專利名稱：檢測人免疫缺陷病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人免疫缺陷病毒感染的診斷和臨床管理。
背景技術(shù)：
盡管事實(shí)是，人免疫缺陷病毒不含有足夠保守以致于容許由抗體介導(dǎo)進(jìn) 行可靠且定量的檢測的抗體表位(即具有足夠長度和免疫原性的肽段)，但是
臨床使用的診斷測試仍涉及人免疫缺陷病毒HIV-l/2殼體蛋白的免疫學(xué)檢測。 現(xiàn)有技術(shù)的問題是，所有全球流動(dòng)的病毒抹以及在單個(gè)受感染個(gè)體內(nèi)的準(zhǔn)種 (quasispecies)都未檢測到。另一個(gè)問題是，當(dāng)前的免疫測定法不能對任何來 源的、具有相同親和力的病毒都按照所得結(jié)合信號(hào)與病毒豐度成正比的方式 來檢測。此外，用于檢測HIV抗原的傳統(tǒng)抗體(參見例如US6，432,633)的結(jié)合 親和力不夠高，導(dǎo)致無法開發(fā)可用于在HIV感染個(gè)體中診斷HIV感染或監(jiān)測 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法隨訪期間病毒載量的足夠靈敏的測定法。盡管HIV抗原檢 測在理論上可以是針對這些診斷需求的較好解決辦法，但由于上述局限，目 前在這方面使用的是基于PCR的方法或血清學(xué)檢測(單獨(dú)或與現(xiàn)有亞最佳抗
體結(jié)合型HIV蛋白中的限制提供了解決方案。
Schupbach等(Journal of Medical Virology, 2001， 65: 225畫232)披露了熱 變性的、擴(kuò)增加強(qiáng)的p24抗原可替代HIV RNA測試來監(jiān)測HIV感染的治療。 Respess等(Journal of Clinical Microbiology, 2005, 43(1): 506-508)和Knuchel 等(Journal of Clinical Virology, 2006, 36: 64-67)也披露了超靈敏的p24抗原 測定法，作為HIV RNA測試的替代。
Boder等(PNAS， 2000, 97(20): 10701-10705)披露了具有單價(jià)飛(10-15) 摩爾抗原結(jié)合親和力的抗體片段的定向進(jìn)化。Holliger和Hudson(Nature Biotechnology, 2005， 23(9): 1126-1136)綜述了工程化抗體片段。Nygren和 Uhlen(Cur認(rèn)t Opinion in Structural Biology, 1997， 7: 463-469)及Hosse等 (Protein Science, 2006， 15: 14-27)綜述了用于分子識(shí)別的蛋白質(zhì)展示支架的 工程化。Binz等(Nature Biotechnology, 2005， 23(10): 1257-1268)和Hey等(Trends in Biotechnology, 2005， 23(10): 514-422)綜述了來自非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的 新結(jié)合蛋白質(zhì)的工程化。
然而，上文所述現(xiàn)有技術(shù)出版物或其組合無一披露本發(fā)明所提供的設(shè)計(jì) 用于結(jié)合p24抗原的長至少兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基的保守表位的生物工程化 高親和力多肽、所述多肽的生產(chǎn)及所述多肽在HIV測定法中的用途。
附圖簡述
圖l. 一個(gè)代表性HIV-I林的p24蛋白的氨基酸序列。該圖顯示p24的多個(gè) 殘基在進(jìn)化枝A-K、 HIV-1主要流行性M型的各種循環(huán)重組病毒、以及O型和 N型病毒和相關(guān)黑猩猩SIV病毒間的相對保守性。得分1指示超過99.75%的保 守性，得分2指示〉99.50%的保守性，得分3指示>99.00%的保守性，得分4指 示>98.00%的保守性，而得分5指示>97.00%的保守性(得分顯示在每一個(gè)殘基 的上方)。X指示在此位置有兩種可選殘基是〉99.75。/。保守的。小于97°/。保守 的殘基沒有給分。得分為1或2的殘基以粗體顯示。潛在的BHAP靶標(biāo)有下劃 線。注意，下劃線肽區(qū)域中所有氨基酸的側(cè)鏈對BHAP識(shí)別的貢獻(xiàn)可能不相 等或根本沒有貢獻(xiàn)。因此，具體BHAP的識(shí)別基序例如可以是WDRxHP。
發(fā)明詳述
i兌明書中^f吏用的一些術(shù)語定義如下。 "抗體"的各種文法形式在本文中統(tǒng)指一群免疫球蛋白分子和/或免疫球
蛋白分子的免疫學(xué)活性部分，即含有抗原結(jié)合位點(diǎn)或互補(bǔ)位的分子。
"抗原結(jié)合位點(diǎn)"、"互補(bǔ)位"指抗體分子中特異性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)部分。 "單鏈抗體"(scFv)用于定義一種分子，其由單一mRNA分子(轉(zhuǎn)錄物)
合成的、其中的抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過接頭肽連成連續(xù)氨基酸鏈。
"免疫測定法"指利用一種或多種抗體對其抗原的反應(yīng)來測量生物學(xué)液 體(通常是血清、血漿、尿液、或其它體液)中的底物水平的生物化學(xué)測試。 該測定法利用抗體對其抗原的特異性結(jié)合。常常使用單克隆抗體，因?yàn)樗鼈?通常結(jié)合待檢測分子上的單一位點(diǎn)，并因此提供更加特異性的和精確的測 試，其不受樣品中其它分子的干擾。所使用的抗體必須具有對抗原的高親和
原的存在。可以通過多種方法來實(shí)現(xiàn)抗原數(shù)量的檢測。最常用的技術(shù)之一是標(biāo)記抗原或抗體。標(biāo)記物可以由酶(酶免疫測定法，EIA)、熒光(FIA)、化學(xué)
發(fā)光(luminescence, LIA)組成，或者它們可以基于凝集、濁度法 (nephelometry)、 比濁法(trubidimetry)或免疫印跡(Western印跡)。
免疫測定法可以是竟?fàn)幮曰蚍蔷範(fàn)幮缘模铱梢允蔷|(zhì)(homogeneous) 或異質(zhì)(heterogeneous)的。在竟?fàn)幮詼y定法中，樣品中的抗原與標(biāo)記抗原竟 爭結(jié)合抗體。然后測量結(jié)合至抗體位點(diǎn)的標(biāo)記抗原的量。這種響應(yīng)與樣品中 的抗原濃度成反比，因?yàn)轫憫?yīng)最大，能與標(biāo)記抗原竟?fàn)幍臉悠分锌乖驮缴佟?br> 在非竟?fàn)幮悦庖邷y定法(常常稱作"三明治式測定法")中，使樣品中的 抗原結(jié)合"捕捉"抗體，并測量這種位點(diǎn)上標(biāo)記抗體的量。與竟?fàn)幮詼y定法 的情況不同，該結(jié)果與抗原的濃度成正比。
異質(zhì)免疫測定法要求額外包括從所述位點(diǎn)(通常使用固相材料)清除未結(jié) 合的抗體或抗原的步驟。均質(zhì)測定法不要求有分離階段來清除未結(jié)合的抗體 或抗原分子。免疫測定法在HIV的診斷中具有特別重要的作用。
縮寫"BHAP"指"生物工程化高親和力多肽"，其是用重組DNA方法 生成并優(yōu)化、且具有結(jié)合配體的能力的分子。例如，單鏈抗體及其衍生物可 充當(dāng)BHAP。
縮寫"COPOS"指"保守多肽結(jié)構(gòu)"，其是通常由兩個(gè)或更多個(gè)甚至在 其它高度可變的蛋白質(zhì)(諸如多種病毒蛋白)中都趨于恒定且能充當(dāng)BHAP配 體的氨基酸殘基形成的結(jié)構(gòu)。COPOS可以與抗原性表位交疊，但是可以不成 為傳統(tǒng)抗體的輩巴。
在用于本文時(shí)，術(shù)語"特異性結(jié)合"、或"特異性識(shí)別"、或表述"具有 對表位的結(jié)合特異性"指BHAP或其片段或衍生物與其靶分子之間的低背景、 高親和力結(jié)合(即無非特異性結(jié)合)。換言之，這些術(shù)語(及等同短語)指，在 有多種蛋白質(zhì)和其它生物制品的異質(zhì)群存在的情況中，結(jié)合模塊(binding moietyX例如受體、抗體、配體或抗配體)優(yōu)先結(jié)合特定靶分子(例如配體或抗 原)的能力(即未顯著結(jié)合測試樣品中的其它成分)。通常，兩個(gè)實(shí)體(諸如配 體與受體)間的特異性結(jié)合是指結(jié)合親和力至少約1(^NT1，更優(yōu)選至少約107、 108、 109、或10l()M-1,更優(yōu)選至少約1011、 1012、 1013、 1014、或10'5M"。
術(shù)語"生物淘選"和"噬菌體展示庫，，在本文中以與US專利申請No. 2005/0074747(Arap等)中相同的方式使用。
另外，抗原的經(jīng)典定義是，引入易感動(dòng)物的組織后能引發(fā)免疫應(yīng)答(例如生成特異性抗體分子)、且能與所生成的特異性抗體結(jié)合的"任何外來物 質(zhì)"?？乖话憔哂懈叻肿恿浚彝ǔＪ堑鞍踪|(zhì)或多糖。多肽、脂質(zhì)、核 酸和許多其它物質(zhì)也能發(fā)揮抗原的功能。更小的稱作半抗原的物質(zhì)，若與較
大的載體蛋白(如牛血清清蛋白、匙孔i戚血藍(lán)蛋白(KLH)或其它合成基質(zhì) (matrices))化學(xué)偶聯(lián)，也可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。多種分子(諸如藥物、簡單的糖 (simple sugar)、氨基酸、小肽、磷脂、或甘油三酯)可發(fā)揮半抗原的功能。因 此，只要時(shí)間足夠，幾乎任何外來物質(zhì)都會(huì)被免疫系統(tǒng)識(shí)別，并激發(fā)產(chǎn)生特 異性抗體。然而，這種特異性免疫應(yīng)答是高度可變的、很大程度上依賴于抗 原的大小/尺寸、結(jié)構(gòu)和組成。引發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答的抗原被稱為強(qiáng)免疫原性。 優(yōu)質(zhì)抗原的特征包括
在該分子內(nèi)具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且化學(xué)性質(zhì)復(fù)雜的區(qū)域。
有重大區(qū)段不存在大范圍重復(fù)單元。
最小分子量8，000-10,000道爾頓，但是在有載體蛋白的情況也用過分子 量低至200 Da的半抗原。
能被免疫系統(tǒng)處理。
有抗體生成機(jī)制可及的免疫原性區(qū)域。
充分區(qū)別于宿主的結(jié)構(gòu)元件。
對于肽抗原，多個(gè)區(qū)域含有至少30。/。的免疫原性氨基酸K、 R、 E、 D、 Q、 N。
對于肽抗原，有顯著親水性的或帶電荷的殘基。
在檢測人免疫缺陷病毒(HIV)的情況中，問題在于病毒的抗原位點(diǎn)總是 快速變化。本發(fā)明的解決方案是，提供手段(means)來制備生物工程化高親和 力多肽(BHAP),其特異性結(jié)合至p24多肽的長至少兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基的 表位，而這是常規(guī)抗體很難或不能檢測到的。如此得到的BHAP可以在檢測 方法中按照抗體使用，因此可用于檢測生物樣品中人免疫缺陷病毒的存在。
本發(fā)明提供了用于檢測生物學(xué)樣品中人免疫缺陷病毒的存在的方法，該 方法包4舌
a) 使所述樣品或其級(jí)分接觸生物工程化高親和力多肽(BHAP)，該 BHAP合理靶向(rationally targeted)結(jié)合HIV的p24多肽中的保守結(jié)構(gòu)決定簇
氨基酸殘基或更多氨基酸殘基的主鏈和側(cè)鏈原^形成 5b) 檢測所述生物工程化高親和力多肽與p24或其片段的復(fù)合物，所述 復(fù)合物的存在指示所述樣品中存在HIV。
COPOS結(jié)合決定簇優(yōu)選位于HIV的p24多肽的下列保守性5-9肽內(nèi)
RTLNAWVK(SEQIDNO: 1),
VGGHQAAMQ(SEQIDNO: 2)，
W D R L H P(SEQ ID NO: 3)，
PRGSDIAG(SEQIDNO: 4)，
G L N K I V(SEQ ID NO: 5)，
VRMYSP(SEQIDNO: 6),
QGPKE(SEQIDNO: 7),
FRDYVDRF(SEQIDNO: 8)，
LRAEQ(SEQIDNO: 9)，
WMTETLL(SEQIDNO: 10),
WMTDTLL(SEQIDNO: 11),
QNANPDC(SEQIDNO: 12),
EEMMTAC(SEQIDNO: 13),和
ACQGVGGP(SEQIDNO: 14)。
然而，本發(fā)明不限于上文這些肽，因?yàn)閷Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是， 通過對已知的p24序列或?qū)⒁l(fā)現(xiàn)的序列的進(jìn)一步計(jì)算分析，可發(fā)現(xiàn)自HIV 的p24多肽衍生的且在本發(fā)明中有用的其它表位?？梢允褂冒被峄蚝塑账?序列比較算法，諸如本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的那些，來進(jìn)行計(jì)算序列同一性比 較。例如，可使用BLASTN算法。
優(yōu)選的是，COPOS結(jié)合決定簇由2-3個(gè)、2-4個(gè)、2-5個(gè)、2-6個(gè)、3-4個(gè)、 3-5個(gè)、3-6個(gè)、2-7個(gè)、或3-7個(gè)相鄰的或不相鄰的氨基酸殘基組成。更優(yōu)選 的是，COPOS結(jié)合決定簇由2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、或7個(gè)相鄰的或不相 鄰的氨基酸殘基組成。
要測試的生物學(xué)樣品優(yōu)選是血液樣品。所述樣品或其級(jí)分優(yōu)選在實(shí)施上 述方法步驟a)之前處在使樣品中的多肽變性的條件下。
另外，本發(fā)明提供了用于生成生物工程化高親和力多肽(BHAP)的方法， 該BHAP能夠特異性結(jié)合HIV的p24抗原的保守區(qū)中長至少兩個(gè)至三個(gè)相鄰 或不相鄰氨基酸的表位，該方法包括以下步驟a) 通過p24抗原的已知氨基酸序列的計(jì)算分析，選擇p24抗原中長至少 2個(gè)氨基酸的保守區(qū)；
b) 制備基于p24抗原中選定的保守區(qū)的肽；
c) 使所述肽與表達(dá)結(jié)合蛋白質(zhì)的微粒文庫接觸，優(yōu)選該文庫是單鏈抗 體的噬菌體文庫；
d) 分離那些表達(dá)具有對所述肽的結(jié)合活性的結(jié)合蛋白質(zhì)的微粒；
e) 對自步驟d)中分離出的微粒獲得或衍生的核酸進(jìn)行誘變；
f) 基于自步驟e)獲得的微粒，制備表達(dá)結(jié)合蛋白質(zhì)的微粒的文庫；
g) 使自步驟f)獲得的文庫接觸所述肽或其片段；
h) 分離表達(dá)結(jié)合蛋白質(zhì)的微粒，所述結(jié)合蛋白對所述肽或其片段的結(jié) 合活性被改善；這種改善的結(jié)合活性例如是更高的親和力或更好的特異性；
i) 將步驟e)至h)重復(fù)一次或多次；
j) 自步驟i)獲得的微粒獲得能夠特異性結(jié)合HIV的p24抗原的保守區(qū) 中長至少2個(gè)至3個(gè)相鄰或不相鄰氨基酸的表位的生物工程化高親和力多肽。
(BHAP)。
本文中用于闡明本發(fā)明背景，特別是提供關(guān)于本發(fā)明實(shí)施的額外詳情的 出版物和其它材料，都收入本文做參考。本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述， 但這些實(shí)施例并非意圖限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
實(shí)施例l
為了鑒定HIV p24中的COPOS決定簇，將公用數(shù)據(jù)庫(諸如http: 〃www.hiv.lanl.gov/content/index)中可得的許多氨基酸序列彼此比對，評(píng)價(jià)每 一氨基酸殘基的相對保守性?；诖朔治?，選出通常短于10個(gè)殘基且含有至 少2個(gè)在超過99°/。的序列中保守的氨基酸的肽用于進(jìn)一步分析(見

圖1)。
通過例如篩選scFv噬菌體文庫(篩選重組抗體文庫的基本原理綜述于 Hoogenboom, Nature Biotechnology 23(9): 1105- 1116)，生成與這些肽結(jié)合 的潛在BHAP分子，之后，使用肽陣列技術(shù)鑒定負(fù)責(zé)此結(jié)合的殘基。然后將 由HIV p24殘基的高度保守集合組成的BHAP識(shí)別基序視為COPOS決定簇。 此類集合通常由2個(gè)至5個(gè)殘基組成，它們在HIV 24多肽鏈中相鄰或不相鄰。 如此，上文所列肽序列(SEQ ID NO: l-14)內(nèi)兩個(gè)或更多個(gè)殘基的任何組合都是將用于HIV p24檢測的潛在COPOS。 實(shí)施例2
使用基于親和力的選擇方法，用含有一個(gè)或多個(gè)潛在COPOS決定簇的合 成肽來篩選能充當(dāng)BHAP前體的大型多肽文庫。例如，在Neri及其同事 (Proteomics 5: 2340-2350, 2005)構(gòu)建的、含有30億種(three billion)重組抗體 克隆的ETH-2-Gold噬菌體展示庫中，篩選能與含COPOS的肽發(fā)生特異性相 互作用的多肽?；诜荌g衍生的多肽的、含有潛在配體結(jié)合多肽的文庫已有 多個(gè)(參見例如Nature Biotechnology 23: 1257-1268, 2005)，也可以從頭設(shè)計(jì)， 并用這樣的文庫篩選多肽，以開發(fā)BHAP。除了用合成肽篩選此類BHAP前 體文庫之外，在親和力選擇中，還使用含有一個(gè)或多個(gè)潛在COPOS決定簇的 重組蛋白、以及變性的HIV殼體蛋白質(zhì)(p24)作為配體。
選出與變性p24以及含指定COPOS的肽都結(jié)合的BHAP前體用于進(jìn)一步 開發(fā)。首先，使用肽陣列4支術(shù)(如JPT Peptide Technologies GmbH的PepSpotTM 肽膜)，闡明BHAP前體的含COPOS的靶肽中結(jié)合決定簇的細(xì)節(jié)，選出與這些 肽中的最保守結(jié)構(gòu)^真實(shí)的COPOS元件)結(jié)合的BHAP前體用于進(jìn)行生物工 程改造。經(jīng)反復(fù)的誘變和親和選擇，如發(fā)明人在他們先前涉及SCA工程的研 究中所描述的(Biochemistry 41: 12729-12738, 2003)， 4吏這些前-BHAP的結(jié) 合親和力最大化，并且在必要時(shí)使它們的結(jié)合特異性進(jìn)一步偏向p24中最保 守的分子決定簇(見圖l)。對BHAP中的結(jié)合表面進(jìn)行隨機(jī)誘變、靶向誘變、 以及兩種誘變的組合，所述隨機(jī)誘變利用上述Biochemistry論文所述易錯(cuò)PCR 或其它類似技術(shù)進(jìn)行。用基于M13衍生性噬菌粒的傳統(tǒng)噬菌體展示方法加輔 助噬菌體介導(dǎo)方法來對改良的BHAP分子進(jìn)行親和選擇和擴(kuò)增，但是也可使 用其它相關(guān)篩選方法。
然后詳細(xì)表征結(jié)合親和力和其它突出特征。能直接使用、或以各種融合 蛋白衍生物的形式用于建立新的p24測定法的最佳BHAP的特征包括l)對熱 變性的HIVp24蛋白有高親和力，優(yōu)選解離常數(shù)低于10"M， 2)同族(cognate) COPOS決定簇在99。/。以上的相關(guān)病毒株中絕對保守，和3)溶解度好、且易于 大規(guī)模重組生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.用于檢測生物學(xué)樣品中的人免疫缺陷病毒(HIV)的存在的方法，該方法包括a)使所述樣品或其級(jí)分與生物工程化高親和力多肽(BHAP)接觸，該BHAP合理靶向結(jié)合p24抗原中的保守結(jié)構(gòu)決定簇(COPOS)，該COPOS由短肽區(qū)，通常是少于10個(gè)殘基的區(qū)域，中至少兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基或更多氨基酸殘基的主鏈和側(cè)鏈原子形成；并b)檢測所述生物工程化高親和力多肽與p24或其片段的復(fù)合物，所述存在復(fù)合物表明所述樣品中存在HIV。
2. 依照權(quán)利要求1的方法，其中所述COPOS結(jié)合決定簇位于HIVp24抗原 中的下列保守5-9肽內(nèi)RTLNAWVK(SEQIDNO: 1)， VGGHQAAMQ(SEQIDNO: 2), WDRLHP(SEQIDNO: 3), PRGSDIAG(SEQIDNO: 4)， GLNKI V(SEQIDNO: 5)， VRMYSP(SEQIDNO: 6)， QGPKE(SEQIDNO: 7), FRDYVDRF(SEQIDNO: 8)， LRAEQ(SEQIDNO: 9)， WMTETLL(SEQIDNO: 10)， WMTDTLL(SEQIDNO: 11)， QNANPDC(SEQIDNO: 12), EEMMTAC(SEQIDNO: 13),和 ACQGVGGP(SEQIDNO: 14)。
3. 依照權(quán)利要求1的方法，其中所述COPOS結(jié)合決定簇由2-3個(gè)、2-4個(gè)、 2-5個(gè)、2-6個(gè)、3-4個(gè)、3-5個(gè)、3-6個(gè)、2-7個(gè)、或3-7個(gè)相鄰的或不相鄰氨基酸殘基組成。
4. 依照權(quán)利要求3的方法，其中所述COPOS結(jié)合決定簇由2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、 5個(gè)、6個(gè)、或7個(gè)相鄰或不相鄰的氨基酸殘基組成。
5. 依照權(quán)利要求1的方法，其中在實(shí)施步驟a)之前使樣品或其級(jí)分的多肽變性。
6. 依照權(quán)利要求1的方法，其中所述生物工程化高親和力多肽具有10-1() 至1 (T15M的對所述表位的親和力。
7. 依照權(quán)利要求1的方法，其中所述生物工程化高親和力多肽是單鏈抗體 或其衍生物。
8. 依照權(quán)利要求1的方法，其中所述生物工程化高親和力多肽是scFv或其書T生凈勿。
9. 依照權(quán)利要求1的方法，其中所述生物工程化高親和力多肽是通過對結(jié) 合多肽進(jìn)行連續(xù)多輪生物淘選而得到的。
10. 依照權(quán)利要求9的方法，其中所述生物淘選是基于噬菌體展示系統(tǒng)的。
11 .依照權(quán)利要求1的方法，其中所述表位沒有免疫原性。
12. 依照權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品是血液樣品。
13. 依照權(quán)利1要求的方法，其中所述生物工程化高親和力多肽帶有標(biāo)記。
14. 用于生成能夠特異性結(jié)合HIV p24抗原的保守區(qū)中長至少兩個(gè)至三個(gè) 相鄰或不相鄰氨基酸的表位的生物工程化高親和力多肽的方法，該方法包括 以下步驟a) 通過對p24抗原的已知氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算分析，選擇p24抗原中長 至少2個(gè)氨基酸的保守區(qū)；b) 制備基于p24抗原中選定的保守區(qū)的肽；c) 使表達(dá)結(jié)合蛋白質(zhì)的微粒文庫接觸所述肽；d) 分離那些表達(dá)具有對所述肽的結(jié)合活性的結(jié)合蛋白質(zhì)的微粒；e) 對自步驟d)中分離出的微粒獲得或衍生的核酸進(jìn)行誘變；f) 基于自步驟e)獲得的微粒，制備表達(dá)結(jié)合蛋白質(zhì)的微粒的文庫；g) 使自步驟f)獲得的文庫接觸所述肽或其片段；h) '分離那些表達(dá)具有改善的對所述肽或其片段的結(jié)合活性的結(jié)合蛋 白質(zhì)的微粒；i) 將步驟e)至h)重復(fù)一次或多次；j) 自步驟i)獲得的微粒獲得能夠特異性結(jié)合HIV p24抗原的保守區(qū)中 長至少2個(gè)至3個(gè)相鄰或不相鄰氨基酸的表位的生物工程化高親和力多肽。
15. 依照權(quán)利要求14的方法，其中所述文庫是單鏈抗體的噬菌體文庫。
16. 依照權(quán)利要求14的方法，其中所述生物工程化高親和力多肽具有1(T12 至1(T"M的對所述表位的親和力。
17. 依照權(quán)利要求14的方法，其中所述肽選自下組 RTLNAWVK(SEQIDNO: 1)， VGGHQAAMQ(SEQIDNO: 2)，W D R L H P(SEQ ID NO: 3), PRGSDIAG(SEQIDNO: 4), GLNKI V(SEQIDNO: 5)， VRMYSP(SEQIDNO: 6), QGPKE(SEQIDNO: 7)， FRDYVDRF(SEQIDNO: 8), LRAEQ(SEQIDNO: 9)， WMTETLL(SEQIDNO: 10), WMTDTLL(SEQ IDNO: 11), QNANPDC(SEQIDNO: 12)， EEMMTAC(SEQIDNO: 13),和 ACQGVGGP(SEQIDNO: 14)。
18. 依照權(quán)利要求17的方法，其中所述表位由2-3個(gè)、2-4個(gè)、2-5個(gè)、2-6 個(gè)、2-7個(gè)、3-4個(gè)、3-5個(gè)、3-6個(gè)、或3-7個(gè)相鄰或不相鄰的氨基酸殘基組成。
19. 依照權(quán)利要求17的方法，其中所述表位由2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、 或7個(gè)相鄰或不相鄰的氨基酸殘基組成。
20. 生物工程化高親和力多肽(BHAP)，通過權(quán)利要求14的方法得到。
21 .權(quán)利要求20的生物工程化高親和力多肽(BHAP)用于檢測生物學(xué)樣品 中的p24抗原的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用生物工程化高親和力多肽檢測人免疫缺陷病毒的方法。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101646944SQ200880002505
公開日2010年2月10日 申請日期2008年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月17日
發(fā)明者卡爾·薩克西拉 申請人:奈克斯特生物醫(yī)學(xué)技術(shù)公司