專利名稱：診斷霍亂專用微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種診斷霍亂專用微流控芯片，屬于測試領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
霍亂是由霍亂弧菌引起的一種烈性傳染病，屬于國際檢疫傳染病，也是我 國傳染病防治法規(guī)定的甲類傳染病病原之一。該病發(fā)病急、傳播快、涉及范圍 廣，可引起局部和世界性的爆發(fā)流行為特征；是一種嚴(yán)重危害人類健康和生命 的傳染病。霍亂弧菌是導(dǎo)致感染者嚴(yán)重腹瀉的病原菌，作為國際檢疫傳染病一 —霍亂的病原診斷,以檢出01群霍亂弧菌或0139群霍亂弧菌為準(zhǔn)。
長期以來，對霍亂弧菌的診斷都是采用傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法，即形態(tài)學(xué)、生理 生化特征及血清學(xué)鑒定以及噬菌體分型等，最快的也要十幾個(gè)小時(shí)才能完成。 時(shí)間長、樣本量大、準(zhǔn)確率低，且一次只能獲得一種致病菌種類和數(shù)量。近年 來，在傳統(tǒng)的檢測方法基礎(chǔ)上，單克隆抗體和分子生物學(xué)技術(shù)越來越多地應(yīng)用 到霍亂弧菌的研究中，相關(guān)測試方法的飛速發(fā)展為霍亂弧菌的檢測提供了新的 強(qiáng)有力的手段。其中主要有膠體金標(biāo)記免疫層析技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)、
基因傳感器技術(shù)、間接免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和核酸序列分析技術(shù) 等。然而，上述方法中，病原體的分離費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適用快速批量診斷。由于
需要孵育、洗脫、顯色等多重步驟， 一般需要數(shù)小時(shí)。核酸PCR檢測諸法中， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性高、特異性強(qiáng)，可以縮短檢測窗口期，但需要較昂貴 的儀器設(shè)備，無法大面積推廣，且分離核酸和進(jìn)行PCR反應(yīng)也需要數(shù)小時(shí)，故 無法快速檢測。免疫膠體金試紙條可以在數(shù)分鐘內(nèi)獲得結(jié)果，實(shí)現(xiàn)快速檢測， 但一般只能達(dá)到半定量測定標(biāo)準(zhǔn)，敏感性差，成本高，也難以同時(shí)檢測多種抗 原。近年來發(fā)展很快的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法和化學(xué)發(fā)光方法雖然靈敏度高，但是仍需要繁瑣的前處理，且檢測價(jià)格昂貴。其中免疫分析技術(shù)是實(shí)現(xiàn)傳 染病準(zhǔn)確診斷的重要手段，通過測定病后2周血清抗菌"診斷蛋白"(抗原航體， 簡稱DP)含量，可以獲取病原體的種類和數(shù)量。免疫分析本身有很強(qiáng)的選擇性， 對傳染病的早期診斷，判斷療效及預(yù)后等方面均有重要的意義。然而重大傳染 病菌的檢測非常復(fù)雜，傳統(tǒng)的免疫分析通常只針對單一指標(biāo)進(jìn)行檢測。由于一 種診斷蛋白可出現(xiàn)在不同病菌，或不同診斷蛋白可在同一致病菌同時(shí)出現(xiàn)，因
此，開展高效的多重免疫分析方法(SMIAs)，從生物相關(guān)性的角度真實(shí)地定量 反映各種致病菌的種類和數(shù)量；在早期預(yù)防和聯(lián)檢多種傳染病、判斷傳染病菌 發(fā)展程度、觀察和評價(jià)治療效果等方面都具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。
01、 0139霍亂弧菌聯(lián)檢需要同時(shí)獲取TP0821、 TP0319、 TP0624以及霍 亂弧菌0139菌體蛋白、甘露糖敏感血凝(rMSHA)等幾種診斷蛋白含量，綜合 分析才能得到，其中，前四種蛋白含量的檢測更具診斷意義。
所述診斷蛋白TP0821、 TP0319、 TP0624、霍亂弧菌0139菌體蛋白，以 及，相應(yīng)的TP0821抗體、TP0319抗體、TP0624抗體、0139菌體蛋白抗體， 其技術(shù)含義在霍亂診療技術(shù)領(lǐng)域是公知的。
微流控芯片技術(shù)是將采樣、預(yù)處理、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測等集成在 一塊幾平方厘米的微芯片上迸行的一門前沿技術(shù)，具有分析速度快、信息量大、 試劑消耗少、污染小、操作費(fèi)用低、儀器簡便以及檢測速度和靈敏度俱佳等優(yōu) 點(diǎn)。微流控技術(shù)代表著21世紀(jì)分析儀器的發(fā)展方向。目前基于微流控芯片的檢 測技術(shù)主要有紫外吸收檢測、激光誘導(dǎo)熒光檢測、電導(dǎo)檢測、伏安檢測等。其 中紫外吸收檢測和電導(dǎo)檢測比較通用，但是其靈敏度較低；激光誘導(dǎo)熒光檢測 和伏安檢測靈敏度較高，但是測定對象不多，限制了它們的推廣。而傳感器中 采用電化學(xué)檢測，體積小、自動化程度高、成本低，非常適合于現(xiàn)場分析。
目前，在微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，利用霍亂多種特征抗體同時(shí)檢測、快速診 斷霍亂的技術(shù)尚未見報(bào)道。
實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型所要解決的技術(shù)問題是，在微流控芯片技術(shù)這樣一個(gè)總的技術(shù) 框架內(nèi)，研發(fā)出一種能夠利用霍亂多種特征抗體進(jìn)行同時(shí)檢測的應(yīng)用于快速診 斷烈性傳染病霍亂的專用微流控芯片。
本實(shí)用新型通過如下方案解決所述技術(shù)問題，該方案提供的裝置是一種診 斷霍亂專用微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀 物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所述 兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有毛細(xì)管通道，以及，三個(gè)微儲液池， 毛細(xì)管通道的一端經(jīng)由Y字形三聯(lián)通道分別與其中的兩個(gè)微儲液池聯(lián)通，毛細(xì) 管通道的另一端與余下的一個(gè)微儲液池聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述毛細(xì) 管通道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由金 屬電極以及包覆在所述金屬電極上的抗體物質(zhì)表層構(gòu)成，本案改進(jìn)之處在于， 所述毛細(xì)管通道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細(xì)管通道由四個(gè)微小 通道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個(gè)，該四個(gè)工作電極的裝設(shè)位 置分別位于所述四個(gè)微小通道內(nèi)，以及，該四個(gè)工作電極其表層結(jié)構(gòu)中的抗體
物質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是霍亂TP0821抗體以及霍亂 TP0319抗體以及霍亂TP0624抗體以及霍亂0139菌體蛋白抗體。所述抗體物 質(zhì)包含為固定所述各霍亂抗體而引入其中的輔助性介質(zhì)，所述輔助性介質(zhì)例如 巰基丁二胺銅修飾介質(zhì)，所述金屬電極可以首先利用所述輔助性介質(zhì)進(jìn)行表面 修飾處理，之后在其上包覆抗體物質(zhì)表層，抗體物質(zhì)表層與所述輔助性介質(zhì)渾 然一體。本案微流控芯片的結(jié)構(gòu)中涉及若干種電極，所述電極均為微小尺寸的 電極，其中的每一個(gè)電極的形狀均可以是任意選定的形狀，所述任意選定的形 狀例如方片形狀、矩形片狀、條狀或圓形片狀等等。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉 及若干個(gè)微儲液池，所述微儲液池是用于過渡性儲液的微池或微囊，其中的每 一個(gè)微儲液池的微型的內(nèi)腔其形狀均可以是任意選定的形狀，所述內(nèi)腔形狀例如微型的圓柱形空腔狀、微型的方柱形空腔狀、微型的橢圓形空腔狀或微型的 球形空腔狀等等。本案裝置當(dāng)然還可以進(jìn)一步包括一些附件，所述附件例如多 道電化學(xué)工作站以及微流動泵等等，所述多道電化學(xué)工作站的技術(shù)含義以及微 流動泵的技術(shù)含義是公知的。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及的各個(gè)工作電極以及 對電極以及參比電極等，可以分別經(jīng)由相應(yīng)的專用串線與所述多道電化學(xué)工作 站的相應(yīng)接口進(jìn)行聯(lián)接。所述專用串線是用來將各所述電極與所述多道電化學(xué) 工作站的各相應(yīng)接口進(jìn)行相互聯(lián)接的專用電纜。所述微流動泵用于驅(qū)動微量液 體流動，所述微流動泵可以與按需選定的任意一個(gè)所述微儲液池聯(lián)通。 本案微流控芯片的具體實(shí)現(xiàn)路徑可以有多種，選其一詳解如下-
一、 高聚物微金電極蓋片的制備
1、 以石英/鉻板為光掩模，用紫外光作為光源對蓋片表面的選擇性區(qū)域進(jìn) 行輻射。
2、 采用己二胺作為胺化劑，1-[3， - (N-N-二甲基胺)丙基]-3-已基碳二亞
胺鹽酸鹽為偶合劑對經(jīng)過選擇性區(qū)域照射的高聚物進(jìn)行胺化反應(yīng)。
3、 將經(jīng)過選擇性區(qū)域胺化反應(yīng)的高聚物浸入氯金酸中反應(yīng)泡。
4、 用蒸餾水清洗以后，再將其浸入硼氫化鈉溶液中還原。
5、 用蒸餾水清洗以后，在將其浸入0.5mol/L的硫氰化鉀溶液中超聲清洗 30Min。
6、 將經(jīng)過清洗的高聚物蓋片浸入含有金離子、絡(luò)合劑和還原劑甲醛的鍍液 中，于45-60。C下反應(yīng)1h。
7、 將鍍有微金電極的蓋片放入烘箱中退火處理約3 h，即得到本發(fā)明的高聚 物多微金電極蓋片。其中微金電極長3mm，寬3mm，厚度約為0.1mm。相互 之間間距約為3mm。
二、 帶有微通道的高聚物基片的制作 1、制作單晶硅陽模繪制芯片設(shè)計(jì)圖，圖形線條寬度約為25-100|jm，采用高清晰激光照片系 統(tǒng)輸出在透明的膠片上，即得到光刻掩模。
通過化學(xué)氣相沉積法在基片表面上沉積一層氮化硅薄模作為犧牲層，在此 基片上通過旋轉(zhuǎn)覆模技術(shù)覆蓋一層光敏膠，于烘箱中6(TC處理15-20min;將 光刻掩模覆蓋在基片上，通過暴光成像的原理將光刻掩模上的圖像轉(zhuǎn)移到基片 表面的光膠層上；通過干法腐蝕的方法將光膠層上的平面二維圖形加工成具有 一定深度的立體結(jié)構(gòu)。即可得到具有凸起的通道的單晶硅陽模。制備好的單晶 硅陽模依次用H202: H2S04溶液(體積比為1:4)，丙酮和蒸餾水清洗，以 除去其表面的氧化物。
2、 采用熱壓法復(fù)制微通道
將PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)有機(jī)玻璃片切割成長約6cm，寬4cm的 尺寸。超聲清洗，自然涼干，在熱壓裝置中將PMMA有機(jī)玻璃基片加熱到軟化 溫度(11CTC)左右，然后在單晶硅陽模上施加一定的壓力，并持續(xù)約1min， 即可在PMMA有機(jī)玻璃基片壓制出與單晶硅陽模互補(bǔ)的微通道。然后，將陽模 和刻有微通道的PMMA基片一起冷卻后脫模，就得到所需的微通道。
3、 在蓋片上制作微儲液池 在蓋片上采用金剛鉆鉆出三個(gè)微儲液池。
三、 將高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片在低溫氧等離子氣氛中 處理干凈
四、 芯片封合
在顯微鏡下對準(zhǔn)高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片，將此基 片和蓋片固定用二片蓋玻片夾緊，放置在烘箱中于11(TC左右保溫15min，即 可得到所需的四通道PMMA微流控芯片。
五、 將步驟四所完成的PMMA芯片分別在工作電極、參考電極及對電極末端利 用銀膠接上銅片作為導(dǎo)線，待銀膠完全干后再封上熱熔膠以固定銅片，即完成整個(gè)四通道微流控芯片的制作。 六、包覆抗體物質(zhì)表層
1、 采用等離子體表面處理法將微電極表面處理干凈，將處理后的微電極浸
于20mmol丄-1除氧的CuL (巰基丁二胺銅)溶液20h，獲得CuL修飾電極。
2、 采用點(diǎn)樣儀將各種單克隆抗原點(diǎn)到電極表面，點(diǎn)樣量在0.1-10mL及 0.1-100mL之間任意選擇；點(diǎn)樣精度0.5 nl;點(diǎn)樣速度3s/ul，每隔3mm點(diǎn)一 次樣品，在非接觸噴樣模式下將10iJL量的TP0821抗體，TP0319抗體， TP0624抗體，0139菌體蛋白抗體等四種抗體物質(zhì)分別固定在四個(gè)CuL修飾的 工作電極表面，至此，包覆抗體物質(zhì)表層的制備操作完成。
詳解的本案微流控芯片的上述具體實(shí)現(xiàn)路徑其相關(guān)各個(gè)操作參數(shù)可以根據(jù) 實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整。
本案微流控芯片的使用方法
采用外加微泵驅(qū)動液流在四通道微流控芯片的毛細(xì)管通道中穩(wěn)定流動，利 用四通道電化學(xué)儀器分別對四種蛋白加以檢測。 本案微流控芯片的具體檢測使用步驟如下
1、 在微管路中加入樣品液，在外加微泵驅(qū)動下，各種抗原分子被各通道中 電極表面相應(yīng)抗體捕獲，通過夾心法結(jié)合酶標(biāo)"二抗"形成免疫復(fù)合物。
2、 采用多通道電分析儀，加入鄰苯二酚等電子媒介體，采用安培法檢測"二
抗"上酶引起H202還原的電流變化，由此獲得各種分析物含量。
3、 將結(jié)果進(jìn)行綜合分析，對霍亂進(jìn)行診斷。
本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是，在一塊微流控芯片上集成了分別包覆有四種特征抗 體物質(zhì)表層的四個(gè)工作電極，該四個(gè)工作電極分別針對檢測霍亂的四種特征診 斷蛋白，本案微流控芯片是一種能夠利用霍亂多種特征抗體進(jìn)行同時(shí)檢測的應(yīng) 用于快速診斷烈性傳染病霍亂的專用微流控芯片，其集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定 了該芯片的使用有助于加快霍亂診斷速度、有助于降低霍亂診斷費(fèi)用。

圖1是本案微流控芯片實(shí)施例構(gòu)造輪廓示意圖，所展示的是該例結(jié)構(gòu)的俯 視角度下的透視的形態(tài)。
圖中，1、 2、 10分別是三個(gè)裝設(shè)位置不同的微儲液池，3是Y字形三聯(lián)通 道，4、 7、 11、 14分別是裝設(shè)位置不同但相互并聯(lián)形成并聯(lián)聯(lián)通結(jié)構(gòu)的四條微 小通道，5是裝設(shè)在微小通道4內(nèi)的具有霍亂TP0821抗體表層的工作電極，6 是裝設(shè)在微小通道7內(nèi)的具有霍亂TP0319抗體表層的工作電極，12是裝設(shè)在 微小通道11內(nèi)的具有霍亂TP0624抗體表層的工作電極，13是裝設(shè)在微小通 道14內(nèi)的具有霍亂0139菌體蛋白抗體表層的工作電極，8是對電極，9是參 比電極。
具體實(shí)施方式
在圖1所展示的本案實(shí)施例中，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起 的兩片板狀物，兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片， 在兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有毛細(xì)管通道，以及，三個(gè)微儲液 池，該三個(gè)微儲液池分別是微儲液池1、微儲液池2和微儲液池10，毛細(xì)管通 道的一端經(jīng)由Y字形三聯(lián)通道3分別與微儲液池1以及微儲液池2聯(lián)通，毛細(xì) 管通道的另一端與余下的一個(gè)微儲液池10聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述毛 細(xì)管通道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極8以及參比電極9，工作電極由 金屬電極以及包覆在金屬電極上的抗體物質(zhì)表層構(gòu)成，毛細(xì)管通道的構(gòu)造呈并 聯(lián)構(gòu)造，該呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細(xì)管通道由四個(gè)微小通道并聯(lián)構(gòu)成，該四個(gè)微小通 道分別是微小通道4以及微小通道7以及微小通道11以及微小通道14，以及， 工作電極的數(shù)量是四個(gè)，該四個(gè)工作電極分別是工作電極5以及工作電極6以 及工作電極12以及工作電極13，其中，工作電極5是裝設(shè)在微小通道4內(nèi)的 具有霍亂TP0821抗體表層的工作電極，工作電極6是裝設(shè)在微小通道7內(nèi)的 具有霍亂TP0319抗體表層的工作電極，工作電極12是裝設(shè)在微小通道11內(nèi) 的具有霍亂TP0624抗體表層的工作電極，工作電極13是裝設(shè)在微小通道14內(nèi)的具有霍亂0139菌體蛋白抗體表層的工作電極。圖1中沒有繪出作為附件 的微流動泵及多道電化學(xué)工作站等附屬件。本例結(jié)構(gòu)中的各工作電極以及對電 極以及參比電極可以分別經(jīng)由各自專用的電纜或曰串線分別與作為附件的多道 電化學(xué)工作站的對應(yīng)電纜接口或曰串線接口聯(lián)接。本例結(jié)構(gòu)中的各微儲液池可 以根據(jù)需要與作為附件的微流動泵按任何方式聯(lián)通。
權(quán)利要求1.診斷霍亂專用微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有毛細(xì)管通道，以及，三個(gè)微儲液池，毛細(xì)管通道的一端經(jīng)由Y字形三聯(lián)通道分別與其中的兩個(gè)微儲液池聯(lián)通，毛細(xì)管通道的另一端與余下的一個(gè)微儲液池聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述毛細(xì)管通道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由金屬電極以及包覆在所述金屬電極上的抗體物質(zhì)表層構(gòu)成，其特征是，所述毛細(xì)管通道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細(xì)管通道由四個(gè)微小通道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個(gè)，該四個(gè)工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述四個(gè)微小通道內(nèi)，以及，該四個(gè)工作電極其表層結(jié)構(gòu)中的抗體物質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是霍亂TP0821抗體以及霍亂TP0319抗體以及霍亂TP0624抗體以及霍亂O139菌體蛋白抗體。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種診斷霍亂專用微流控芯片，屬于測試領(lǐng)域?？焖偾伊畠r(jià)地對烈性傳染病霍亂進(jìn)行診斷是醫(yī)療技術(shù)進(jìn)步的諸多企望之一，本案提供一種利用霍亂多種特征抗體同時(shí)檢測、快速診斷霍亂的微流控芯片。該芯片帶有三個(gè)微儲液池，本案要點(diǎn)是，芯片內(nèi)含有呈并聯(lián)構(gòu)造的毛細(xì)管通道，該并聯(lián)構(gòu)造含有四條相互并聯(lián)的微小通道，共有四個(gè)工作電極分別裝設(shè)在所述四條微小通道內(nèi)，該四個(gè)工作電極的表層物質(zhì)分別是四種抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是霍亂TP0821抗體以及霍亂TP0319抗體以及霍亂TP0624抗體以及霍亂O139菌體蛋白抗體。本案芯片其集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了該芯片的使用有助于提高霍亂診斷速度并降低診斷耗費(fèi)。
文檔編號G01N33/569GK201348632SQ20082018400
公開日2009年11月18日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者巫遠(yuǎn)招, 寧 干, 李天華, 李榕生, 欣 楊, 峰 王, 王魯雁 申請人:寧波大學(xué)