專利名稱：：一種用于雙色微陣列熒光系統(tǒng)的可靠的熒光校正方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：這項發(fā)明是關(guān)于一種用于雙色熒光標(biāo)記系統(tǒng)的測量熒光發(fā)射光的可靠方法和體系，以及一種用于雙色熒光標(biāo)記系統(tǒng)的校正熒光共振能量轉(zhuǎn)移與熒光串?dāng)_的簡單方法。
背景技術(shù)：
：微陣列是一項普遍和有效的分子生物學(xué)研究技術(shù)，廣泛用于基因表達(dá)譜分析、基因組分析和藥物開發(fā)。在需要檢測特定靶標(biāo)分子(如DNA或RNA序列)的應(yīng)用領(lǐng)域中，微陣列技術(shù)廣為人知，同時在微陣列的制作和使用方法方面，已積累了許多的研究基礎(chǔ)。微陣列芯片上的信息讀取可以通過多種不同的方式，但最為便利并且選擇性最高的方法是通過熒光檢測，因為需要檢測的靶標(biāo)分子通常具有較低的熒光背景，而且熒光檢測工具易于實現(xiàn)自動化。微陣列方法通過熒光強度分析，可以并行地分析樣品中不同靶標(biāo)分子(例如核酸和蛋白)的相對數(shù)量。典型的應(yīng)用包括使用cDNA微陣列芯片進(jìn)行表達(dá)譜分析(Duggan,e"丄,NatureGeneticsSupplement,21:10-14，1999;Yang，eta丄,NatureReviewGenetics,3:579-588，2002)。微陣列芯片上固定的探針通常是已知結(jié)構(gòu)的分子，用以檢測樣品中能與探針結(jié)合的靶標(biāo)分子數(shù)量。芯片上的某些特定探針分子與樣品中的某些特定靶標(biāo)分子具有較強的親和力。如果這些靶標(biāo)分子存在于樣品中，它們將與探針結(jié)合，并固定在芯片上。那么基于微陣列芯片上的熒光強度分析，將可以同時檢測樣品中大量不同耙標(biāo)分子的相對數(shù)量。使用微陣列技術(shù)時，可以選擇兩種方案單色方案和雙色方案。單色方案中，只使用一種熒光團(tuán)標(biāo)記不同的樣品分別標(biāo)記后，與不同的芯片雜交。而雙色方案中，使用兩種熒光團(tuán)(例如Cy3和Cy5)分別標(biāo)記兩個樣品(處理樣品和對照樣品)。在單色方案中，通過熒光強度來測量單一樣品中的靶標(biāo)數(shù)量。在雙色方案中，兩個不同樣品中相同耙標(biāo)的相對數(shù)量可以同時測量，其前提是兩種熒光團(tuán)的測量互不干擾。雙色微陣列芯片的制作流程中，首先通過在薄板、芯片或載玻片上點制探針分子(例如cDNA片段、寡核苷酸、蛋白或組織)制作微陣列。通常，尺寸適合于樣品自動處理和商業(yè)化熒光掃描儀檢測的載玻片或薄板用作剛性的基底。其表面經(jīng)過修飾后，包覆了聚賴氨酸或氨基，用于固定不同類型的探針分子。兩組不同的樣品(處理樣品和對照樣品，或陽性對照和陰性對照)分別使用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記(例如標(biāo)記處理樣品的Cy5和標(biāo)記對照樣品的Cy3)。將標(biāo)記后的樣品混合，與固定有可尋址探針的微陣列芯片進(jìn)行親和反應(yīng)。之后，洗去未與芯片結(jié)合的熒光標(biāo)記的靶標(biāo)分子，使用熒光掃描儀的雙通道分別讀取兩種熒光的強度。通過分析來自雙通道的合成的微陣列圖像，可以進(jìn)行背景校正，計算和歸一化每個探針點上熒光團(tuán)的數(shù)量比率(如Cy5/Cy3)。通過數(shù)據(jù)的解釋，獲取定量的生物信息，并分析實驗的置信度。然而，在雙色微陣列系統(tǒng)中，兩種熒光團(tuán)之間可能會相互影響。當(dāng)兩種熒光團(tuán)存在光譜重疊，并且同時存在于處理樣品和對照樣品的相同靶標(biāo)結(jié)合到芯片上的同一探針區(qū)域時，兩種熒光團(tuán)之間可能發(fā)生非輻射的相互作用，例如FRET(稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移或福斯特共振能量轉(zhuǎn)移)。由于FRET是一種距離依賴性的熒光團(tuán)相互作用，因此當(dāng)兩種熒光距離較遠(yuǎn)時，不會發(fā)生FRET作用。但是實際情況下，很難確定兩個熒光團(tuán)之間的距離。同時，由于一種熒光團(tuán)可能被另一種熒光團(tuán)的激發(fā)光所激發(fā)，并且一種熒光團(tuán)的發(fā)射熒光可能就進(jìn)入另一種熒光團(tuán)的檢測通道，這被稱作熒光串?dāng)_。FRET和熒光串?dāng)_的產(chǎn)生與熒光的光譜屬性和檢測儀器的配置有關(guān)。因此，在雙標(biāo)記實驗中，熒光信號的采集將可能受到FRET和熒光串?dāng)_的干擾。當(dāng)一種熒光團(tuán)(受體)的激發(fā)光譜與另一種熒光團(tuán)(配體)的發(fā)射光譜存在重疊，并且這兩種熒光團(tuán)之間的距離小于10mn時，這兩個熒光團(tuán)之間可能發(fā)生非輻射的FRET作用。配體(如Cy3)和受體(如Cy5)稱為FRET熒光對。配體較受體具有更短的激發(fā)和發(fā)射波長，以及更高的能量。當(dāng)FRET發(fā)生時，配體的測量信號不能準(zhǔn)確反應(yīng)配體的真實數(shù)量FRET將減少配體的直接熒光發(fā)射，而將配體的部分能量非輻射的轉(zhuǎn)移給受體，從而干擾配體數(shù)量的測量。若同時檢測受體熒光時，受體熒光的測量信號也將受到干擾，因為受體除了被激發(fā)光源激發(fā)外，還將接受因FRET作用從配體傳遞的能量。為了消除因FRET而帶來的測量干擾，需要選擇合適光譜屬性的熒光團(tuán)，或12者控制熒光團(tuán)之間的距離超越FRET作用范圍，例如使熒光團(tuán)之間的距離大于10nm。但是，在一些實驗系統(tǒng)中，不可能嚴(yán)格控制熒光團(tuán)之間的距離，甚至在某些實驗中，需要兩種熒光團(tuán)之間相互靠近。熒光串?dāng)_的發(fā)生通常是因為熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射光譜與測量儀器激發(fā)和發(fā)射波長的重疊。例如，某些情況下，使用配體通道中的配體激發(fā)光可以激發(fā)受體，而受體的發(fā)射光可以進(jìn)入到配體的檢測通道(當(dāng)受體的吸收光譜與配體通道的配體激發(fā)光存在重疊)。同樣，一些情況下，使用受體通道中的受體激發(fā)光可以激發(fā)配體，而配體的發(fā)射光可以進(jìn)入到受體的檢測通道中。在一個理想的微陣列芯片平臺上(包含特定的熒光團(tuán)和熒光掃描儀組合)，F(xiàn)RET和熒光串?dāng)_都應(yīng)該得到避免，這樣，測量得到的熒光強度將正比于芯片上熒光團(tuán)的數(shù)目。然而雙色微陣列平臺上的常用熒光團(tuán)滿足FRET發(fā)生的光譜條件，同時，芯片上熒光團(tuán)之間的距離難以控制，因此FRET或熒光串?dāng)_難以完全避免。當(dāng)FRET存在時，需要對測量的配體熒光信號進(jìn)行校正，達(dá)到通過熒光信號準(zhǔn)確地確定熒光團(tuán)數(shù)目的目的。過去的微陣列實驗中，兩種熒光團(tuán)的強度分別通過熒光掃描儀的兩個通道(通常為Cy3通道和Cy5通道)直接測量，沒有進(jìn)行FRET校正與熒光串?dāng)_校正。當(dāng)兩種熒光團(tuán)(例如Cy3與Cy5)同時存在與芯片上的同一個探針點上時，具有更高能量的熒光團(tuán)(例如Cy3)可被看作配體。高能量的熒光團(tuán)可以提供能量，去激發(fā)低能量的熒光團(tuán)；而低能量的熒光團(tuán)卻不能提供足夠的能量去激發(fā)高能量的熒光團(tuán)。當(dāng)芯片上的配體與受體發(fā)生FRET時，配體熒光信號將降低，因此部分的配體能量將會通過非輻射途徑傳遞給受體，而非以光子的形式進(jìn)入熒光檢測通道。而只有配體發(fā)射波長的熒光光子才能夠被配體通道的檢測器接收，而受體發(fā)射波長的熒光光子與配體非輻射的能量無法被配體通道的檢測器接收，因此通過配體的熒光強度將低估芯片上的配體數(shù)量。本發(fā)明提供了一種用于雙色微陣列實驗的可靠的利用三通道熒光掃描儀的熒光強度測量方案。掃描儀的每個通道分別接收特定的熒光發(fā)射信號，整合三個通道的熒光信號可以進(jìn)行FRET校正與熒光串?dāng)_校正。這種可靠的熒光測量方法可以準(zhǔn)確測量微陣列芯片上的熒光強度，為后續(xù)的微陣列分析提供可靠的數(shù)據(jù)。配體通道指使用配體激發(fā)波長激發(fā)，通過配體發(fā)射波長檢測；受體通道指使用受體激發(fā)波長激發(fā)，通過受體發(fā)射波長檢測；FRET通道指使用配體激發(fā)波長激發(fā)，通過受體發(fā)射波長檢測
發(fā)明內(nèi)容總論此發(fā)明提供了包含F(xiàn)RET校正和熒光串?dāng)_校正的可靠熒光測量的技術(shù)和設(shè)備。我們首先描述FRET校正方案，然后考慮熒光串?dāng)_的校正。主要包含三個步驟a)確定實驗系統(tǒng)參數(shù)(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)b)獲取配體通道熒光發(fā)射、受體通道熒光發(fā)射和FRET通道熒光發(fā)射。其中配體通道用于觀察配體熒光，受體通道用于觀察受體熒光，F(xiàn)RET通道用于觀察受體因FRET激發(fā)而產(chǎn)生的敏化發(fā)射。c)通過確定的系統(tǒng)參數(shù)和測量的熒光發(fā)射強度，通過此發(fā)明的公式計算完全的熒光強度。熒光信號的FRET校正配體和受體熒光團(tuán)可以是任意合適的熒光團(tuán)組合。它們可以是商業(yè)化的熒光染料，包括cyanine染料、Alexa染料、Cy5一26—6、Cy5Tl、Cy5T6、Cy5T7、Cy5T8、Sq5T5、Sq5T7，、Sq5T8、Sq5T6、Cy5.5T8、Cy5.5T7、Sq5T2、Sq5Tl、Sq5T4、Sq5T3、Sq5T10、Sq5、Cy5.5T9、Cy5.5T5、Cy5.5T10、Cy5.5、Cy5.5T12和Cy5.5T6。這些熒光染料的結(jié)構(gòu)參見Tu等的論文(NucleicAcidsResearch,26:2797-2802,1998)。這些染料的發(fā)射光波長范圍為630-700nm。其他可用的染料包括DY-630、DiD、Dy-635、DY-640、Bodipy630/650、ATTO655和ATTO680，這些染料的結(jié)構(gòu)參見Buschmann等的論文(BioconjugateChemisty,14:195-204，2003)。在一些實驗中，使用Cy3(配體)和Cy5(受體)染料，它們是常見的花氰染料，包含不同的垸基和苯環(huán)，其結(jié)構(gòu)如下所示Cy3Cy5我們定義々。'。"，^為(假設(shè)不存在配體時)受體的全部發(fā)射熒光，而々。'W為(假設(shè)不存在受體時)配體的全部發(fā)射熒光。當(dāng)熒光團(tuán)的量子產(chǎn)率保持不變時，^。'。M，(OT和/r。,。。r分別正比于配體的數(shù)量和受體的數(shù)量。當(dāng)樣品中只存在一種熒光團(tuán)時，不存在FRET作用，可通過熒光強度定量熒光豐度(液相中，豐度指濃度；固相上，豐度指密度)。當(dāng)微陣列芯片的探針點上同時存在兩種熒光團(tuán)，F(xiàn)RET干擾或熒光串?dāng)_可能存在。除非實驗中能夠完全排除FRET干擾或熒光串?dāng)_，為了準(zhǔn)確測量熒光信號，都需要進(jìn)行FRET校正和熒光串?dāng)_校正。我們首先不考慮系統(tǒng)的熒光串?dāng)_，只進(jìn)行FRET校正。當(dāng)微陣列實驗中使用的熒光團(tuán)光譜滿足FRET發(fā)生的條件(受體的激發(fā)光譜與配體的發(fā)射光譜存在較大重疊)，并且兩個不同的熒光團(tuán)相互靠近(距離小于IOnm)，可能發(fā)生FRET作用。受體通道的測量值^"等于全部受體發(fā)射熒光^。'。"。"，，但配體通道的測量值^郎將因fret作用而降低，從而小于全部配體發(fā)射熒光7^^。"。f。我們使用M^表示FRET通道的測量值。為了進(jìn)行FRET校正，我們定義了校正因子G。校正因子G在給定的系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)為常數(shù)。校正因子G可使用下式定義/拜—/,、其中，^^。旨和^""。，分別表示受體淬滅后和淬滅前，參與FRET作用的直接配體發(fā)射熒光。A,^^申。"表示受體因FRET作用而產(chǎn)生的敏化熒光。通常情況下，雙標(biāo)記樣品中同時存在參與FRET作用的配體和不參加FRET作用的配體。我們稱前者在配體通道的發(fā)射熒光為^w。、稱后者在配體通道的發(fā)射熒光為7"。wD。，。因此，；,。"。r可以使用下式表示,一f;,pos(綜合公式1與公式2，我們可以得到公式3:其中，A。fw(D。旨與^"Aw之和等于實際的直接配體發(fā)射熒光，用^。"。'表示。i"，是實際受體敏化熒光，G在一個特定的實驗系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)為常數(shù)。因此，不論配體與受體熒光團(tuán)是否發(fā)生FRET作用，全部配體發(fā)射熒光^。^。旨可用公式3計算，而全部受體發(fā)射熒光^w"，等于實際的直接受體發(fā)射熒光^，'。f。熒光串?dāng)_校正為了全面的校正熒光測量中的干擾，需要對熒光串?dāng)_進(jìn)行校正。熒光串?dāng)_源于配體與受體的光譜重疊。為了校正熒光串?dāng)_，^,"^^"w、^"，和^。，可用公式4-5計算，此方面為Gordon等提出(BiophysicalJournal,74:2702-2713,1998):r，,a./-^.p，,1i,1("--).(/1)(Pi)^)④d匿(ZI)(")(5)、—=."^y-."^T^(6)其中，"等于只包含受體的探針點上受體通道的熒光強度與FRET通道熒光強度的比值，"等于只包含配體的探針點上配體通道的熒光強度與FRET通道的熒光強度比值，-等于只包含配體的探針點上受體通道的熒光強度與FRET通道的熒光強度比值，^等于只包含受體的探針點上配體通道的熒光強度與FRET通道熒光強度比值。這四個系統(tǒng)因子被稱為熒光串?dāng)_因子，在一個特定的實驗系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)為常數(shù)。因為以上這些系統(tǒng)因子與系統(tǒng)因子^提供了足夠的信息用于FRET校正，此發(fā)明提供了一種新穎的微陣列芯片，此芯片上包含了FRET校正所需的特定標(biāo)準(zhǔn)探針點。標(biāo)準(zhǔn)探針點l僅含有配體熒光團(tuán)，標(biāo)準(zhǔn)探針點2僅含有受體熒光團(tuán)，標(biāo)準(zhǔn)探針點3含有相同數(shù)量的配體和受體熒光。標(biāo)準(zhǔn)探針點1與標(biāo)準(zhǔn)探針點2可能具有相同數(shù)目的熒光團(tuán)。標(biāo)準(zhǔn)探針點3中含有的配體與受體數(shù)目也可分別同標(biāo)準(zhǔn)探針點1中的配體和標(biāo)準(zhǔn)探針點2中的受體數(shù)目相同。配體與受體稱為FRET熒光對，例如Cy3可作為配體，Cy5可作為受體。確定系統(tǒng)因子G當(dāng)前存在一些方法用于確定校正因子G。Chen等(BiophysicalJournal,91:39-41，2006)提出了一種確定校正因子G，這個方法要求使用兩組同時包含配體和受體的復(fù)合物，這兩組復(fù)合物中的配體與受體之間距離必須不同，從而其FRET效率不同。其他的確定校正因子G的方法存在各種不同的缺點，例如，有的方法需要特殊的測量儀器(一種方法需要測量熒光量子產(chǎn)率)，有的方法需要制備多組同時包含有配體與受體的復(fù)合物。本文提出兩種新的確定校正因子G的方法，無需合成這類復(fù)合物，并且能夠直接使用熒光掃描儀測量，因此適合微陣列平臺的使用。我們定義系統(tǒng)的響應(yīng)因子^為配體在配體通道的檢測熒光強度與相同數(shù)目的受體在受體通道的檢測熒光強度的比值。響應(yīng)因子^在一個特定的實驗系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)為常數(shù)。響應(yīng)因子y可用下列公式計算其中，7。rc和分別代表配體在配體通道的檢測熒光強度和相同數(shù)目的受體在受體通道的檢測熒光強度。因此改寫公式3，可以通過公式8計算校正因子G:乂i)owor^(8)其中Z'&柳,加她c、7'^，和/'^分別表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3(受體與配體數(shù)目相同，并發(fā)生FRET作用)上實際的敏化受體發(fā)射熒光、實際的直接受體發(fā)射熒光和實際的直接配體發(fā)射熒光。^用于確定發(fā)生FRET時的全部配體發(fā)射熒光。如果標(biāo)準(zhǔn)探針點3上無FRET作用存在，那么公式8的分子與分母均接近0，將給計算帶來較大誤差。J'S柳'扭必c啤附、J:c印,。r和/'fl。"。r可以使用公式4—6計算。為了確定一個特定實驗系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)的校正因子G和熒光串?dāng)_因子，需要制備三個標(biāo)準(zhǔn)探針點，包括只含有配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點1、只含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點2和含有相同數(shù)目配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點3。因為校正因子G十分重要，此發(fā)明提供了一個微陣列芯片的設(shè)計，在此芯片上設(shè)計了一種含有相同數(shù)目配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點，受體與配體可以通過混合或綁定結(jié)合的形式存在。一些實例中，為了構(gòu)建這類標(biāo)準(zhǔn)探針點，可將配體與受體等量混合，其數(shù)量的差異不能大于10%，最好小于5%。微陣列芯片的標(biāo)準(zhǔn)探針點3上包含相同數(shù)目的配體與受體。這類標(biāo)準(zhǔn)探針點可以通過預(yù)先制備、綁定一種分子(同時標(biāo)記有兩個熒光團(tuán))或綁定一種復(fù)合物(復(fù)合物中包含有等量的配體與受體)實現(xiàn)，也可以通過在同一探針點上制備等量的配體與受體實現(xiàn)，還可以通過將等量配體標(biāo)記分子與受體標(biāo)記分子的混合物同芯片上互補分子綁定結(jié)合的方式實現(xiàn)。一些實例中，可以將標(biāo)記了其中一種熒光團(tuán)的分子固定在芯片表面，然后將標(biāo)記了另一種熒光團(tuán)的分子與芯片上固定的分子綁定結(jié)合。通過分子的結(jié)合，使得探針點上兩種熒光團(tuán)的數(shù)目相同。另一種制備標(biāo)準(zhǔn)探針點3的方法是，將配體標(biāo)記的分子與受體標(biāo)記的互補分子通過兩種分子的親和力一對一的綁定結(jié)合，結(jié)合后的復(fù)合物包含等量的配體與受體。這種綁定結(jié)合反應(yīng)可以在溶液中進(jìn)行，然后將結(jié)合后的復(fù)合物通過傳統(tǒng)的方法固定到芯片表面。另一種制備標(biāo)準(zhǔn)探針點3的方法是點制或綁定雙標(biāo)記的復(fù)合物到芯片上。這種復(fù)合物可以通過本文所介紹的制作Cy5-dsDNA-Cy3-順2芯片的方式產(chǎn)生，也可以通過合成的方式產(chǎn)生。另一種制備標(biāo)準(zhǔn)探針點3的方法是將配體標(biāo)記的分子與受體標(biāo)記的相同分子混合后點制到芯片上，或?qū)⑴潴w標(biāo)記的分子與受體標(biāo)記的相同分子混合后與芯片上固定的互補分子綁定結(jié)合。混合樣品中，配體標(biāo)記的分子與受體標(biāo)記的分子等量，因此芯片探針點上的配體與受體的數(shù)量相同，如本文的Cy5/Cy3-dsDNA-NH2芯片制作過程。確定了一個特定實驗系統(tǒng)(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)1的組合)的校正因子G以后，我們可以通過以下的方法確定另一個特定實驗系統(tǒng)(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)2的組合)的校正因子G。由于熒光串?dāng)_因子"等于僅含有配體的探針點上配體通道的熒光信號與FRET通道的熒光信號之比，因此可以用以下的公式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>而校正因子G可以用下列公式表示(Zal,etal.，BiophysicalJournal,86:3923-3939，2004):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>這里，&和^分別表示配體通道的激發(fā)光強和FRET通道的激發(fā)光強；^和^分別表示配體通道和FRET通道的接收效率(分別與配體通道和FRET通道的探測器增益有關(guān))；^和^分別表示配體與受體的量子產(chǎn)率；^和&分別表示歸一化的配體發(fā)射光譜和受體發(fā)射光譜；^和^分別表示配體通道濾光片組的傳遞系數(shù)與FRET通道濾光片組的傳遞系數(shù)。因此，校正因子G與熒光串?dāng)_因子"的關(guān)系可用下式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中，校正因子G與熒光串?dāng)_因子"成正比關(guān)系。由于參數(shù)&、A、&、&、^和&在一個特定實驗系統(tǒng)(包含特定的熒光團(tuán)和熒光掃描儀的組合)中保持不變，與掃描儀的掃描參數(shù)(包含激發(fā)光強和發(fā)射光檢測器增益)無關(guān)。因此，比例系數(shù)H(也就是&J(&'&))在一個特定實驗系統(tǒng)(包含特定的熒光團(tuán)和熒光掃描儀的組合)中保持不變，與掃描儀的掃描參數(shù)無關(guān)。我們通過已知的G和i計算比例系數(shù)//，一旦/f確定后，只要熒光團(tuán)和熒光掃描儀的組合不變，只改變掃描參數(shù)時，G即可通過"的測量而計算。因此，若只改變掃描參數(shù)，微陣列芯片上只需要制備兩個標(biāo)準(zhǔn)探針點，即可測量G和所有熒光串?dāng)_因子。兩個標(biāo)準(zhǔn)探針點包括只含有配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點1和只含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點2。標(biāo)準(zhǔn)探針點2上的受體數(shù)目無需與標(biāo)準(zhǔn)探針點1上的配體數(shù)目相同。這種方法簡化了確定G的過程。在某些實例中，為了方便和靈活處理，標(biāo)準(zhǔn)探針點2上的受體數(shù)目與標(biāo)準(zhǔn)探針點1上的配體數(shù)目相同。FRET干擾與熒光串?dāng)_的校正在通常的雙色微陣列實驗中，兩種熒光團(tuán)(配體與受體)分別標(biāo)記兩組樣品，例如使用Cy3作為配體，Cy5作為受體。當(dāng)配體標(biāo)記的樣品靶標(biāo)與受體標(biāo)記的樣品靶標(biāo)與芯片上同一探針點上的探針反應(yīng)時，不同分子之會出現(xiàn)隨機(jī)的接近現(xiàn)象。因此，即使配體和受體分別結(jié)合在不同分子上，F(xiàn)RET也可能發(fā)生。常用的商業(yè)化掃描儀中，配體通道不能檢測到受體熒光，而受體通道也不能檢測配體熒光，因此-和^均為0，這種條件下，校正因子G可以使用下式計算G=)CT^——^"(12)其中，^L、M"和^^分別表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上FRET通道的熒光信號、受體通道的熒光信號和配體通道的熒光信號。標(biāo)準(zhǔn)探針點3上配體與受體的數(shù)目相同，并且配體與受體之間發(fā)生FRET作用。樣品檢測探針點上^。"0。，和^。'a""一r可通過下式計算^朋4-'丄7腸/Oo/w=MoT)G(13)7腸Wcce，=(14)其中，^w、^^和M^分別表示樣品檢測探針點上FRET通道的熒光信號、受體通道的熒光信號和配體通道的熒光信號。在某些實例中，此發(fā)明提供了一種微陣列芯片設(shè)計，芯片上包含一些探針點，用于微陣列系統(tǒng)或儀器的標(biāo)定。微陣列芯片可以包含一個或多個用于檢測靶標(biāo)的樣品檢測探針點以及至少兩個用于系統(tǒng)標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)探針點。一個實例中，芯片包含兩個標(biāo)準(zhǔn)探針點，用于本文所介紹的標(biāo)定方法。這兩個標(biāo)準(zhǔn)探針點即為只含有配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點和只含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點。這兩個標(biāo)準(zhǔn)探針點上的熒光團(tuán)數(shù)量可24以相同，也可以不同。在另一些實例中，此發(fā)明提供了一種包含三個標(biāo)準(zhǔn)探針點的微陣列芯片設(shè)計。這三個標(biāo)準(zhǔn)探針點用于可靠的熒光信號測量，包括僅含有配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點1、僅含有相同數(shù)量受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點2以及含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點3。這些微陣列芯片可以用于測量系統(tǒng)因子(例如G、H、r、"、"、^和P)，并用本文所介紹的方法校正雙色微陣列平臺上的熒光信號。這類微陣列芯片的設(shè)計和制備這類微陣列芯片的方法屬于本發(fā)明的范圍。對于含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點3，配體與受體可以先后放置到同一探針點上，也可以混合后同時放置到同一探針點上。一種特別簡便的方法是將一種熒光團(tuán)標(biāo)記的分子首先固定到芯片表面，然后將另一種熒光團(tuán)標(biāo)記的互補分子與芯片上固定的分子結(jié)合。通過這種方式，芯片上將固定等量配體與受體。標(biāo)準(zhǔn)探針點1可以通過兩種方式構(gòu)建點制配體標(biāo)記的分子到芯片(也就是通過已知方法固定配體標(biāo)記分子到芯片上)，或者將配體標(biāo)記的分子與芯片上無標(biāo)記的互補分子綁定結(jié)合。標(biāo)準(zhǔn)探針點2可以通過兩種方式構(gòu)建點制受體標(biāo)記的分子到芯片(也就是通過已知方法固定受體標(biāo)記分子到芯片上)，或者將受體標(biāo)記的分子與芯片上無標(biāo)記的互補分子綁定結(jié)合。微陣列芯片可以包含一個或多個用于檢測靶標(biāo)的樣品檢測探針點以及至少兩個用于系統(tǒng)標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)探針點。在一個實例中，當(dāng)含有標(biāo)準(zhǔn)探針點和樣品檢測探針點的芯片與不同熒光團(tuán)標(biāo)記的樣品混合物反應(yīng)，即可用于特定的實驗與分析。如果樣品中的耙標(biāo)與樣品檢測探針點上的探針結(jié)構(gòu)互補，樣品中標(biāo)記的靶標(biāo)即可綁定到樣品檢測探針點上，然后使用三通道掃描儀測量芯片上的熒光信號，并使用本文介紹的方法進(jìn)行計算。這類微陣列芯片可以是專門對系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)定的芯片，也可以是包含樣品檢測探針點和3個標(biāo)準(zhǔn)探針點的芯片。—旦微陣列芯片制作完成，即可使用三通道熒光掃描儀讀取芯片上的熒光信號，通過標(biāo)準(zhǔn)探針點確定校正所需的系統(tǒng)因子，并進(jìn)行FRET校正。這樣的操作，可以讓使用者在釆集樣品檢測探針點熒光信號的同時，采集用于FRET校正和熒光串?dāng)_校正的標(biāo)準(zhǔn)探針點的熒光信號。使用者也可以使用一張不含樣品檢測探針點而僅含有標(biāo)準(zhǔn)探針點的微陣列芯片獨立進(jìn)行校正所需系統(tǒng)因子的測量與計算，然后使用另一張含有樣品檢測探針點的微陣列芯片進(jìn)行樣品分析。系統(tǒng)因子的測量可以在樣品檢測前或檢測后進(jìn)行，也可以在樣品檢測的同時進(jìn)行。一旦得到了校正所需的系統(tǒng)因子和樣品檢測探針點的信號強度，即可使用本發(fā)明所描述的方法校正樣品檢測探針點上的信號強度，消除FRET干擾和熒光串?dāng)_干擾，獲得能夠反應(yīng)實際靶標(biāo)數(shù)量的熒光信號強度。此方法包括使用本文所描述的方法計算每個樣品檢測探針點上的兩種校正后的熒光強度，消除FRET干擾和熒光串?dāng)_干擾。在一些實例中，熒光標(biāo)記的靶標(biāo)分子可以是cDNA、合成的寡核苷酸、蛋白或者其他的生物多聚物(如RNA、DNA、mRNA、tRNA、多肽或低聚糖)。同樣，固定在芯片上的探針分子也可以是cDNA、合成的寡核苷酸、蛋白或者其他的生物多聚物(如RNA、DNA、raRNA、tRNA、多肽或低聚糖)。此發(fā)明所涉及的熒光掃描儀是一種能夠讀取二維平面上的熒光信號的儀器。在某些方面，此發(fā)明所提供的一種三通道熒光掃描儀包含第一個熒光觀察通道中配置了適合第一種熒光團(tuán)激發(fā)波長的激發(fā)光和適合第一種熒光團(tuán)發(fā)射波長的檢測器(包含發(fā)射濾光片)。第二個熒光觀察通道中配置了適合第二種熒光團(tuán)激發(fā)波長的激發(fā)光和適合第二種熒光團(tuán)發(fā)射波長的檢測器(包含發(fā)射濾光片)。第三個熒光觀察通道中配置了適合第一種熒光團(tuán)激發(fā)波長的激發(fā)光和適合第二種熒光團(tuán)發(fā)射波長的檢測器(包含發(fā)射濾光片)。為方便理解，這里使用了第一種熒光團(tuán)和第二種熒光團(tuán)的概念代替了配體和受體的概念，第三個通道即為配體激發(fā)波長激發(fā)，受體發(fā)射波長檢測。在一個實例中，掃描儀包括一張含有兩個標(biāo)準(zhǔn)探針點或三個標(biāo)準(zhǔn)探針點的微陣列芯片，用于確定系統(tǒng)因子。此發(fā)明提供了一種用于計算配體校正后熒光強度的方法，包含了校正所需系統(tǒng)因子的計算以及隨后的樣品檢測探針點熒光信號的校正。準(zhǔn)確的配體熒光強度可以使用下式計算G(15)A^'。"c邵/。/"—7^ccepf0/*(16)其中，4幽。，表示樣品檢測探針點上全部配體熒光強度，7腸"，^表示樣品檢測探針點上全部受體熒光強度，/&""*"，(。"表示樣品檢測探針點上實際敏化受體熒光強度，L。旨表示樣品檢測探針點上實際的直接配體發(fā)射熒光，^"'。r表示樣品檢測探針點上實際的直接受體發(fā)射熒光，G可以使用下式計算得到7(17)其中，"s,"zai一M、ro^和卩^"，分別表示含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際敏化受體熒光、實際的直接配體發(fā)射熒光和實際的直接受體發(fā)射熒光強度。Z為系統(tǒng)響應(yīng)因子，可以用下式表示y=7。"4"(18)其中，八"是僅含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點2的受體發(fā)射熒光強度，A。"是僅含有等量配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點1的配體發(fā)射熒光強度。另一方面，此發(fā)明提供了一種方法用于在雙色微陣列分析中對熒光串?dāng)_的校正，至少包含以下步驟(1)提供僅包含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點1和僅含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點2。(2)使用這兩個標(biāo)準(zhǔn)探針點確定串?dāng)_校正因子^、"、^和"。其中，^等于標(biāo)準(zhǔn)探針點1在受體通道的信號與在FRET通道的信號之比，"等于標(biāo)準(zhǔn)探針點1在配體通道的信號與在FRET通道的信號之比，^等于標(biāo)準(zhǔn)探針點2在配體通道的信號與在FRET通道的信號之比，"等于標(biāo)準(zhǔn)探針點2在受體通道的信號與在FRET通道的信號之比。用戶在采集每個樣品檢測探針點上的熒光信號后，利用這四個參數(shù)可實現(xiàn)熒光串?dāng)_校正。這些方法也可以包括使用標(biāo)準(zhǔn)探針點3進(jìn)行G的計算。用戶可以通過下面的公式校正每個樣品檢測探針點上實際的發(fā)射熒光，消除熒光串?dāng)_對測量的影響s咖"』c邵欣D"(a--).("一爐)OD(/-W^(19)(a-0)(or-^)(20)7一^^wP，其中，4wW申。r表示樣品檢測探針點上實際敏化受體熒光強度，^。"w表示樣品檢測探針點上實際的直接配體發(fā)射熒光，L，^表示樣品檢測探針點上實際的直接受體發(fā)射熒光。如果芯片上不僅存在熒光串?dāng)_，還可能發(fā)生F服T，那么可以使用含有三個標(biāo)準(zhǔn)探針點的微陣列芯片(標(biāo)準(zhǔn)探針點1、標(biāo)準(zhǔn)探針點2和標(biāo)準(zhǔn)探針點3)取代含有兩個標(biāo)準(zhǔn)探針點的微陣列芯片(標(biāo)準(zhǔn)探針點1和標(biāo)準(zhǔn)探針點2),標(biāo)準(zhǔn)探針點3用語確定FRET校正因子G。當(dāng)FRET可能發(fā)生時，對標(biāo)準(zhǔn)探針點3測量得到的熒光信號包括配體通道熒光信號M;、受體通道熒光信號^^和FRET通道熒光信號M;。這些測量值通過下列公式對熒光串?dāng)_進(jìn)行校正乂S細(xì)te《必c鄰tor=M/i47"、,fl^一M^—M("-靜-爐)(/i)^0)(22)'一waw(a—)(a-咖JDonorJKizo\JU"J/0人、(Pi)(p-(24)其中，"&"她^，加、"D。旨和7'血聊r分別表示含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際敏化受體熒光、實際的直接配體發(fā)射熒光和實際的直接受體發(fā)射熒光強度。這些校正值將用于計算校正因子G。在一些實例中，熒光串?dāng)_現(xiàn)象并不顯著，因此可以將校正的步驟進(jìn)行簡化。當(dāng)僅含有配體的樣品在受體通道中沒有信號，同時僅含有受體的樣品在配體通道中沒有信號時，熒光串?dāng)_因子^和P接近0。在這種情況下，樣品檢測探針點上實際的發(fā)射熒光可以通過下式計算''〃"(25)Acceptoc=(26)々。"。r-"^DD(27)標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的發(fā)射熒光可以通過下式計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>其中，^u"'^C。,、^。"。r和L，^分別表示樣品檢測探針點上實際敏化受體熒光強度、實際的直接配體發(fā)射熒光強度和實際的直接受體發(fā)射熒光強度。M^、^""和M"分別表示樣品檢測探針點上FRET通道、配體通道和受體通道的熒光信號測量值。"S,"z^"^、"D。"。r和r血印加分別表示含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際敏化受體熒光強度、實際的直接配體發(fā)射熒光強度和實際的直接受體發(fā)射熒光強度。M;、W;和似、分別表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上FRET通道、配體通道和受體通道的熒光信號測量值。因此，用戶可以使用上述的公式對樣品檢測探針點進(jìn)行熒光串?dāng)_和FRET干擾的校正。例如，一個熟練操作者可以使用上述方法計算的^咖咖他啤欣、L，階和乙。離來校正FRET干擾和熒光串?dāng)_，獲得配體的全部發(fā)射熒光和受體的全部發(fā)射熒光。當(dāng)僅含有配體的樣品在受體通道中沒有信號，同時僅含有受體的樣品在配體通道中沒有信號時，熒光串?dāng)_因子^和^接近0。因此，實際的發(fā)射熒光/&""^^，、和々。"。f可以通過公式25-27計算，從而校正FRET干擾和熒光串?dāng)_，獲得樣品檢測探針點上配體的全部發(fā)射熒光和受體的全部發(fā)射熒光。另一方面，此發(fā)明提供了一種確定校正因子G的方法，此因子與實驗系統(tǒng)有關(guān)。通過公式17、22、23、24計算得到的標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的發(fā)射熒光h,"威鄉(xiāng)。r、"鄉(xiāng)'。r和^d瞎后，計算校正因子G。確定校正因子G后，可通過公式15計算校正后的全部發(fā)射熒光。同樣，當(dāng)僅含有配體的樣品在受體通道中沒有信號，同時僅含有受體的樣品在配體通道中沒有信號時，熒光串?dāng)_因子^和P接近0。這時，可以通過公式28-30計算得到的標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的發(fā)射熒光7'&股',w他邵加、JV鄰斷和/'Do。r后，可利用公式17計算校正因子G。同時，本發(fā)明提供了一種新的確定校正因子G的方法。這種方法適用于實驗系統(tǒng)中掃描儀和熒光團(tuán)沒有改變，而僅有掃描儀的掃描參數(shù)改變的情況。當(dāng)熒光團(tuán)屬性、掃描儀以及掃描參數(shù)都沒有改變時，校正因子G保持不變。當(dāng)掃描參數(shù)改變時，校正因子G改變。然后，當(dāng)使用掃描儀的掃描參數(shù)2時，校正因子G的值可以通過掃描參數(shù)1時校正因子G的值(^w"")計算。這樣可以避免重新計算新的掃描參數(shù)下校正因子G。改變掃描參數(shù)后，無需重新計算校正因子G。我們定義自'^為掃描參數(shù)2時校正因子G的值，它可以通過下式計算其中，^表示掃描參數(shù)2時僅含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點上配體通道熒光信號與FRET通道熒光信號的比值，H為比例系數(shù)，可通過下式計算H-々p咖me敏lGparame^l(32)其中，"w^表示掃描參數(shù)i時僅含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點上配體通道熒光信號與FRET通道熒光信號的比值，e^"^h表示掃描參數(shù)i時校正因子G的值，可通過公式17或其他方法確定。掃描參數(shù)1與掃描參數(shù)2的區(qū)別可以是激發(fā)光的光強，也可以是熒光檢測器的增益。當(dāng)激發(fā)光的光強或熒光檢測器的增益改變時，校正因子G均會發(fā)生變化。為了確定新掃描參數(shù)下的校正因子G，可以通過公式32首先計算H，然后使用H和公式31計算新的G值。此發(fā)明的方法可以用于任意的具有較大激發(fā)波長與發(fā)射波長差異的熒光對。熒光團(tuán)之間應(yīng)具有較大的熒光屬性差異(包括激發(fā)波長和發(fā)射波長)，以便于熒光團(tuán)的單獨激發(fā)與檢測。在一些實例中，配體的發(fā)射波長和激發(fā)波長均比受體激發(fā)波長至少小30mn。在一些實例中，配體的發(fā)射波長比受體的激發(fā)波長至少小50nm。配體和受體可以分別是Cy3和Cy5，也可以是微陣列分析中使用到的其他熒光團(tuán)。圖1顯示了(oligo-2)-NH2分子作為探針固定到微陣列芯片上的點陣模式圖。包含八個不同濃度的子陣，Dl:0.05uM，D2:0.1uM,D3:0.2uM，D4:0.4線D5:0.8線D6:1.6線D7:3.2線D8:6.4uM。圖2(a)-(i)為Cy5-dsDNA-NH2芯片、Cy3-dsDNA-NH2芯片和Cy5-dsDNA-Cy3-朋2芯片的微陣列圖像。分別使用Cy5通道，Cy3通道和FRET通道掃描獲得。本實例中，僅使用一個子陣(探針濃度為1.6"M)計算系統(tǒng)因子。掃描儀532nm激發(fā)光和640nm激發(fā)光強度均設(shè)為80，570nm和675nm熒光發(fā)射光檢測器增益均設(shè)為650。圖3(a)-(c)為Cy5/Cy3-dsDNA-NH2芯片的微陣列圖像。分別使用Cy5通道，Cy3通道和FRET通道掃描獲得。八個子陣的信號點用來計算Cy5與Cy3的信號強度比。掃描儀532nm激發(fā)光和640nra激發(fā)光強度均設(shè)為80，570nm和675nm熒光發(fā)射光檢測器增益均設(shè)為650。圖4為Cy5/Cy3-dsDNA-朋2芯片上Cy5與Cy3的信號強度比。未校正的Cy3信號與校正后的Cy3信號分別用于計算校正前后Cy5與Cy3的信號強度比。具體實施例方式這項發(fā)明將實施方式進(jìn)一步進(jìn)行描述。若無特殊說明，這里用到的術(shù)語使用它們的原始含義。微陣列和熒光掃描儀已被廣泛使用。通常，微陣列上包含有許多探針點，這些探針點以一定的模式或網(wǎng)格的形式分布在固相基底表面。固相基底可以是任意合適的材料，如玻璃、塑料、尼龍膜或硅片。探針可以使用傳統(tǒng)的方法放置到芯片表面，如點制、印刷、原位雜交或其他合適的方式。芯片或薄板上的點是一組不連續(xù)的網(wǎng)格狀探針點。探針點可以是用于樣品中靶標(biāo)檢測的探針點，也可以是用于標(biāo)定的質(zhì)控探針點或標(biāo)準(zhǔn)探針點。通常情況下，一張微陣列芯片上存在96個探針點，也可以存在超過1000個的探針點。每個探針點的直徑在lum到lmm之間。技術(shù)上，印刷的探針點直徑在10nm到500um之間。本申請所述的結(jié)合配對分子指2個分子，它們之間具有結(jié)合的親和力。每個分子稱為配對成員，每個配對成員被認(rèn)為是另一個的補充，兩者能夠緊密結(jié)合。它們之間的親和力可使得它們反應(yīng)后能形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物。例如，親和素(avidin或str印tavidin)和生物素(biotin)可以作為一組配對成員，親和素和生物素之間具有較強的親和力。5-50bp長度的核酸序列與其互補序列雜交后也可以形成穩(wěn)定復(fù)合物，因此它們也可以作為一組配對成員。配對成員可以作為中介，依靠其親和力，將不同分子綁定成穩(wěn)定復(fù)合物。配對成員之一可以與第一種分子(熒光團(tuán)1)結(jié)合形成第一種化合物，另一配對成員可以與第二種分子(熒光團(tuán)2)結(jié)合形成第二種化合物。這兩種化合物可以通過配對成員之間的親和力連接，從而將第一種分子與第二種分子結(jié)合在一起，形成更大的復(fù)合物。這個實例中，熒光團(tuán)l和熒光團(tuán)2通過過配對成員之間的綁定結(jié)合而靠近。為了校正雙色微陣列芯片實驗中的熒光強度，我們首先需要確定系統(tǒng)因子，試驗中使用Cy5和Cy3作為標(biāo)記熒光團(tuán)，微陣列掃描儀作為熒光檢測儀器。然而，任意的具有較好激發(fā)波長與發(fā)射波長分辨差異的熒光對均可使用。然后，使用確定的系統(tǒng)因子，我們校正了微陣列芯片上的熒光強度。在此芯片上Cy5與Cy3通過雜交結(jié)合于同一探針點上。最后我們比較了校正前后的Cy5與Cy3的信號比值。寡核苷酸合成所有的寡核苷酸均由TaKaRa公司(寶生物工程有限公司，大連，中國)合成。其細(xì)節(jié)如下表所示。表l實驗中所用的寡核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實驗中使用的熒光團(tuán)包括Cy3(最大激發(fā)波長為550nm，最大發(fā)射波長為570nm，配體)和Cy5(最大激發(fā)波長為649nm，最大發(fā)射波長為670ran,受體)。第一組寡核苷酸(oligo-1)序列均為5'-TCCGTCATCGCTCAAG-3'，但標(biāo)記不同。3'末端標(biāo)記Cy5的版本稱為(oligo-1)-Cy5，3'末端標(biāo)記Cy3的版本稱為(oligo-1)-Cy3，3'末端標(biāo)記Cy3而5'末端標(biāo)記Cy5的版本稱為Cy5-(0ligo-l)-Cy3。第二組寡核苷酸為5'-CTTGAGCGATGACGGATTTTTTTTTTTTTTTT-3'-NH2，簡稱為(oligo-2)-NH2。其3'末端含有氨基，用于同芯片上的酵基反應(yīng)，將探針固定于芯片上。5'端的16個堿基于第一組寡核苷酸互補。3'端的16個T堿基作為尾巴，將5'端的序列支撐起來，以利于與oligo-l雜交。芯片的構(gòu)建(oligo-2)-NH2分子溶解于DNA點樣緩沖液(博奧生物有限公司，北京，中國)，配制8個濃度梯度(0.05uM到6.4nM)，配制的濃度梯度溶液按圖1所示的排布點制到微陣列芯片上，點制的微陣列芯片稱為(oligo-3)-Nft芯片。點樣使用SmartArrayer-48微陣列芯片點樣儀(博奧生物有限公司)，基片采用醛基芯片(博奧生物有限公司)。(oligo-1)-Cy5、(oligo-1)-Cy3和Cy5-(oligo-1)-Cy3分別溶解于微陣列雜交緩沖液(5XDenhard1/ssolution,0.2%SDS，3XSSC)，濃度均為1.0uM，各取12pL的溶液分別與(oligo-2)-朋2芯片雜交，構(gòu)建的芯片稱為Cy5-dsDNA-NH2芯片，Cy3-dsDNA-朋2芯片和Cy5-dsDNA-Cy3-朋2芯片。同時，我們將(oligo-1)-Cy5與(oligo-1)-Cy3按1:1混合(兩種分子的終濃度均為1.0wM)，取12yL的溶液與(oligo-2)-冊2芯片雜交，構(gòu)建的芯片稱為Cy5/Cy3-dsDNA-順2芯片。在42°C水浴條件下，經(jīng)過2小時的雜交，使用洗液I(0.2免SDS，2XSSC)和洗液II(0.2XSSC)先后清洗芯片，清洗時間均為4min，洗液溫度為42°C。清洗完畢后，使用1600rpm離心1min。離心后的芯片使用改造的LuxScan-10K/A微陣列芯片掃描儀(博奧生物有限公司)掃描。我們通過增加了一組激發(fā)光與發(fā)射濾光片的組合，使得此微陣列芯片掃描儀可以用于檢測FRET信號。改造后的芯片掃描儀具有三個熒光采集通道，包括Cy3通道(激發(fā)光為532nm，檢測的發(fā)射光為570nm)、Cy5通道(激發(fā)光為635nm，檢測的發(fā)射光為675nm)和FRET通道(激發(fā)光為532nm，檢測的發(fā)射光為675nm)。微陣列圖像使用LuxScan3.0分析軟件(博奧生物有限公司)提取探針點的熒光強度信息。由此，將微陣列圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為信號強度矩陣。確定微陣列芯片平臺的系統(tǒng)因子從圖2b和2d中可以看到，僅含有Cy3的芯片在Cy5通道沒有熒光信號，僅含有Cy5的芯片在Cy3通道也沒有熒光信號，因此^和^等于0。實驗中，相同濃度的(oligo-1)-Cy5與(oligo-1)-Cy3分別與(oligo-2)-NH2雜交，從而構(gòu)建了Cy5-dsDNA-NH2芯片和Cy3-dsDNA-NH2芯片。因為(oligo-1)-Cy5與(oligo-1)-Cy3的序列相同，并且雜交條件相同，因此Cy5_dsDNA-NH2芯片上的Cy5數(shù)目與Cy3-dsDNA-服2芯片上的Cy3數(shù)目大致相同。系統(tǒng)響應(yīng)因子^可以通過Cy5-ds咖A-服2芯片在Cy5通道的熒光信號(Figure2a)與Cy3-dsDNA-NH2芯片在Cy3通道的熒光信號(Figure2e)的比值確定。熒光串?dāng)_因子"可以通過Cy3-dsDNA-NH2芯片上FRET通道(Figure2f)與Cy3通道(Figure2e)的信號強度比值確定。同樣熒光串?dāng)_因子"可以通過Cy5-dsDNA-NH2芯片上FRET通道(Figure2c)與Cy5通道(Figure2a)的信號強度比值確定。公式12-14中所用到的測量值可以通過熒光掃描儀的Cy3通道、Cy5通道和FRET通道分別讀取。為了確定校正因子G，需要制備標(biāo)準(zhǔn)探針點，此探針點上配體與受體數(shù)目相同，并且發(fā)生明顯FRET作用。我們可以通過FRET通道的信號強度來判斷是否發(fā)生了FRET作用。實驗中，我們將Cy5-(oligo-1)-Cy3與(oligo-2)-腿2芯片雜交，構(gòu)建了Cy5-dsDNA-Cy3-NH2芯片。通過咖A圓柱模型計算，單個探針上的Cy5與Cy3之間的距離小于10nm，因此存在FRET作用。芯片掃描圖如圖2g-2i所示。理論上，芯片的每個探針點上含有相同數(shù)目的Cy3與Cy5。熒光串?dāng)_校正后，存在較強的FRET信號。我們使用公式12和測量的信號值計算校正因子G。確定了G和/后，即可計算G與^的比例系數(shù)7/。因此，當(dāng)我們改變掃描參數(shù)時，新的G值可通過新的/值和比例系數(shù)^確定。而新的"值可通過僅含Cy3的探針點上FRET通道熒光與Cy3通道熒光的比值確定。雙色DNA微陣列芯片實驗中的熒光測量確定了系統(tǒng)因子后，即可測量樣品檢測探針點的熒光信號。微陣列芯片實驗中，通常Cy5標(biāo)記的耙標(biāo)分子與Cy3標(biāo)記的相同靶標(biāo)分子會結(jié)合到芯片上的相同樣品檢測探針點上。由于連接于相鄰DNA上的Cy3與Cy5之間可能產(chǎn)生分子間FRET作用，Cy3的熒光測量值將會收到干擾。試驗中，我們將Cy5-(oligo-l)與Cy3-(oligo-1)的相同濃度混合物同(oligo-2)-NH2芯片雜交，從而構(gòu)建了Cy5/Cy3-dsDNA-朋2芯片。芯片掃描圖如圖3a-3c所示。由于混合物中(oligo-1)-Cy5與(oligo-1)-Cy3濃度相同，因此每個探針點上Cy5的數(shù)目與Cy3的數(shù)目大致相同。當(dāng)探針濃度變化時，Cy5與Cy3的強度比值應(yīng)保持不變。然而從圖4可以看到，Cy5與Cy3的強度比值隨著探針濃度的升高而增大。這是因為，隨著探針濃度的升高，分子間的FRET作用增強。通過公式13和14進(jìn)行熒光校正后，在探針濃度變化時Cy5與Cy3的強度比值基本保持不變。結(jié)果顯示我們的方法可以消除雙色微陣列芯片實驗中的FRET干擾，獲取準(zhǔn)確的熒光信號。實例我們利用下列實例，進(jìn)一步解釋說明本發(fā)明。但本發(fā)明并不僅僅局限于此實例。用于基因表達(dá)譜分析的微陣列芯片DNA微陣列是一種有效而常用的高通量分析基因數(shù)目的方法，可用于細(xì)胞中的基因表達(dá)譜分析。這項技術(shù)可以通過熒光信號分析兩組樣品中mRNA的豐度差異。在雙色微陣列實驗方案中，處理樣品和對照樣品分別使用Cy5和Cy3標(biāo)記，混合后40與同一張芯片雜交。在基因表達(dá)譜分析中，通過在芯片表面點制cDNA片斷、點制預(yù)先合成的寡核苷酸或原位合成寡核苷酸的方法構(gòu)建微陣列芯片。從處理樣品和對照樣品中分別提取的mRNA經(jīng)純化、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增等操作后，cDNA樣品分別利用配體-dUTP(例如，Cy3-dUTP標(biāo)記對照樣品)或受體-dUTP(例如，Cy5-dUTP標(biāo)記處理樣品)進(jìn)行標(biāo)記。配體與受體標(biāo)記的樣品混合后變性。去除游離的dCTP后，樣品混合物與芯片雜交。雜交后的芯片通過清洗和干燥處理，通過熒光掃描儀的兩個通道采集熒光信號。如果兩組樣品在相同的條件下進(jìn)行的標(biāo)記，并且標(biāo)記效率相同，那么就可以通過熒光信號的強度來比較兩組樣品中相同靶標(biāo)的相對豐度。熒光圖像經(jīng)數(shù)據(jù)提取和歸一化處理后，通過聚類分析尋找基因表達(dá)差異的信息。在這個應(yīng)用中，處理樣品的cDNA和對照樣品的cDNA都將與芯片上的cDNA探針或寡核苷酸探針雜交。當(dāng)來自于處理樣品和對照樣品的靶標(biāo)cDNA結(jié)合到芯片上的同一探針點上，并且結(jié)合后的探針點上熒光密度足夠高時，配體熒光(Cy3)信號將受到FRET作用的干擾。因此，在確定了特定實驗系統(tǒng)的(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)系統(tǒng)因子后，應(yīng)使用微陣列掃描儀的三個通道采集熒光信號，包括配體通道(如Cy3通道)、受體通道(如Cy5通道)和FRET通道(如Cy3激發(fā)波長激發(fā)，Cy5發(fā)射波長接收)使用我們所提出的熒光測量方法，Cy3通道的熒光信號得以校正。然后我們即可以計算和歸一化兩種熒光信號比值，執(zhí)行后續(xù)的聚類分析。以上的實例只是對本發(fā)明的說明，本發(fā)明并不僅局限于此實例。參考文獻(xiàn)U.S.PatentDocuments6,661,909B212/2003Youvan，etal.7，209，8364/2007Scherraer，etal.Shalon'etal.,GenomeMethods(1996)6:639-645.Gordon,etal.，BiophysicalJournal(1998)74:2702-2713.Tu,etal.，NucleicAcidsResearch(1998)26:2797-2802.Duggan，etal.，NatureGeneticsSupplement(1999)21:10-14.Hegde，etal.，Biotechniques(2000)29:548-562.Yang,etal.,NatureReviewGenetics(2002)3:579-588.Buschmann,etal.，BioconjugateChemisty(2003)14:195-204,Zal,etal.,BiophysicalJournal(2004)86:3923-3939.Thaler，etal.，BiophysicalJournal(2005)89:2736-2749.Lee,etal.,BiophysicalJournal(2005)88:2939-2953.Chen,etal.，BiophysicalJournal(2006)91:39-41.Patterson,etal.，NatureBiotechnology(2006)24:1140-1150.權(quán)利要求1、一種用于雙色熒光測量系統(tǒng)的微陣列芯片，包含用于確定熒光測量校正因子的三種標(biāo)準(zhǔn)探針點，即標(biāo)準(zhǔn)探針點1，僅含配體，而不含受體；標(biāo)準(zhǔn)探針點2，僅含受體，而不含配體，其數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)探針點1上的配體數(shù)量相同；標(biāo)準(zhǔn)探針點3，含有等數(shù)量的配體與受體。2、如權(quán)利要求l所述的的芯片，其配體為Cy3，受體為Cy5。3、一種用于雙色熒光測量系統(tǒng)的微陣列芯片，包含用于確定熒光測量校正因子的兩種標(biāo)準(zhǔn)探針點，艮P:標(biāo)準(zhǔn)探針點l，僅含配體，而不含受體；標(biāo)準(zhǔn)探針點2，僅含受體，而不含配體。4、如權(quán)利要求3所述的的芯片，其配體為Cy3，受體為Cy5。5、一種使用雙色熒光測量系統(tǒng)，確定微陣列芯片上#針點熒光強度的方法，包含使用權(quán)利要求1的微陣列芯片確定與測量系統(tǒng)相關(guān)的校正因子G、系統(tǒng)響應(yīng)因子7以及熒光串?dāng)_因子"、"、^和P。6、一種使用雙色熒光測量系統(tǒng)，確定微陣列芯片上探針點熒光強度的方法，包含使用權(quán)利要求2的微陣列芯片確定與測量系統(tǒng)相關(guān)的熒光串?dāng)_因子"、"、^和P。7、如權(quán)利要求5所述的方法中，雙色熒光測量系統(tǒng)使用一組FRET熒光對，包含一個配體和一個受體，配體是Cy3,受體是Cy5。8、一種制作如權(quán)利要求l所述微陣列芯片的方法，包括制備標(biāo)準(zhǔn)探針點3的過程首先固定一個包含有配體和配對成員的化合物到芯片上，然后將一個包含有受體和另一配對成員的化合物與芯片反應(yīng)。這兩種化合物可以通過配對成員之間的親和力連接，從而將等數(shù)量的配體與受體結(jié)合在一起。9、一種微陣列芯片掃描儀，用于能夠讀取二維平面上的熒光信號的儀器，包含第一個熒光觀察通道，提供適合第一種熒光團(tuán)激發(fā)波長的激發(fā)光和適合第一種熒光團(tuán)發(fā)射波長的檢測器(包含發(fā)射濾光片)。第二個熒光觀察通道，提供適合第二種熒光團(tuán)激發(fā)波長的激發(fā)光和適合第二種熒光團(tuán)發(fā)射波長的檢測器(包含發(fā)射濾光片)。第三個熒光觀察通道，提供適合第一種熒光團(tuán)激發(fā)波長的激發(fā)光和適合第二種熒光團(tuán)發(fā)射波長的檢測器(包含發(fā)射濾光片)。10、如權(quán)利要求9所述的掃描儀，第一種熒光團(tuán)是FRET熒光對的配體，第二種熒光團(tuán)是FRET熒光對的受體，第一種熒光團(tuán)可以是Cy3,第二種熒光團(tuán)可以是Cy5。11、一種使用雙色熒光測量系統(tǒng)準(zhǔn)確地分析微陣列芯片上探針點熒光信號的方法，包括使用如權(quán)利要求9所述的掃描儀測量標(biāo)準(zhǔn)探針點1、2和3或樣品檢測探針點，利用熒光信號的測量值，通過下列公式計算每個樣品檢測探針點上準(zhǔn)確的熒光強度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，；w。r為樣品檢測探針點上配體的全部發(fā)射熒光，^w,f為樣品檢測探針點上受體的全部發(fā)射熒光，^^。^，^表示樣品檢測探針點上實際敏化受體熒光強度，^。"w表示樣品檢測探針點上實際的直接配體發(fā)射熒光，L，'^表示樣品檢測探針點上實際的直接受體發(fā)射熒光，G可通過下列公式計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，^s,"w^豐。r表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際敏化受體熒光，'D。，表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的直接配體發(fā)射熒光，7、，^表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的直接受體發(fā)射熒光強度，系統(tǒng)響應(yīng)因子7可以用下式計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>4。"(36)其中，4"是標(biāo)準(zhǔn)探針點2的受體發(fā)射熒光強度，L。"是標(biāo)準(zhǔn)探針點l的配體發(fā)射熒光強度。標(biāo)準(zhǔn)探針點1、2和3是芯片上的標(biāo)準(zhǔn)點，可以在同一張芯片上，也可以在不同芯片上。標(biāo)準(zhǔn)探針點l僅含有配體，不含受體；標(biāo)準(zhǔn)探針點2僅含有受體，不含配體，其數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)探針點l上的配體數(shù)量相同；標(biāo)準(zhǔn)探針點3，含有等數(shù)量的配體與受體。12、一種在使用配體與受體的雙色微陣列測量中校正熒光串?dāng)_的方法，包括(1)測量僅含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點1的熒光強度和僅含受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點2的熒光強度；(2)計算熒光串?dāng)_因子^、p、p和"，其中，^等于標(biāo)準(zhǔn)探針點l在受體通道的信號與在FRET通道的信號之比，》等于標(biāo)準(zhǔn)探針點1在配體通道的信號與在FRET通道的信號之比，^等于標(biāo)準(zhǔn)探針點2在配體通道的信號與在FRET通道的信號之比，"等于標(biāo)準(zhǔn)探針點2在受體通道的信號與在FRET通道的信號之比；(3)測量芯片上樣品測量探針點的配體通道信號M。D、受體通道信號M^和FRET通道信號M^;測量標(biāo)準(zhǔn)探針點3的配體通道信號M'加、受體通道信號MV和FRET通道信號M;;(4)校正熒光串?dāng)_，計算每個樣品檢測探針點的直接發(fā)射熒光<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(37)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(38)^(39)校正熒光串?dāng)_，計算標(biāo)準(zhǔn)探針點3的直接發(fā)射熒光:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，^"f^"，表示樣品檢測探針點上實際敏化受體熒光強度，/。。_表示樣品檢測探針點上實際的直接配體發(fā)射熒光，、。w表示樣品檢測探針點上實際的直接受體發(fā)射熒光，7'&"""^^，表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際敏化受體熒光，7;。"表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的直接配體發(fā)射熒光，7、，'。"表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的直接受體發(fā)射熒光強度。13、如權(quán)利要求12所述的的方法中，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)探針點l在受體通道中沒有信號，并且標(biāo)準(zhǔn)探針點2在配體通道中沒有信號時，熒光串?dāng)_因子^和^接近0，此時樣品檢測探針點上實際的直接發(fā)射熒光可通過下式計算，消除熒光串?dāng)_的影響.-了Sem"戰(zhàn)必cc一r——:—"^^4=(45)標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的直接發(fā)射熒光可通過下式計算，消除熒光串?dāng)_的影響:/"(46)其中7s—"，表示樣品檢測探針點上實際敏化受體熒光強度，^。旨表示樣品檢測探針點上實際的直接配體發(fā)射熒光，4"，表示樣品檢測探針點上實際的直接受體發(fā)射熒光，m^為樣品檢測探針點上fret通道信號測量值，m。D表示樣品檢測探針點上配體通道信號測量值，m〃樣品檢測探針點上受體通道信號測量值，"s,"^，'。r表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際敏化受體熒光，"。。"w表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的直接配體發(fā)射熒光，j、，^表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的直接受體發(fā)射熒光強度，m;表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上fret通道信號測量值、似'朋表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上配體通道信號測量值，m'"分別表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上受體通道信號測量值。14、如權(quán)利要求12所述的方法中，包含使用實際的發(fā)射熒光z。，消除fret干擾和熒光串?dāng)_，并通過下列公式計算每個樣品檢測探針點上配體的全部發(fā)射熒光、*■和受體的全部發(fā)射熒光4w，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>15、如權(quán)利要求13所述的方法中，當(dāng)僅含配體的樣品在受體通道中沒有信號，并且僅含受體的樣品在配體通道中沒有信號時，熒光串?dāng)_因子-和^接近0，進(jìn)一步包含使用實際的發(fā)射熒光/s,,w，、/*，和/。■消除fret干擾和熒光串?dāng)_'并通過下列公式計算每個樣品檢測探針點上配體的全部發(fā)射熒光/r。'。'fl。"w和受體的全部發(fā)射熒光^w",:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>16、一種確定與測量系統(tǒng)相關(guān)的校正因子G的方法，包括使用標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的發(fā)射熒光7'&自^^，、7^，和7'Oo"。f，通過下列公式計算校正因子G:廠——J5^w"z^iri:取。r^(53)其中，^，,表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際敏化受體熒光，7;^表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的直接配體發(fā)射熒光，J^",表示標(biāo)準(zhǔn)探針點3上實際的直接受體發(fā)射熒光強度，系統(tǒng)響應(yīng)因子y可以用下式計算-A。"(54)其中，^"是標(biāo)準(zhǔn)探針點2的受體發(fā)射熒光強度，是標(biāo)準(zhǔn)探針點1的配體發(fā)射熒光強度。標(biāo)準(zhǔn)探針點l、2和3是芯片上的標(biāo)準(zhǔn)點，可以在同一張芯片上，也可以在不同芯片上。標(biāo)準(zhǔn)探針點1僅含有配體，不含受體；標(biāo)準(zhǔn)探針點2僅含有受體，不含配體，其數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)探針點l上的配體數(shù)量相同；標(biāo)準(zhǔn)探針點3，含有等數(shù)量的配體與受體。17、如權(quán)利要求16所述的方法，包含利用每個樣品檢測探針點上實際的發(fā)射熒光4融w、4，和[,消除FRET干擾和熒光串?dāng)_，并通過下列公式計算每個樣品檢測探針點上配體的全部發(fā)射熒光^。'。'D。"。r和受體的全部發(fā)射熒光^。m"，'w<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(55)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(56)18、一種確定校正因子^^—2的方法，^。，*2指在雙色微陣列測量中，使用掃描儀的掃描參數(shù)2時的校正因子的數(shù)值，可通過下列公式計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(57)其中，A。，"w表示掃描參數(shù)2時僅含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點上配體通道熒光信號與FRET通道熒光信號的比值，//為比例系數(shù)，可通過下式計算其中，"W"H表示掃描儀的掃描參數(shù)為掃描參數(shù)1時僅含配體的探針點上配體通道熒光信號與FRET通道熒光信號的比值，^a，"^表示掃描參數(shù)！時校正因子G的值。每組掃描參數(shù)包括選擇配體激發(fā)波長的激發(fā)光強度、配體發(fā)射波長的熒光檢測器增益和受體發(fā)射波長的熒光檢測器增益。全文摘要本文所介紹的發(fā)明提供雙色微陣列芯片測量系統(tǒng)中可靠測量熒光信號的方法和儀器。在雙色熒光實驗中使用兩種熒光團(tuán)標(biāo)記樣品時，所提供的方法和儀器可以使用戶校正FRET干擾和熒光串?dāng)_。此發(fā)明中包含校正的方法、計算校正所需系統(tǒng)因子的方法、配套熒光掃描儀和適用于校正過程的微陣列芯片。這些方法通過在Cy5與Cy3之間存在FRET作用的微陣列芯片所證實。文檔編號G01N21/64GK101688838SQ200880000688公開日2010年3月31日申請日期2008年6月11日優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日發(fā)明者徐書寬,疆朱,京程,橙鄧,黃國亮申請人:博奧生物有限公司;清華大學(xué)