標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽(yáng)性血清做ffl試驗(yàn)。取病毒帶 對(duì)TNE透析，濃縮即為純化病毒，-32'C凍存?zhèn)溆谩?br> 3.2純化JEV的制備:待BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)成單層后接種適量弱毒SA14-14-2， 待80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收毒于-2(TC冰箱，反復(fù)凍融3次后，4000rpm/min 離心lh， 22000r/min離心40min，去沉淀；上清液用30%的(^)2804溶液沉淀 后，5000r/min離心30min，收集沉淀，加生理鹽水至原體積的10%，再用蒸餾 水透析純化，經(jīng)萘氏試劑檢測(cè)無(wú)NH4+， 2%BaCl2溶液檢測(cè)無(wú)SO,后，用PEG20000 濃縮至原體積的5%。該濃縮液經(jīng)蔗糖不連續(xù)梯度(30%至60%)離心，23000r/min 離心4h，收取病毒帶透析濃縮即為純化病毒液，測(cè)定其蛋白含量，-32X:保存
9待用。
4、 金標(biāo)純化PPV和JEV (Wi)玻璃棉或金標(biāo)SPA玻璃棉的制備 以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠即在50 100ml沸騰的0.01 0.05%氯金酸
水溶液中加入2 4ml的0.5 2%檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的膠體 金。以0.1mol/L的K2C03調(diào)膠體金pH至8.5 9.5，以l:畫(huà) 腦的標(biāo)記比 將待標(biāo)記的純化病毒PPV或JEV (Wl或W2)或者SPA加入pH8.5 9.5的金 溶膠中，標(biāo)記10min后，加20%PEG10000至其最終濃度為0.05%， 4°C、 1500 3000r/min離心20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、 15000r/min離心lh，棄 上清液，獲初步純化金標(biāo)病毒或SPA混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析， 分離純化金標(biāo)蛋白，分別獲得膠體金標(biāo)記的PPV、 JEV或者SPA。將1:100 500 稀釋的膠體金標(biāo)記物吸附于精制玻璃棉中，4'C低溫真空干燥，制備出金標(biāo)抗原 或SPA玻璃棉。
5、 本實(shí)用新型快速檢測(cè)試紙條實(shí)施檢測(cè)的原理
當(dāng)本實(shí)用新型快速檢測(cè)試紙條測(cè)試端插入待檢測(cè)血清后，待檢血清通過(guò)虹 吸帶動(dòng)待檢豬病抗體及金標(biāo)抗原玻璃棉中的金標(biāo)抗原(Wi) —起向硝酸纖維素 膜擴(kuò)散，并最終滲入手柄端濾紙中，擴(kuò)散過(guò)程中待檢豬病抗體可與相應(yīng)的金標(biāo) SPA或病毒抗原(Wi)相結(jié)合，該結(jié)合物進(jìn)而與纖維素膜上的純化病毒抗原檢 測(cè)印跡結(jié)合，從而顯示出棕紅色的檢測(cè)印跡6-P和/或6-J;而羊(兔)抗SPA的 IgG、或羊(兔)抗病毒的IgG則可分別與金標(biāo)SPA或金標(biāo)病毒抗原(Wi)結(jié) 合，形成棕紅色對(duì)照印跡7。如果待檢血清中沒(méi)有PPV和/或JEV的抗體，試紙 條只顯示出一條(個(gè))棕紅色對(duì)照印跡7;血清中含有抗PPV和/或JEV的抗體， 則分別與其金標(biāo)抗原W1、 W2或SPA結(jié)合，再與纖維素膜上的相應(yīng)病毒抗原檢 測(cè)印跡6-P和域6-J結(jié)合，顯示出棕紅色的檢測(cè)印跡，為陽(yáng)性標(biāo)記；如果纖維素 膜上沒(méi)有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。
6、 本實(shí)用新型快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)操作方法
(1) 檢測(cè)樣品液的制備無(wú)菌取病豬的血液，并分離血清，以生理鹽水作
l:50倍稀釋血清待測(cè)。
(2) 檢測(cè)操作將本實(shí)用新型快速檢測(cè)試紙條測(cè)試端插入待檢測(cè)血清中，插入深度不超過(guò)標(biāo)記線9，約30秒后取出試紙條，水平放置約1 5分鐘，同時(shí) 觀察結(jié)果。
(3)結(jié)果判斷如果在檢測(cè)試紙條纖維素膜層上只顯示出一條(個(gè))棕紅 色對(duì)照印跡7，表示檢測(cè)結(jié)果呈陰性，說(shuō)明在被檢血清中未檢測(cè)出抗PPV和/或 JEV的抗體；如果檢測(cè)試紙條上的纖維素膜層上出現(xiàn)棕紅色的對(duì)照印跡7和檢 測(cè)印跡6-P或6-J,表示檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，即在待檢血清中檢測(cè)出抗PPV或JEV 的抗體；如果檢測(cè)印跡6-P、 6-J同時(shí)出現(xiàn)，表示在待檢血清中檢測(cè)出PPV和JEV 的抗體；如果纖維素膜帶上沒(méi)有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或 操作有誤。
實(shí)施例一 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條 參見(jiàn)圖1和圖2，圖中1為支撐層，用硬質(zhì)塑膠薄片條制成，2為測(cè)試端的 樣品吸附纖維層，用玻璃棉制成，3為吸附金標(biāo)物纖維層，用吸附有膠體金標(biāo) 記SPA的玻璃棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
4中所述的制備方法制備其金標(biāo) SPA玻璃棉，4為纖維素膜層，采用硝酸纖維素膜制成，5為吸水材料層，用吸 水濾紙制成；將編號(hào)2、 3、 4、 5各層從左端測(cè)試端至右粘貼在硬質(zhì)塑膠薄片條 1上，彼此之間交界處纖維互相交叉滲透；在硝酸纖維素膜層4上，6-P和6-J 為用純化的PPV和JEV兩種病毒抗原液印制的檢測(cè)印跡，7為用羊(或兔)抗 SPA的IgG溶液印制的對(duì)照印跡，兩種印跡排列形成的組合印跡帶為"I 1 1"、
" ,，"y y y ，，" \ \ \ """" ,，" ，，" "" "
" "、" "、" "中的任一種。8—1為覆蓋在測(cè)試端樣品吸附纖 維層2和吸附金標(biāo)物纖維層3上面的白色保護(hù)膜，在樣品吸附纖維層2和吸附 金標(biāo)物纖維層3交界處對(duì)應(yīng)的白色保護(hù)膜8-1位置上偏向于樣品吸附纖維層2 一側(cè)0.5cm處印有標(biāo)記線9，標(biāo)記線9的右端印有箭頭及max字樣，吸水材料 層5 (手柄端)上覆蓋有其它顏色(如黃色)保護(hù)膜8-2。
待測(cè)血清的制備及檢測(cè)步驟和操作方法，與具體實(shí)施方式
6中的檢測(cè)操作 方法相同，不再重述。
實(shí)施例二 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí)施 例一基本相同，不同之處在于吸附金標(biāo)物纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的PPV和JEV兩種純化病毒抗原 液的玻璃棉制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
4中所述的制備方法制備其金標(biāo)純化 病毒抗原(Xi)玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，7為用羊(或兔)抗PPV和 JEV兩種病毒的IgG溶液印制的對(duì)照印跡，兩種印跡帶平行排列組合為"I I I "。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的 操作方法，不再重述。
實(shí)施例三 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒抗體的試紙條，與實(shí)施例一基本相同，不
同之處在于
參見(jiàn)圖1和圖3，吸附金標(biāo)物纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記SPA的玻璃棉 制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
4中所述的制備方法制備其金標(biāo)SPA玻璃棉，6-P 為用純化的PPV病毒抗原液印制的檢測(cè)印跡，7為用羊(或兔)抗SPA的IgG 溶液印制的對(duì)照印跡，兩種印跡帶排列形成的形式為"I I "。其它包括檢測(cè)樣 品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的操作方法，不再重述。
實(shí)施例四 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒抗體的試紙條，與實(shí)施例三基本相同，不 同之處在于
吸附金標(biāo)物纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的PPV純化病毒抗原液的玻璃棉 制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
4中所述的制備方法制備其金標(biāo)純化病毒抗原玻 璃棉；7為用羊(或兔)抗PPV病毒的IgG溶液印制的對(duì)照印跡，兩種印跡帶 排列形成的形式為"I I "、 " = "、 "/ /"、 " \ \ "、 "- I "、 " I -"、 " + "、
"丄"、"t "、 "、""、""中的任一種。其它包括檢測(cè)樣品制備、 操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的操作方法，不再重述。
實(shí)施例五 一步檢測(cè)豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí)施例三基本相同， 不同之處在于
吸附金標(biāo)物纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記SPA的玻璃棉制成，根據(jù)上述具 體實(shí)施方式4中所述的制備方法制備其金標(biāo)SPA玻璃棉，6-J為用純化的JEV 病毒抗原液印制的檢測(cè)印跡，7為用羊(或兔)抗SPA的IgG溶液印制的對(duì)照 印跡，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡排列的形式為"〃"。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的操作方法，不再重述。
實(shí)施例六 一步檢測(cè)豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí)施例五基本相同， 不同之處在于
吸附金標(biāo)物纖維層3用吸附有膠體金標(biāo)記的JEV純化病毒抗原液的玻璃棉 制成，根據(jù)上述具體實(shí)施方式
4中所述的制備方法制備其金標(biāo)純化病毒抗原玻 璃棉；7為用羊(或兔)抗JEV病毒的IgG溶液印制的對(duì)照印跡7，檢測(cè)印跡和 對(duì)照印跡排列的形式為" "(參見(jiàn)圖4)。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法 和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的操作方法，不再重述。
實(shí)施例七 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí)施 例一基本相同，不同之處在于
支撐層1采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用尼龍纖維制成， 纖維素膜層4采用純纖維素膜制成，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列組合為"\ \ \"。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中 的操作方法，不再重述。
實(shí)施例八 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí)施 例一基本相同，不同之處在于
支撐層1采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用尼龍纖維制成， 纖維素膜層4釆用羧化纖維素膜制成，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列組合為"* *"。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的 操作方法，不再重述。
實(shí)施例九 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí)施 例七基本相同，不同之處在于
纖維素膜帶4采用聚偏二氟乙烯(PVDF)纖維素膜制成，檢測(cè)印跡和對(duì)照
印跡平行排列組合為"/ / /"。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定
等均同具體實(shí)施方式
6中的操作方法，不再重述。
實(shí)施例十 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí)施 例二基本相同，不同之處在于
支撐層1采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用尼龍纖維制成,
13纖維素膜層4采用純纖維素膜制成，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列組合為
"。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的 操作方法，不再重述。
實(shí)施例十一 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí) 施例三基本相同，不同之處在于
支撐層1采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用聚酯纖維制成， 纖維素膜層4采用羧化纖維素膜制成，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列組合為"\ \"。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式
6中的 操作方法，不再重述。
實(shí)施例十二 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí) 施例五基本相同，不同之處在于
支撐層1采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用尼龍纖維制成， 纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯纖維素膜制成，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列 組合為"I -"。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施
方式6中的操作方法，不再重述。
實(shí)施例十三 一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，與實(shí) 施例一基本相同，不同之處在于
支撐層1采用不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2采用聚酯纖維制成， 纖維素膜層4采用純纖維素膜制成，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡平行排列組合為 "III "。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同具體實(shí)施方式6中的操作方法，不再重述。
權(quán)利要求1、一種一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，該試紙條含有支撐層、吸附層和保護(hù)層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，保護(hù)層附著在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為樣品吸附纖維層、吸附金標(biāo)物纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡，其特征是所述吸附金標(biāo)物纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述檢測(cè)印跡用純化的豬細(xì)小病毒PPV和豬乙型腦炎病毒JEV抗原液中的任一種或兩種印制，所述對(duì)照印跡用羊或兔抗SPA的IgG溶液印制；或者，所述吸附金標(biāo)物纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的純化豬細(xì)小病毒PPV和豬乙型腦炎病毒JEV抗原液中的任一種或兩種，所述檢測(cè)印跡用純化的PPV和JEV抗原液中對(duì)應(yīng)的任一種或兩種印制，所述對(duì)照印跡用羊或兔抗PPV和JEV中對(duì)應(yīng)的任一種或兩種病毒的IgG溶液印制。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述吸附金標(biāo)物纖維層吸附 有膠體金標(biāo)記的SPA，所述檢測(cè)印跡用純化的PPV和JEV兩種抗原液印制，所 述對(duì)照印跡用羊或兔抗SPA的IgG溶液印制；或者，所述吸附金標(biāo)物纖維層吸 附有膠體金標(biāo)記的純化PPV和JEV兩種抗原液，所述檢測(cè)印跡用純化的PPV和 JEV兩種抗原液印制，所述對(duì)照印跡用羊或兔抗PPV和JEV兩種病毒的IgG溶 液印制。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述支撐層用不吸水的硬質(zhì) 塑膠片條或硬紙條制成；所述測(cè)試端樣品吸附纖維層用玻璃棉、或尼龍纖維、 或聚酯纖維制成；所述吸附金標(biāo)物纖維層用玻璃棉制成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層用硝酸纖維 素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成; 所述吸水材料層用吸水紙制成。 -
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為 直線式、或斜線式、或?qū)嵭膱A點(diǎn)，所述纖維素膜層上含有一條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)， 一條或個(gè)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為"I I "、" = "、"〃"、" \\"、"— I "、+ "、" 丄"、"T "、 " "、 "、 " ，，中的{壬一種；纟千維素膜層上含有兩條或個(gè)檢測(cè)印跡時(shí)，兩條或個(gè)檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式二| "、" H— "、" iL "、" TT "中的任一種
6、根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征是在所述測(cè)試端樣品吸附纖維層、吸附金標(biāo)物纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在測(cè)試端樣 品吸附纖維層與吸附金標(biāo)物纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向測(cè)試端樣品吸附纖維層一側(cè)0.5cm處。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種一步檢測(cè)豬細(xì)小病毒、豬乙型腦炎病毒抗體的試紙條，該試紙條含有支撐層、吸附層和保護(hù)層，吸附層附著在支撐層上，保護(hù)層附著在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為樣品纖維層、吸附金標(biāo)物纖維層、纖維素膜層和吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡；吸附金標(biāo)物纖維層吸附有膠體金標(biāo)記的SPA或膠體金標(biāo)記的純化PPV和JEV抗原液中任一種或兩種，檢測(cè)印跡用純化PPV和JEV抗原液中任一種或兩種印制，對(duì)照印跡用羊或兔抗SPA的IgG溶液、或用羊(或兔)抗PPV和JEV中任一種或兩種病毒的IgG溶液印制。本實(shí)用新型試紙條檢測(cè)時(shí)特異性強(qiáng)、敏感性高，無(wú)需附加設(shè)備、試劑，人人均可操作，特別適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)豬病的特異抗體。
文檔編號(hào)G01N33/569GK201298042SQ20082014880
公開(kāi)日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者劉慶堂, 張改平, 李學(xué)伍, 楊繼飛, 楊艷艷, 柴書(shū)軍, 王愛(ài)萍, 肖治軍, 東 趙, 鄧瑞廣, 邢廣旭 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院