專利名稱：通過增加報道抗體層積改進抗體譜靈敏度的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢驗生物樣品。本發(fā)明尤其涉及生物樣品的分析方法，包括抗 體譜型分析(antibodyprofiling)。在本發(fā)明的一種實施方式中，對生物樣品的分 析包括用于表征所述生物樣品中個體特異性抗體的抗體譜型分析并同時檢驗 所述生物樣品中一種分析物的組合。
背景技術(shù)：
已知許多方法用于個體鑒別或從這樣的個體所獲得的生物樣品的鑒別。例 如，血液分型是建立在存在于紅細胞表面的抗原的基礎(chǔ)上的。ABO系統(tǒng)涉及 與兩種抗原(A和B)相關(guān)的4種情況。A型個體展示A抗原；B型個體展示B 抗原；AB型個體展示A和B抗原；O型個體既不展示A抗原，也不展示B 抗原。通過分析一個人的血液樣品，可以將該血液歸入這些血型組之一。雖然 這一方法可以用于從一小組個體中鑒別出一個個體，當個體組成的組較大時， 所述方法受到限制，因為具有相同血型的個體之間無法區(qū)分。例如，美國ABO血型的分布大致為45%0、 42%A、 10。/。B和3。/。AB?；谄渌航M抗原或 體液中同工酶的測試具有與ABO血型測試相同的缺點。這些方法可以排除某 些個體，但不能區(qū)分相同血型組的成員。
在親子鑒定以及在涉及移植或輸液手術(shù)的供體和受體相容性的確定中，常 規(guī)使用基于遺傳學的各種免疫學和生物化學測試，這些測試有時也用于幫助人 和動物的鑒定。例如，人白細胞抗原(HLA)基因座位編碼的蛋白質(zhì)的血清學測 試是熟知的。雖然關(guān)于HLA座位的遺傳結(jié)構(gòu)的許多信息是已知的，將HLA血 清學分型用于大組中的個體鑒定存在許多缺點。每一個HLA抗原必須在單獨 的檢測中測試，并且必須對許多這樣的抗原進行檢驗以鑒定一個個體，在一個 大組中鑒別一個個體是一項艱巨的工作。
在過去的十年間，諸如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和聚合酶鏈式反應 (PCR)的基于DNA的分析技術(shù)在用于將生物樣品與個體匹配的司法和親子分 析中迅速獲得了承認。然而，由于需要相對大的樣品量、專門的設備、高度熟 練的技術(shù)人員以及長的分析時間，RFLP技術(shù)存在問題。對于司法應用，通常 沒有適用于此類檢測的足夠樣品，并且在偏遠地區(qū)經(jīng)常沒有所需的設備。此外， 這一技術(shù)可能花費2到6周才能完成，并可能導致犯罪調(diào)查中寶貴時間的延誤。 而且，如果需要篩查許多樣品，RFLP分析的成本可能限制其使用。相對于RFLP 分析，PCR技術(shù)具有要求少得多的樣品量并允許更快速分析的優(yōu)勢，但仍需要
專門的設備和熟練的技術(shù)人員，而且也是昂貴的。
美國專利4,880,750和美國專利5,270,167公開了一種據(jù)稱克服了與DNA分
析相關(guān)的許多缺點的"抗體譜"或"AbP"方法?？贵w譜是建立在每一個體在其體 液中存在一套獨特的抗體這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上的(R.M. Bernstein等，Cellular Protein and RNA Antigens in Autoimmune Disease(自身免疫性疾病中的細胞蛋 白質(zhì)和RNA抗原)，2 Mol. Biol. Med. 105-120 (1984))。在血液、血清、唾液、 尿液、精液、汗液、淚液和身體組織中發(fā)現(xiàn)了這些被稱為"個體特異性抗體"或 "ISA，，的抗4本(A.M. Francoeur, Antibody Fingerprinting: A Novel Method for Identifying Individual People and Animals(抗體指紋識別鑒定個體人類和動物 的新方法)，6 Bio/technology 821-825 (1988))。 ISAs與疾病無關(guān)并被認為是針對 身體的細胞成分的。每個人出生時具有與母親抗體譜相匹配的抗體譜(T.F.Unger & A. Strauss, Individual-specific Antibody Profiles as a Means of Newborn Infant Identification(利用個體特異性抗體譜鑒定新生嬰兒)，15 J. Perinatology 152-155 (1995))。然而，小孩的抗體譜逐漸改變，直至約2歲前獲得穩(wěn)定的獨 特的抗體譜。已經(jīng)顯示，即便是遺傳學上相同的個體也具有不同的抗體譜。個 體的抗體譜在其一生中基本穩(wěn)定，并且不受短期疾病的影響(A.M. Francoeur， 如上)。對具有長期疾病的個體進行的研究還很少。然而，初步結(jié)果指出，雖 然可能出現(xiàn)一些額外的條帶，整個圖譜保持完整。這一技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學領(lǐng)域用 于跟蹤患者樣品并避免樣品混亂。此外，在醫(yī)院中換錯嬰兒或聲稱誘拐的情況 中已經(jīng)使用了該技術(shù)。相較于DNA技術(shù)，所述方法具有許多優(yōu)點，這包括低 成本、快速分析(獲得樣品起2小時)、及其簡易性(不需要專門設備或培訓)。 此外，這一方法將可能用于不含DNA的樣品。
通過將診斷測試結(jié)果與生物樣品的抗體譜相聯(lián)系，WO 97/29206公開了一 種用于診斷測試的鑒定生物樣品來源的方法。通過產(chǎn)生每種生物樣品的抗體 譜，鑒別所述生物樣品的來源。
現(xiàn)在有很多將特異性核酸探針或其他生物分子附著在諸如玻璃、硅、聚甲 基丙烯酸酯、聚合濾器、微球、樹脂等等表面的檢測方法。在所述表面為平面 的一種構(gòu)造中，這些檢測方法有時被稱為"生物芯片"。起初，生物芯片含有以 微陣列形式附著在玻璃或硅基質(zhì)上核酸探針。這些DNA芯片通過最初針對計 算機芯片生產(chǎn)所開發(fā)的微細加工技術(shù)進行制造。領(lǐng)先的DNA芯片技術(shù)包括原 位光化學合成方法(P.S. Fodor, 277 Science 393-395 (1997);美國專利 5,445,934);電化學定位方法(美國專利5,605,662);類似于噴墨打印機的使用噴 霧器將基因探針堆積在芯片上；以及在溶解為基礎(chǔ)的過程中使用凝膠。已經(jīng)在 生物芯片上制作了諸如肽的其他類型分子的陣列(例如，美國專利5,445,934)。
雖然使用抗體譜的已知方法通常適合于其有限的目的，它們帶有某些固有 的缺陷，妨礙其在生物樣品的分析、表征和鑒別中的全面應用。例如，已知方 法依賴于通過電泳分離抗原并隨后將分離的抗原轉(zhuǎn)移至膜上。由于分離過程之 間條件上的差異，在膜上的抗原位置上存在批次間差異，這導致使用一個批次 的膜所獲得的結(jié)果無法與使用另一個批次的膜所獲得結(jié)果進行比較。此外，在 使用比色方法檢測膜上的免疫復合物時，顏色的判斷可能是主觀的，從而不同的觀察者可能對結(jié)果有不同的解讀。
根據(jù)以上所述，提供一種其中試劑的批次間差異和主觀性不影響對結(jié)果的 解讀的用于分析生物樣品的方法會是本領(lǐng)域中的顯著進步。更具體地說，提供 一種通過生物芯片形式的抗體譜分析生物樣品、從而使得分析適于自動化操作 的方法是有益的。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一種實施方式包含一種用于分析含有個體特異性抗體的生物材料 的方法，該方法包括通過將多種抗原以預先選定的圖案附著在固體支持物的 表面形成多種抗原的陣列，從而使得所述多種抗原的相應位置是已知的；獲得 所述生物材料的樣品并將所述陣列與所述樣品接觸，從而使得樣品中所包含的 一部分個體特異性抗體與所述陣列中的抗原反應并結(jié)合以形成免疫復合物；洗 滌含有免疫復合物的固體支持物，從而除去樣品中未與陣列中的抗原反應并結(jié) 合的抗體；以及檢測所述免疫復合物并確定其位置，從而獲得抗體譜。在一種 實施方式中，可以通過使免疫復合物與識別并結(jié)合個體特異性抗體的第一種額 外抗體接觸進行免疫復合物的檢測。在另一種實施方式中，可以使用識別第一 種額外抗體或相互識別的一種或更多種額外抗體。
根據(jù)本發(fā)明的實施方式，免疫復合物的檢測包括處理攜帶附著于其上的免 疫復合物的固體支持物，從而通過與不存在免疫復合物的位點相比較的顏色變 化來表征一個位點上免疫復合物的存在。在一種實施方式中，免疫復合物的檢 測過程進一步包括用用于對與所述樣品接觸前后的色彩圖譜加以比較的固態(tài) 色彩探測電路監(jiān)測所述固體支持物。在另一實施方式中，檢測所述免疫復合物 的過程進一步包括獲得所述陣列與所述樣品接觸前后的色彩照片圖像并分析 由此獲得的像素信息。在本發(fā)明的另一實施方式中，所述固體支持物是一種表 面等離子體共振芯片并且所述免疫復合物的檢測進一步包括在所述陣列與所 述樣品接觸前后掃描所述表面等離子體共振芯片并比較由此所獲得的數(shù)據(jù)。在 本發(fā)明的另一實施方式中，免疫復合物的檢測包括使用電荷耦合裝置獲得圖像 以探測含有熒光發(fā)射的色彩變化。
在本發(fā)明的另一實施方式中，所述方法用作使用 物的測試。本發(fā)明的另一種實施方式包括分析得自法醫(yī)樣品的抗體譜的分析以及與來自疑犯或受害 者的樣品的抗體譜的比較。


圖1顯示了如實施例1的方法所述的從唾液樣品所獲得的示例性的抗體譜。
圖2顯示了如實施例1的方法所述的來自6名個體的成對的唾液和血液抗 體譜的比較。
圖3顯示了如實施例1的方法所述的從來自單一個體的唾液樣品用各種摻 雜物污染后所獲得的抗體譜。
圖4顯示了如實施例1的方法所述的從唾液樣品中可卡因的免疫檢測中所 獲得的示例性結(jié)果。
圖5顯示了如實施例1的方法所述的從唾液樣品中甲基苯丙胺的免疫檢測 中所獲得的示例性結(jié)果。
圖6顯示了在PVDF膜上可卡因免疫檢測的示例性結(jié)果條帶5， 0 ng/ml 可卡因；條帶6，0.1 )ig/ml可卡因；條帶7， 10pg/ml可卡因；條帶8， 1000嗎/ml 可卡因。
圖7顯示了在PVDF膜上甲基苯丙胺免疫檢測的示例性結(jié)果條帶1， 0 Hg/ml甲基苯丙胺；條帶2， 0.1 pg/ml甲基苯丙胺；條帶3， 10 pg/ml甲基苯丙 胺；；條帶4， 1000 ng/ml甲基苯丙胺。
圖8顯示了3名不同個體的抗體譜；每對中的一個條帶不含藥物，每對中 的另一個條帶含1000 |ag/ml的可卡因和甲基苯丙胺。
圖9顯示了使用雙抗體層積方法的不同血清量的抗體譜。條帶A與50微 升血清接觸；條帶B與IO微升血清接觸條帶C與5微升血清接觸；條帶D 與3微升血清接觸；條帶E與1微升血清接觸；條帶F與0.5微升血清接觸； 條帶G與0.1微升血清接觸；以及條帶H與O微升血清接觸。
圖10顯示了使用三抗體層積方法的不同血清量的抗體譜。條帶A與50微 升血清接觸；條帶B與25微升血清接觸；條帶C與15微升血清接觸；條帶D 與7.5微升血清接觸；條帶E與10微升血清接觸；條帶F與2.5微升血清接觸; 條帶G與1微升血清接觸；條帶H與0.5微升血清接觸；條帶I與0.1微升血清接觸；條帶J與O微升血清接觸。
圖11并排顯示.了 3微升血清的抗體譜，其中條帶A是用三抗體方法顯色 的，條帶B是用雙抗體方法顯色的。
圖12顯示了來自圖ll條帶A和B的光密度數(shù)據(jù)。頂端的線是條帶A，較 低的線是條帶B。
發(fā)明詳述
在對用于分析生物樣品的本方法進行詳細描述之前，應當理解，本發(fā)明并
不限于這里所公開的具體構(gòu)造、處理過程和材料，因為這樣的構(gòu)造、處理過程
和材料可以有些改變。也應當理解，這里所采用的術(shù)語僅僅針對描述具體實施
方式的目的而使用并且不具有限制性，因為本發(fā)明的范圍僅由附屬的權(quán)利要求 書及其等價物限定。
這里所提及的用以描述本發(fā)明的背景并提供其實踐的額外細節(jié)的出版物和 其他參考資料由此通過參考整合在本申請中。完全提供了其公開在本申請?zhí)峤?日期之前的這里所述的參考文獻。本申請中沒有內(nèi)容可被解釋為對由于在先發(fā) 明而不認可本發(fā)明人在這樣的公開之前的承認。
必須注意到，如本說明書和附屬的權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式的"一 種"、"一個"和""包括復數(shù)指代物，除非上下文中另有明確規(guī)定。因此，例如，
提及用于分析來自"一只動物"的生物樣品的方法包括對兩只或更多這樣的動 物的指代，對"一個固體支持物"的指代包括對一個或多個這樣的固體支持物的 指代，并且對于"一個陣列"的指代包括對兩個或更多這樣的陣列的指代。
在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，以下術(shù)語將按照以下定義加以使用。
如這里所使用的，"包含"、"包括"、"含有"、"其特征為"、及其語法上的等 價物是包容性的或無限制的術(shù)語，不排除額外的、未歷數(shù)的元件或方法步驟。 "包含"被解讀為包含更高限制性的術(shù)語"由...構(gòu)成"和"主要由...構(gòu)成"。
如這里所使用的，"由...構(gòu)成"及其語法上的等價物將要求中未指明的任何 元件、步驟或成分排除在外。
如這里所使用的，"主要由...構(gòu)成"及其語法上的等價物將要求的范圍限定 為指定的材料或步驟以及那些對所要求的發(fā)明的基本的和新的特征不產(chǎn)生實質(zhì)影響的材料或步驟。
如這里所使用的，"固體支持物"是指在其上安置抗原陣列的通常或基本平 坦的基質(zhì)。固體支持物可以包含適于攜帶陣列的任何材料或材料組合。用于構(gòu) 建這些固體支持物的材料需要滿足一些要求，如(l)存在可以方便地衍生化的表
面基團，(2)對檢測中所使用的試劑的惰性，(3)長期穩(wěn)定，(4)以及與生物樣品
的相容性。例如，適當?shù)牟牧习úＡ?、硅、二氧化?即硅石)、塑料、聚合 物、親水性無機支持物以及陶瓷材料。示例性的塑料和聚合物包括聚四氟乙烯、 聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、以及它們的組合。示 例性的親水性無機支持物包括氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦和氧化鎳。玻璃基質(zhì)的 一個例子可以是顯微鏡載片。用于制造計算機芯片的硅片也被用于制造生物芯
片。參見例如美國專利5,605,662。
如這里所使用的，"陣列"是指固體支持物上位點的排列。所述位點通常會 排列在二維陣列中，但可能具有其他形式。位點的數(shù)量可以處于幾個到至少幾 十萬個的區(qū)間內(nèi)。陣列圖譜和點密度可以改變。例如，使用遺傳微系統(tǒng)公司 (Genetic Microsystems, Woburn, Massachusetts)的市售GMS 417點樣儀，用戶 可以選擇點的大小和密度。在直徑150 nm的點和300 pm的中心間距的條件下， 1平方厘米內(nèi)可以放置1000多個點，并且在常規(guī)顯微鏡載片上可以放置10,000 個以上的點。在200fmi中心間距的條件下，這些數(shù)量提高到每平方厘米2500 點和每張載片25,000以上個點。
如這里所使用的，"顯色性"是指一種用適當?shù)拿赶瘯r產(chǎn)生有色產(chǎn)物的底 物。這樣的有色產(chǎn)物包括熒光和冷光產(chǎn)物。
本發(fā)明中的第一個過程是通過將抗原以預先選定的圖案附著在固體支持物 表面上制備抗原陣列，從而使得陣列中抗原的位置是已知的。如這里所使用的， 抗原是被抗體結(jié)合的物質(zhì)?？乖梢园ǖ鞍踪|(zhì)、碳水化合物、核酸、荷爾蒙、 藥物、受體、腫瘤標記物等等以及它們的混合物?？乖部梢允强乖慕M，如 從排阻色譜柱流出的特定蛋白質(zhì)組份。此外，也可以將表達文庫或隨機表位文 庫的一個特定克隆作為抗原。
在本發(fā)明的一種實施方式中，如A,M. Francoeur等，136 J, Immunol. 1648 (1986)中所述從HeLa細胞中分離抗原。簡言之，HeLa細胞在常規(guī)培養(yǎng)基中在
13常規(guī)組織培養(yǎng)條件下生長。隨后優(yōu)選地用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌融合的
HeLa細胞培養(yǎng)物、用洗滌劑溶解細胞、并離心除去不溶的細胞碎片。上清液 含有約10,000種適于產(chǎn)生陣列的免疫學上不同的抗原。
用于產(chǎn)生陣列的抗原并不要求是已知的。全部的要求是抗原的來源是一致 的，從而能夠產(chǎn)生可重復的陣列。例如，如本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，含有抗原的 HeLa細胞上清液可以用排阻層析柱、電泳凝膠、密度梯度等等進行分離。收 集組份，所收集的每個組份可能代表可用于產(chǎn)生陣列的一套獨特的抗原。因此， 即便所述抗原是未知的，如果使用相同的方法和條件對HeLa細胞抗原進行分 離和分級，可以產(chǎn)生可重復的陣列。
諸如制備隨機肽文庫或表位文庫的其他方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的并可用于可 重復地生產(chǎn)抗原(E.g" J.K. Scott & G,R Smith, Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library(用表位文庫搜尋肽配體)，249 Science 386 (1990); J丄Devlin 等,Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules(隨 機肽文庫特異性蛋白質(zhì)結(jié)合分子的來源)，249 Science 404-406 (1990); S.E. Cwirla等,Peptides on Phage: A Vast Library of Peptides for Identifying Ligands(噬 菌體肽鑒定配體的巨大肽文庫)，87 Proc. Nat，l Acad. Sci. USA 6378-6382
(1990) ; K.S. Lam等，A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-binding Activity(鑒定肽結(jié)合活性的新型合成肽文庫)，354 Nature 82-84
(1991) ; S. Cabilly， Combinatorial Peptide Library Protocols(組合肽文庫策略)(休 馬那出版社(Humana Press), 304頁，1997);美國專利5,885,780)。這樣的文庫可 以通過將合成的寡核苷酸與適當?shù)娜诤鲜删w相連進行構(gòu)建。融合噬菌體是絲 狀噬菌體載體，其中外源序列克隆在噬菌體基因III中并作為基因III蛋白質(zhì) (pIII)的部分展示在病毒粒的一端。每個噬菌體編碼單一的隨機序列并將其作為
與pin融合的復合物表達，其中pin是以每個噬菌體約5個分子的量存在的小
的殼蛋白。例如，在J.K. Scott &6 .81^也(如上)的融合噬菌體技術(shù)中，構(gòu)建了 含有6個氨基酸殘基的可變盒的文庫。與噬菌體蛋白質(zhì)融合的所述6肽模塊提 供了能夠用于一次檢測>1012個噬菌體(或約108-101()個不同克隆)的篩選方法的 文庫，其中每個在病毒粒表面具有一個待測序列。所獲得的文庫用于篩選對特 定6肽序列特異的單克隆抗體。其他研究小組也使用了所述融合噬菌體系統(tǒng)，并且構(gòu)建了含有更長肽插入的文庫。按照本方法所制備的融合噬菌體可以對陣 列中所包含的抗原進行隨機或非隨機的挑選。所挑選的包含所述陣列的融合噬 菌體可以用常規(guī)方法加以繁殖以形成所選擇抗原事實上的不斷供應。
產(chǎn)生抗原的其他方法也是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。例如，通過在表達載體中隨機
克隆DNA片段或cDNA可以制備表達文庫(E.g., R.A. Young & R.W. Davis, Yeast RNA Polymerase II Genes: Isolation with Antibody Probes(酵母RNA聚合物 II基因用抗體探針分離)，222 Science 778-782 (1983); G.M. Santangelo等， Cloning of Open Reading Frames and Promoters from the Saccharomyces cerevisiae Genome: Construction of Genomic Libraries of Random Small Fragments(從釀酒酵母基因組克隆開放讀框和啟動子:構(gòu)建隨機小片段的基因 組文庫),46 Gene 181-186 (1986))。有各種來源的商品化的可用于生產(chǎn)這樣的文 庫的表達載體。例如，可以將HeLa細胞DNA的隨機片段或cDNA克隆入表 達載體，并隨后可以挑選表達HeLa細胞蛋白質(zhì)的克隆。這些克隆隨后可以用 本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法進行繁殖。隨后分離或純化所表達的蛋白質(zhì)并可以在陣列 生產(chǎn)中使用。
另外，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的重組DNA技術(shù)合成抗原。已經(jīng)克隆了編碼 許多病毒、細菌和哺乳動物蛋白質(zhì)的基因，因此可以快速、便宜地合成大量高 純度的蛋白質(zhì)。例如，已經(jīng)克隆了編碼許多真核和哺乳動物膜結(jié)合受體、生長 因子、細胞黏附分子和調(diào)控蛋白質(zhì)的基因，并可用作抗原。通過這樣的重組技 術(shù)生產(chǎn)的許多蛋白質(zhì)(如轉(zhuǎn)化生長因子、酸性和堿性成纖維細胞生長因子、干 擾素、胰島素樣生長因子和來自不同物種的各種白介素)是商品化的。
在大多數(shù)情況下，不需要將完整的多肽用作抗原。例如，含有至少一個表 位(即抗原決定簇或與一種抗體特異性相互作用的抗原的部分)的任何大小多肽 或多肽的一部分足以在陣列中使用。
將無論隨機或非隨機選擇的抗原安置在固體支持物上以形成陣列。所述抗 原在所述固體支持物上的圖案應當是可重復的。即，固體支持物上每個抗原的 位置和身份應是已知的。例如，在10xl0的陣列中，精通本領(lǐng)域的人員可以 將1-100的抗原分別放置在陣列1-100的位置上。
可以使用移液裝置或機器或為了將液體樣品置于固體支持物上所構(gòu)建的裝置將蛋白質(zhì)置于固體支持物表面上的陣列中，例如使用商品化的微點樣儀，如
笛卡爾科技公司(Cartesian Technologies, Inc., Irvine, California)、基因機械公司 (Gene Machines, San Carlos, California)、遺傳微系統(tǒng)公司(Genetic MicroSystems， Woburn, Massachusetts)、基因派克DNA公司(GenePack DNA, Cambridge, UK)、 吉提有限公司(Genetix Ltd., Christchurch， Dorset, UK)、以及派科德儀器公司 (Packard Instrument Company ， Meriden, Connecticut)的產(chǎn)品。
將一系列蛋白質(zhì)抗原排列在表面上的相關(guān)方法包括非接觸按需液滴分配和 噴墨技術(shù)。兩種方法都有商品化的設備。笛卡爾科技公司提供了幾種納升級的 分配設備，能從96、 384、 1536、 3456、和9600孔微平板中分配體積為20 nL 至250 的液體并將其以400點/cm2以下的密度精確放置在表面上。所述設 備能以各種圖案在表面上點樣。如其名稱所表示的，噴墨技術(shù)采用與其在噴墨 打印機中相同的原理。MT公司(Microfab Technologies)提供一種能以各種圖案 將皮升級的液體分配在表面上的10流體頭。本發(fā)明的一種示例性圖案可以是 10 x 10至100 x 100的簡單陣列。
許多方法可以用于將蛋白質(zhì)或其他抗原附著在固體支持物的表面上。其中 最簡單的事是通過疏水、離子、和范德華力的簡單吸附。然而，由于蛋白質(zhì)具 有隨時間從所述表面脫離的傾向，這一方法并不是優(yōu)選的。 一種適用的吸附化 學方法涉及使用雙功能有機硅烷。例如，Thompson和Maragos, 44 J. Agric. Food Chem. 1041-1046 (1996)。有機硅烷的一端與芯片表面上暴露的-OH基團反應形 成硅垸醇鍵。有機硅垸的另一端含有能與蛋白質(zhì)表面諸如-NH2和-SH基團的各 種基團反應的基團。這一將蛋白質(zhì)附著與芯片的方法導致在蛋白質(zhì)和芯片之間 形成共價連接。已經(jīng)用于將蛋白質(zhì)附著與表面的其他合適的方法包括芳香疊氮 基、硝基節(jié)基、和雙吖丙啶光化學方法。以上化學品與紫外線接觸導致形成能 與蛋白質(zhì)反應形成共價鍵的反應性基團。芳香疊氮基化學反應形成能夠插入 C-H鍵的反應性氮烯基團，而雙吖丙啶化學反應形成反應性碳烯基團。硝基芐 基化學反應被稱為鎖定化學，其中鎖定基團滅活反應性分子。與紫外線接觸釋 放所述分子并使其能夠反應。用于將蛋白質(zhì)附著在固體支持物上的其他方法是 本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，例如參見S.S. Wong， Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking(蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)中的化學)(CRC出版社(CRC Press), 340頁，1991)。
將抗原以所選陣列附著在固體支持物上之后，應當通過用適當?shù)囊后w沖洗 對固體支持物進行洗滌以除去未結(jié)合的抗原。用于洗滌的適當?shù)囊后w包括磷酸 緩沖鹽溶液(PBS)及類似溶液，即緩沖在中性或中性附近的相對低離子強度、 生物相容性的鹽溶液。許多這樣的合適的洗滌液是本領(lǐng)域內(nèi)已知的或可由精通 本領(lǐng)域的人員無需過分實驗加以設計。例如參見N.E. Good & S. Izawa, Hydrogen Ion Buffers(氫離子緩沖劑)，24 Methods Enzymology (酶學方法)53-68 (1972)。
隨后對固體支持物進行處理以封閉蛋白質(zhì)和其他分子與所述固體支持物的 非特異性結(jié)合。這一封閉步驟阻止抗原、抗體及其他物質(zhì)與所述固體支持物的 結(jié)合，其中這樣的抗原、抗體或其他分子是不希望結(jié)合的。封閉降低了可能遮 蓋信號的本底，從而增強了信噪比。通過將所述固體支持物在含有與可能以其 它方式發(fā)生非特異性結(jié)合的位點結(jié)合的惰性分子的培養(yǎng)基中孵育，封閉所述固 體支持物。適用的封閉劑的例子包括牛血清白蛋白、人白蛋白、明膠、脫脂奶 粉、聚乙烯醇、Tween 20和各種商品化封閉劑，如SEA BLOCK (ECB公司(East Coast Biologies, Inc., Berwick, Maine)的商標)禾B SuperBlock (皮爾斯化學品 公司(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois)的商標)封閉緩沖液。
在洗滌以從所述陣列除去未結(jié)合的抗原并封閉后，所述固體支持物與待測 的液體樣品接觸。所述樣品可以來自任何產(chǎn)生個體特異性抗體的動物。例如， 人、狗、貓、小鼠、馬、牛、和兔都顯示具有ISA。所述樣品可以來自各種體 液和身體組織，這包括血液、唾液、精液、血清、血漿、尿液、羊水、胸膜液、 腦脊髓液、以及它們的混合物。這些樣品按照本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的方法獲得。根 據(jù)所使用的檢測方法，可能需要處理所述生物樣品以實現(xiàn)最佳反應條件。例如， 可以調(diào)節(jié)離子強度或氫離子濃度或所述生物樣品的濃度以實現(xiàn)最佳的免疫復
合物形成、酶催化等等。
如授權(quán)給Francoeur的美國專利5，270，167中詳細描述的，當ISA與一組隨 機抗原反應時，形成一定數(shù)量的免疫復合物。例如，使用一板約1000種獨特 型抗原，在已經(jīng)稀釋20倍的生物樣品中可以檢測到ISA之間的約30種免疫復 合物。如果所述生物樣品是未稀釋的，能形成的可檢測的免疫復合物的總數(shù)可
17以大于1023。通過選擇"較大的"抗原(即具有多個表位的蛋白質(zhì)而不是肽)，也可以增加可能的免疫復合物的總數(shù)。因此，應當意識到，根據(jù)抗原及其所使用的數(shù)量、生物樣品的稀釋度、以及檢測方法，精通本領(lǐng)域的人員可以控制能形
成并被檢測的免疫復合物的數(shù)量。生物樣品中ISA和陣列中抗原之間形成和不
能形成的獨特的免疫復合物的組構(gòu)成了抗體譜。
檢測抗體/抗原或免疫復合物的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。精通本領(lǐng)域的人員可以對本發(fā)明進行改進以適應本領(lǐng)域內(nèi)己知的各種檢測方法。精通本領(lǐng)域的人員所選擇的具體檢測方法取決于幾個因素，這包括可用的生物樣品量、生物樣品類型、生物樣品的穩(wěn)定性、抗原的穩(wěn)定性、以及抗原和抗體之間的親和力。此外，如上所述，根據(jù)所選用的檢測方法，可能需要對生物樣品加以修飾。
雖然這些技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，以下簡要描述了可以用于實踐本發(fā)明的一些檢測方法的例子。
本領(lǐng)域內(nèi)已知多種免疫檢測法。最常見的免疫檢測法是競爭性和非競爭性
異質(zhì)檢測法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。在非競爭性ELISA中，未標記的抗原與諸如生物芯片表面的固體支持物結(jié)合。生物樣品與結(jié)合在反應池中的抗原結(jié)合，并且生物樣品中的抗體(第一抗體)與所述抗原結(jié)合，形成免疫復合物。免疫復合物形成后，除去過量的生物樣品并洗滌生物芯片以除去非特異性結(jié)合的抗體。所述免疫復合物隨后可以與適當?shù)拿笜擞浀目姑庖咔虻鞍?第二抗體)反應。第二抗體與免疫復合物中的抗體而不是與結(jié)合在生物芯片上的其他抗原反應。與包括人在內(nèi)的不同物種的抗體特異性結(jié)合的第二抗體是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的并且是商品化的，如西格瑪化學品公司(Sigma Chemical Co.， St. Louis,Missouri)和SCB公司(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California)的產(chǎn)品。進一步洗滌后，加入酶底物。與第二抗體相連的酶催化反應，將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。當存在過量抗原時，產(chǎn)物的量與存在于生物樣品中的第一抗體的量直接成正比。產(chǎn)物可以是發(fā)熒光或發(fā)冷光的，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)和裝置加以測量。也可以使用形成有色產(chǎn)物的反應路線，該產(chǎn)物可用分光光度法進行測量。
在本發(fā)明的其他實施方式中，第二抗體可以不加利于檢測的標記?？梢詫臃e額外的抗體(如第三、第四等等)，使得每種額外的抗體特異性地識別先前向免疫復合物所添加的抗體。任何一種這樣的額外抗體(例如第三、第四等等)可以加以標記，從而可以如這里所述的對免疫復合物進行檢測。
夾心或捕獲檢測法也可以用于免疫復合物的鑒別和定量。夾心檢測法是非
競爭性ELISA的鏡像，其中抗體與固相結(jié)合并檢測生物樣品中的抗原。這些
檢測法尤其可用于對以低濃度存在的具有多個表位的抗原的檢測。這一技術(shù)要求固相上(如生物芯片)附著過量抗體。結(jié)合的抗體隨后與生物樣品孵育，并且使得樣品中的抗原與結(jié)合的抗體的形成免疫復合物。所述免疫復合物與酶聯(lián)第二抗體孵育，該抗體識別如同第一抗體的抗原上的相同或不同表位。因此，酶
活性與生物樣品中的抗原數(shù)量成正比。D.M. Kemeny & S丄Challacombe, ELISAand Other Solid Phase Immunoassays(ELISA和其他固相免疫測定法)(1988)。
可以與第二抗體相連的常見的酶包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、6磷酸葡萄糖脫氫酶、堿性磷酸酶、卩-半乳糖苷酶和脲酶。與各種酶相連的二級抗原特異性抗體可從例如西格瑪化學品公司(Sigma Chemical Co.)和ALS公司(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, Illinois)公司購得。
除了酶聯(lián)抗體與生物樣品中的未標記抗體競爭有限的抗原結(jié)合位點以外，競爭性ELISA與非競爭性ELISA類似。簡言之，有限數(shù)量的抗原結(jié)合在固體支持物上。向所述固體支持物添加生物樣品和酶聯(lián)抗體。生物樣品中的抗原特異性抗體與酶聯(lián)抗體競爭與固體支持物結(jié)合的有限數(shù)量抗原。形成免疫復合物后，通過洗滌除去非特異結(jié)合的抗體，加入酶底物，并測量酶活力。不需要第二抗體。由于所述檢測法是競爭性的，酶活力與生物樣品中的抗體量成反比。
本發(fā)明范圍內(nèi)也可以使用另一種競爭性ELISA。在這一實施方式中，來自
生物樣品的有限量的抗體如這里所述與固體支持物的表面結(jié)合。隨后使標記的和未標記的抗原與固體支持物接觸，從而使得標記的和未標記的抗原互相競爭結(jié)合固體支持物表面上的抗體。形成免疫復合物后，通過洗滌除去非特異結(jié)合的抗原。通過與酶聯(lián)第二抗體孵育檢測免疫復合物，所述第二抗體將抗原上相同或不同的表位作為第一抗體加以識別。隨后測試酶活力，獲得與所存在的抗原量成反比的信號。
實踐本發(fā)明的方法時也可以使用勻質(zhì)免疫檢測法。勻質(zhì)免疫檢測可以優(yōu)選用于檢測如荷爾蒙、治療性藥物和非法藥物等不能用其他方法分析的低分子量化合物或高濃度化合物。由于不需要分離步驟，勻質(zhì)檢測尤其有用。R.C.Boguslaski等,Clinical Immunochemistry: Principles of Methods and Applications(臨床免疫化學方法和應用原則)(1984)。
在勻質(zhì)技術(shù)中，對結(jié)合的或未結(jié)合的抗原進行酶聯(lián)。當生物樣品中的抗體與酶聯(lián)抗原結(jié)合時，空間位阻使酶失活。這導致可測量的酶活的喪失。自由抗原(即沒有酶聯(lián)的)與酶聯(lián)抗原競爭有限的抗體結(jié)合位點。因此，酶活與生物樣品中的抗原濃度成正比。
可以在勻質(zhì)免疫檢測中使用的酶包括溶菌酶、神經(jīng)氨酸苷酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠羅蛋白酶、6磷酸葡萄糖脫氫酶以及P-半乳糖苷酶。T.Persoon,Immunochemical Assays in the Clinical Laboratory(臨床實驗室中的免疫化學試驗)，5 Clinical Laboratory Science 31 (1992)。酶聯(lián)抗原可以購得或可以使用本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的各種化學品進行連接，所述化學品包括戊二醛和馬來酰亞胺衍生物。
在先的抗體譜技術(shù)包括堿性磷酸酶標記的第二抗體和5-溴-4-氯-3'-ti引哚基磷酸對甲苯胺鹽(BCIP)及氯化硝基四氮唑藍(NBT)，以上兩種化合物可從諸如皮爾斯化學品公司(Pierce Chemical Co.， Rockford， Illinois)的各種來源購得。酶反應形成堆積在膜表面上的不溶的有色產(chǎn)物，在產(chǎn)生抗原-抗體復合物的地方形成條帶。在生物芯片中這一方法不是最理想的，因為它難以定量，并且比色法通常比基于熒光和冷光的檢測法的靈敏度要低。
實踐本發(fā)明時也可以使用熒光免疫檢測。除了將酶換成稱為熒光團或熒光染料的熒光化合物外，熒光免疫檢測類似于ELISA。這些化合物能夠從入射光中吸收能量并以更長波長和更低能量的光線形式放射能量。通常能方便地與抗原和抗體偶聯(lián)的異硫氰酸鹽形式的熒光素和羅丹明是本領(lǐng)域內(nèi)最常用的。D.P.Stites等，Basic and Clinical Immunology(基礎(chǔ)和臨床免疫學)(1994)。熒光素吸收波長為490至495 nm的光線并發(fā)射520 nm波長的光線。四甲基羅丹明吸收550nm波長的光線并發(fā)射580nm波長的光線。示例性的基于熒光的檢測方法包括ELF-97堿性磷酸酶底物(分子探針公司(Molecular Probes Inc., Eugene,Oregon))、 PBXL-l和PBXL-3 (與鏈親和素偶聯(lián)的藻膽體)(MB公司(MartekBiosciences Corp., Columbia, Maryland))、 FITC和得克薩斯紅(Texas Red)標記的羊抗人IgG(杰克遜免疫研究實驗室(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.,West Grove, Pennsylvania))、以及與鏈親和素偶聯(lián)的B-藻紅蛋白和R-藻紅蛋白(分子探針公司(Molecular Probes Inc.))。 ELF-97是一種無熒光化學品，它被堿性磷酸酶消化形成熒光分子。由于堿性磷酸酶的周轉(zhuǎn)，使用ELF-97底物導致信號放大。與第二抗體相連的熒光分子不表現(xiàn)出這一放大效果。
本領(lǐng)域中也使用約600nm處產(chǎn)生熒光的從藻類分離的藻膽蛋白、卟啉和葉綠素。I. Hemmila, Fluoroimmunoassays and Immunofluorometric Assays(熒光免疫測定和免疫熒光計測定)，31 Clin. Chem. 359 (1985);美國專利4,542,104。藻膽蛋白及其衍生物可以商品名R-藻紅蛋白(PE)和Quantum RedTM購得，例如購自西格瑪化學品公司(Sigma Chemical Co.)。
此外，在免疫檢測中可以使用Cy-偶聯(lián)的第二抗體，并且它們是商品化的。例如，Cy-3在554 nm處最大激發(fā)并發(fā)射568至574nm之間的光。Cy-3比其他熒光團更加親水，并因此具有更低的非特異結(jié)合或聚合的傾向。Cy-偶聯(lián)的化合物可以從ALS公司(Amersham Life Sciences)購買。
示例性的基于冷光的檢測方法包括CSPD和CDP-Star堿性磷酸酶底物(羅氏分子生化公司(Roche Molecular Biochemicals))和SuperSigna媳辣根過氧化物酶底物(皮爾斯化學品公司(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois))。
化學發(fā)光、電發(fā)光和電化學發(fā)光(ECL)檢測方法也是對生物樣品中抗原和抗體進行定量的有吸引力的方法。發(fā)光化合物具有吸收能量的能力，該能量在激發(fā)時以可見光的形式釋放出來。在化學反光中，激發(fā)源是一種化學反應；在電發(fā)光中激發(fā)源是電場；在ECL中電場引起發(fā)光的化學反應。
用于ECL檢測方法的分子通常含有一種有機配體和一種過渡金屬。有機配體與一個或多個過渡金屬原子螯合形成一種有機金屬復合物。各種有機金屬和過渡金屬-有機配體復合物已被用作ECL標記物用于生物樣品中分析物的檢測和定量。由于其熱、化學和光化學穩(wěn)定性、其強烈的光發(fā)射和長的光發(fā)射時間，本領(lǐng)域內(nèi)常用釕、鋨、錸、銥和銠過渡金屬。有機配體的種類很多并包括蒽和多吡啶分子以及雜環(huán)有機化合物。例如，聯(lián)吡啶、二吡唑、三吡啶、菲羅啉以及它們的衍生物是本領(lǐng)域內(nèi)常用的有機配體。本領(lǐng)域內(nèi)常見的有機金屬復合物包括三-聯(lián)吡啶釕(II)，由IGEN公司(IGEN,Inc.， Rockville, Maryland)和西格瑪化學品公司(Sigma Chemical Co)提供商品化產(chǎn)品。
有利的是，ECL可以在水性條件和生理pH值下進行，從而對生物樣品的處理最少。J.K. Leland 等,Electrogenerated Chemiluminescence: AnOxidative-Reduction Type ECL Reactions Sequence Using Triprophyl Amine(電致化學發(fā)光采用三丙胺的氧化還原型ECL反應序列)，137 J. Electrochemical Soc.3127-3131 (1990); WO 90/05296;美國專利5,541,113。而且，通過添加諸如胺的各種輔助因子可以增強這些化合物的發(fā)光。
在實踐中，三-聯(lián)吡啶釕(II)復合物可以例如使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法(包括與賴氨酸氨基基團、半胱氨酸巰基基團和組氨酸咪唑基團相連)與第二抗體相連。在一典型的ELISA免疫檢測中，第二抗體能夠識別與抗原相結(jié)合的ISA,但不識別未結(jié)合的抗原。洗去非特異性結(jié)合的復合物后，三-聯(lián)吡啶釕(II)復合物可以通過化學的、光化學的、以及電化學的激發(fā)方法加以激發(fā)，例如通過對生物芯片通電。例如WO 86/02734。激發(fā)會導致三-聯(lián)吡啶釕(II)復合物的雙氧化反應，這形成可以被例如光電倍增管說探測到的冷光。用于檢測冷光的設備是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的并可以從例如IGEN公司(IGEN， Inc.)處購得。
固態(tài)顏色檢測電路也可以用于監(jiān)測生物芯片上的顏色反應，并且在需要時比較使用樣品前后的顏色圖譜。也可以是使用顏色照片影像并分析像素信息以獲得相同的信息。
另一種檢測方法是使用表面等離子共振(SPR)芯片。在使用樣品前后掃描所述芯片的表面并進行比較。SPR芯片依賴于感興趣的分子暴露于光源時的光折射。每種分子具有其自身的折射率，可由此對其加以鑒定。這一方法要求準確的定位和控制電路以精確掃描芯片。
另一種方法涉及用熒光試劑流動洗滌生物芯片。與生物樣品結(jié)合的微觀位點會發(fā)熒光并用電荷耦合器件(CCD)陣列進行檢測。分析這樣的CCD陣列的輸出以確定與每個樣品相關(guān)的獨特圖譜。這一方法避免了與掃描技術(shù)相關(guān)的問題。對于任何一種方法而言，速度不是問題，因為在幾分鐘內(nèi)發(fā)生樣品與參照物的化合。
此外，陣列掃描儀是商品化的，例如可從遺傳微系統(tǒng)公司(GeneticMicroSystems)購得。GMS 418陣列掃描儀使用激光鏡片將聚焦的光束在生物芯片上快速移動。這一系統(tǒng)使用雙波長系統(tǒng)，含有產(chǎn)生高激發(fā)能量以縮短激發(fā)時
間的高功率固態(tài)激光。在30Hz的掃描速度下，GMS418可以在約4分鐘內(nèi)以10 pm的分辨率掃描一片22x75 mm的載片。
對使用陣列掃描儀所獲得的圖像進行分析的軟件是易于獲得的?？捎玫能浖↖maGene (BD公司(BioDiscovery， Los Angeles, California)); ScanAlyze(可免費使用；由Mike Eisen開發(fā)，斯坦福大學)；De-Array (由國家健康研究所的Yidong Chen和Jeff Trent開發(fā)；與掃描分析公司(Scanalytics， Fairfax, Virginia)的IP Lab共同使用)；Pathways (RG公司(Research Genetics, Huntsville,Alabama)); GEM tools (IP 公司(Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto，California));以及Imaging Research (ALS公司(Amersham Pharmacia Biotech,Inc., Piscataway, New Jersey))。
一旦抗原和ISA之間的相互作用得以鑒定和定量，信號可以數(shù)字化。數(shù)字化的抗體譜作為鑒定生物樣品來源的識別標志。根據(jù)所使用的生物芯片，數(shù)字化的數(shù)據(jù)可以采用多種形式。例如，生物芯片可以包含具有10列和10行組成總數(shù)為100個微位點的陣列。每個微位點含有至少一種抗原。向每個微位點添加含有ISA的生物樣品并進行孵育后，對抗原和生物樣品中ISA的相互作用進行鑒定和定量。在每個微位點中，該位點上的抗原和生物樣品中的ISA的相互作用會形成或不會形成可定量的信號。在一種實施方式中，通過將數(shù)值"O"(如果沒有獲得可定量的信號)或'T，(如果獲得了可定量的信號)賦予100個微位點中的每一個位點，將抗體譜的結(jié)果數(shù)字化。使用這一方法，數(shù)字化的抗體譜含有一組獨特的O和1的組合。
當然可以將數(shù)值"0"或"1"根據(jù)內(nèi)參微位點中所獲得的信號進行標準化，從而可以對較晚獲得的數(shù)字化抗體譜進行正確地比較。例如， 一個或幾個微位點可以含有一種已知的抗原，它會隨時間保持恒定。因此，如果后來的生物樣品是比先前的生物樣品更大或更少稀釋的，使用來自已知抗原的信號可以對信號進行標準化。
精通本領(lǐng)域的人員應當認識到，存在并可以使用其他數(shù)字化抗體譜的方法。例如，所使用的數(shù)值可以是漸增的并與信號強度成正比，而不是將數(shù)值"O"或"l"賦予每個微位點。
23通過數(shù)字化抗體譜信號，可以將生化結(jié)果輸入計算機并快速訪問和參考?？贵w譜數(shù)字化幾秒鐘內(nèi)，計算機可以與先前數(shù)字化的抗體譜進行比較以確定是否存在匹配。如果數(shù)據(jù)庫中存在相匹配的抗體譜，可以對生物樣品的來源作出陽性鑒定。因此，本發(fā)明的方法可以對生物樣品的來源進行區(qū)分和作出陽性鑒定。
在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的方法可以用于對一種生物樣品與犯罪嫌疑人的匹配進行司法分析。從犯罪現(xiàn)場所獲得的法醫(yī)樣品經(jīng)常遭遇樣品受到干燥、小的樣品量、與一個以上個體的樣品混合、摻雜有化學品等等的情況。本發(fā)明提供了快速分析、簡單、低成本以及法醫(yī)樣品與嫌疑人匹配的精確性的優(yōu)點。例如，根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法獲得法醫(yī)樣品和來自一個或多個嫌疑人的樣品。如這里所述的制備每個樣品的抗體譜。隨后對抗體譜進行比較。抗體譜的匹配說明所述法醫(yī)樣品是來自所匹配的嫌疑人。如果沒有獲得抗體譜的匹配，則所有嫌疑人都不是所述法醫(yī)樣品的來源。
在本發(fā)明的另一實施方式中，本發(fā)明所述的方法用于對個體的藥物測試。例如，在許多工作場所中，不使用違禁藥物是獲得或保持工作的一個條件。使用本發(fā)明的方法通過抗體捕獲或類似方法，可以檢測人的血流中違禁藥物的存
在。而且，如WO 97/29206中所述的，在單次測試中可以將藥物測試與樣品的鑒定相關(guān)聯(lián)。在某些動物中(如參加競賽的馬和狗)，藥物測試也是重要的。
在以下實施例中對本發(fā)明進行進一步的描述，這些實施例是出于舉例說明的目的而提供的，并且不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1
執(zhí)法機構(gòu)已經(jīng)表現(xiàn)出對與嫌疑人的藥物檢測相關(guān)的幾種需求，這包括處理與樣品收集相關(guān)的隱私問題、樣品保管鏈的維護、防止嫌疑人對樣品的摻假、以及推動更快的樣品分析時間周期。目前的藥物檢測方案采用尿液樣品和偶爾采用的血液樣品。侵犯隱私是采用尿液樣品的一個持續(xù)性問題，因為必須觀察提供樣品的個體以維護保管鏈并排除樣品調(diào)換或摻假的可能性。尿液樣品也不是目前中毒水平的好的指示物，因為許多藥物代謝物在最初服用所述藥物后的幾天或幾周內(nèi)持續(xù)排入尿液中。雖然血液樣品沒有這些問題，收集血液是一種入侵性過程，要求特別的工具和受過訓練的人員，這在有需求時可能不是總能 得到的。執(zhí)法人員必須對所有收集的樣品保持嚴格的保管鏈，以確保不會發(fā)生 違規(guī)的運作或故意的篡改。保管鏈中的違規(guī)或甚至是感覺上的違規(guī)可能導致證 據(jù)完全被駁回或幾乎不產(chǎn)生效力。
本發(fā)明的實施方式以幾種方式解決這些問題。首先，將抗體譜鑒定與藥物 測試相結(jié)合使得樣品提供者的鑒定與測試形成整體并避免了對復雜的保管過 程鏈的需求。第二，因為唾液中的藥物水平能夠容易地與血液中的藥物水平相
關(guān)聯(lián)(W. Schramm等，Drugs of Abuse in Saliva: A Review(唾液中的濫用藥物回 顧)，16 J. Anal. Toxicology 1-9 (1992); E丄Cone, Saliva Testing for Drugs of Abuse(藥物濫用的唾液檢測)，694 Ann. N.Y. Acad. Sci. 91-127 (1995))，這提供了 目前藥物使用的較好的指示物(D.A. Kidwell等，Testing for drugs of abuse in saliva and sweat(檢測唾液和汗液中的濫用藥物)，713 J. Chrom. B 111-135 (1998))，基于唾液的藥物測試優(yōu)于尿液測試。嫌疑人的唾液樣品也可以在執(zhí)法 人員的視線內(nèi)方便地收集而不會侵犯隱私或使用入侵性方法。最后，所述測試 易于使用并可以由執(zhí)法人員在所在地快速進行，而不要求在遙遠的中心實驗室 需要幾天至幾周的時間。V.S. Thompson等，Antibody profiling as an identification tool for forensic samples(法醫(yī)樣品鑒定工具抗體譜型分析)，3576 Investigation and Forensic Science Technologies 52-59 (1999)。
在這一實施例中，提供了針對兩種常見違禁藥物(可卡因和甲基苯丙胺)的基 于抗體的測試。這些是最常見的濫用藥物，并且其使用呈上升趨勢。S.B. Karch, Drug Abuse Handbook(藥物濫用手冊)(CRC出版社(CRC Press), 1998); L.D. Bowers, Athletic Drug Testing(運動藥物檢測)，17 Sports Pharmacology 299-318 (1998)。
材料和方法。與堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體購自杰克遜免疫研究實 驗室(Jackson ImmunoResearch， West Grove, PA)。兔抗人IgA抗體購自美國生 物公司(U.S. Biological, Swampscott, MA)。 Seablock 、氯化硝基四氮唑藍/5-溴-4-氯-3'』引哚基磷酸對甲苯胺鹽(NBT/BCIP)、對硝基苯磷酸二鈉鹽(PNPP)、 EZ-LinkTM馬來酰亞胺活化的堿性磷酸酶試劑盒、以及FreeZyme⑧偶聯(lián)物純化 試劑盒來自皮爾斯化學品公司(Pierce Chemical, Rockford, Illinois)。針對苯甲酰愛康寧和甲基苯丙胺的單克隆抗體、以及甲基苯丙胺和苯甲酰愛康寧的牛血
清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物購自OEM概念公司(O.E.M Concepts, Toms River, New Jersey)?？煽ㄒ蚝图谆奖符}酸鹽購自西格瑪公司(Sigma-Aldrich， St. Louis, Missouri)?？贵w譜試條購自麥氏公司(Miragen， Inc., Irvine, California)。用于組 合的藥物-抗體譜測試的試條按照A.M. Francoeur， Antibody fingerprinting: a novel method for identifying individual people and animals(抗體指紋識另lj:鑒定個 體人類和動物的新方法)，6 Bio/Technology 822-825 (1988)的實驗方案生產(chǎn)。使 用SDS公司(Saliva Diagnostic Systems, Vancouver, Washington)、 OST公司(Ora Sure Technologies, Inc., Bethlehem, Pennsylvania)、以及薩氏公司(Sarstedt， Inc., Newton, North Carolina)的唾液取樣器從志愿者處收集唾液樣品。
通過對先前用于處理血液樣品的方案進行改進開發(fā)了基于唾液的抗體譜檢 測方、法。T.R Unger & A. Strauss, Individual-specific antibody profiles as a mean of newborn infant identification(利用個體特異性抗體譜鑒定新生嬰兒)，15 J. Perinatology 152-155 (1995)。簡言之，將用1.0 ml PBST(50 mM磷酸緩沖鹽溶 液，0.2。/。Tween 20)稀釋的500 唾液樣品與抗體譜試條孵育至少16小時過夜， 并用PBST洗去過量的樣品。隨后，所述試條接連用100 ng/ml兔抗人IgA孵 育1小時并用100 ng/ml羊抗兔IgG-堿性磷酸酶偶聯(lián)物孵育30分鐘，兩次孵育 之間進行洗滌。所述試條再次用PBST洗滌，并添加堿性磷酸酶的沉淀底物 NBT/BCIP以在試條上顯示條帶。
檢測了 Saliva Sampler (SDS公司(Saliva Diagnostic Systems))和Salivette (薩氏公司(Sarstedt, Inc.))的唾液收集系統(tǒng)與抗體譜檢測法的相容性。Saliva SamplerTM系統(tǒng)包括一個與塑料手柄相連的棉墊。當已經(jīng)收集了足夠的樣品時， 手柄中的窗口變藍。收集后將所述的墊放置在保存緩沖液中。Salivette 是一 個在口腔內(nèi)放置約10分鐘并隨后在塑料管中離心以收集樣品的棉花巻。兩種 取樣器都放置在口腔的牙齦溝中進行樣品收集。作為溫度為-20。C、4。C、和25。C
時保存時間的函數(shù)的樣品質(zhì)量通過對這兩種取樣器收集的樣品進行抗體譜實 驗加以評估。
五名志愿者參加了研究，以比較血液AbP圖譜和從其唾液樣品所獲得的 AbP圖譜。使用人作為對象的研究方案按照愛達荷州國家工程與環(huán)境實驗室制
26度審查委員會的指導。血液樣品收集在含有抗凝劑EDTA的試管中并立即使 用。使用Saliva Sampler 唾液收集系統(tǒng)收集唾液。使用Unger & Strauss的血 液實驗方案(如上)和如上所述的唾液抗體譜檢測方法對成對的血液和唾液樣品 進行分析。
四名另外的志愿者參加了唾液摻雜研究以評估各種食物和飲料對抗體譜檢 測的影響。向所述志愿者提供了奶油硬糖和檸檬硬糖、含糖和無糖口香糖、含 糖和無糖可樂、以及牛奶巧克力。吃了以上物品后，要求志愿者使用所提供的 唾液取樣器收集唾液樣品。也要求志愿者飲酒、喝咖啡、吃他們所選擇的食物、 并在提供樣品前刷牙。 一名吸煙的志愿者在吸了一支煙后提供了樣品。也從這 些志愿者處收集了基準樣品。
按照生產(chǎn)商的實驗方案，使用Pierce EZ-LinkTM馬來酰亞胺活化的堿性磷酸 酶試劑盒將針對甲基苯丙胺和苯甲酰愛康寧的單克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)。 按照生產(chǎn)商的實驗方案，使用FreeZym^偶聯(lián)物純化試劑盒將未偶聯(lián)的抗體與 抗體-酶偶聯(lián)物分離。
針對可卡因和甲基苯丙胺開發(fā)了競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。將甲基 苯丙胺或苯甲酰愛康寧的BSA偶聯(lián)物在pH 9.6的50 mM碳酸鹽緩沖液中稀 釋，并在96孔微滴定平板的每個孔中加入50 ^。 4。C孵育平板過夜以使得偶 聯(lián)物與孔表面結(jié)合。隨后用PBST洗滌平板以除去過量的BSA偶聯(lián)物。然后， 在平板上添加50 nl濃度介于0到1000 pg/ml的可卡因或甲基苯丙胺溶液并添 加50 nl與堿性磷酸酶偶聯(lián)的單克隆抗苯甲酰愛康寧或抗甲基苯丙胺。在這一 步驟中，固定化的BSA藥物偶聯(lián)物與溶液中的游離藥物競爭抗體上的結(jié)合位 點。競爭反應完成后，洗去未結(jié)合的抗體和游離的藥物。最后，在孔內(nèi)添加100 (il溶解的堿性磷酸酶底物(PNPP)溶液以與通過抗藥物抗體與孔表面結(jié)合的堿 性磷酸酶反應。反應20-30分鐘后通過添加25pl3M的NaOH終止反應，并使 用Tecan Spectra平板閱讀器讀取405 nm處每個孔的吸光度。
在Miragen AbP條帶的生產(chǎn)中使用了聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，并將其用于 評估可卡因-和甲基苯丙胺-BSA偶聯(lián)物與其表面結(jié)合的可行性。將PVDF膜切 成與其在抗體譜檢測中所使用的大小相同的試條。對每種藥物準備了4個試條， 在每個試條的3個位點上點上10 pl的一種藥物-BSA偶聯(lián)物以進行一式三份的分析。使用前將試條35°C干燥1小時。試條上的非特異性結(jié)合位點用含有1 mg/ml BSA的PBST封閉1小時并隨后用PBST洗滌。在PBST中制備濃度為 0、 0.1、 10和1000 pg/ml的可卡因和甲基苯丙胺溶液。然后，向試條添加750pl 可卡因或甲基苯丙胺溶液，并加入另外750W與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗苯甲酰愛 康寧或抗甲基苯丙胺抗體并孵育1小時。在此期間發(fā)生游離的和固定化的藥物 之間針對抗體結(jié)合位點的競爭反應，洗滌試條以除去未結(jié)合的抗體和藥物并加 入NBT/BCIP底物。試條顯色15分鐘。
通過將lOpl含甲基苯丙胺和苯甲酰愛康寧-BSA偶聯(lián)物的液滴點在抗體譜 試條的空白的底部并使其35。C干燥1小時準備組合的抗體譜-藥物檢測。使用 Ora Sure取樣器收集來自3名個體的唾液樣品。 一半唾液樣品加入1000pg/ml 的可卡因或甲基苯丙胺。用含1.0 mg/ml BSA的PBST封閉試條1小時并用 PBST洗滌。然后，向試條添加50(Hd加料或未加料的唾液與堿性磷酸酶偶聯(lián) 的抗苯甲酰愛康寧和抗甲基苯丙胺抗體并室溫孵育過夜。用PBST洗滌試條并 如上所述進行抗體譜檢測。
結(jié)果與討論。通過改變試劑濃度、樣品體積以及孵育時間優(yōu)化了基于唾液 的抗體譜檢測。圖1中顯示了由唾液樣品所獲得的抗體譜的示例性結(jié)果。與基 于血液的抗體譜檢測相比，唾液檢測耗費多得多的時間(18小時相對2小時)并 要求多IO倍的樣品量。這是由于與血液相比，唾液中存在的總抗體水平低100 倍。Parry, Tests for HIV and hepatitis viruses(HIV和肝炎病毒的檢測)，694 Annals N.Y.Acad. Sci. 221 (1993)。
使用Saliva SamplerTM或Salivettem系統(tǒng)收集的唾液樣品中存在的抗體的穩(wěn) 定性通過在-20。C、 4°C、和25°C保存并在一周內(nèi)每天進行樣品的抗體譜檢測以 觀察所看到的圖譜是否有任何改變加以確定。使用任何一種取樣器的新鮮的唾 液樣品產(chǎn)生最好的結(jié)果。在所有溫度下，用Saliva Sampler 系統(tǒng)收集的樣品 隨時間的穩(wěn)定性優(yōu)于用Salivette，系統(tǒng)收集的樣品。隨Saliva Sampler 系統(tǒng) 所提供的防腐保存緩沖液看來阻止了由于細菌污染引起的抗體降解，而 Salivette 取樣器不包含防腐劑。
在5天內(nèi)，用Saliva Sampler 系統(tǒng)收集并保持在室溫下的樣品沒有表現(xiàn)出 圖譜的改變。這一結(jié)果與用保存在冰箱中的樣品所得到的相反，后者即便在保存幾小時后就表現(xiàn)出明顯的退化。不清楚為何會發(fā)生。由于冷凍-解凍循環(huán)引 起的損害，冷凍的樣品也表現(xiàn)出一些退化，但在冷凍溫度下長期保存沒有導致
進一步的降解。由于Saliva Sampler 唾液收集系統(tǒng)具有較好的保存特性并更 易于使用，將其用于摻雜研究。
將血液AbP圖譜與唾液AbP圖譜進行比較以確定存在于這些樣品中的ISA 是否相同。結(jié)果顯示，從這兩種不同樣品所得到的圖譜差異明顯(圖2)。這一 結(jié)果有些令人驚訝，因為唾液是血液的濾出液，并且預期存在于唾液中的ISA 應與存在于血液中的相同。不同的圖譜可能源自每一例中所檢査的抗體的同種 型。在血液中分析了IgG抗體，因為它們是最普遍的。在唾液中IgA抗體更為 普遍并進行了分析。獲得上述結(jié)果后，對唾液樣品也進行了IgG抗體分析以確 定是否其圖譜與血液圖譜相同。然而，由于唾液中所存在的IgG抗體水平極低， 沒有取得成功。
唾液摻雜研究顯示，當任何一種摻雜物存在時，實際上抗體譜中沒有發(fā)生 改變(圖3)。在一些情況下， 一個條帶可能更暗或更亮，但看來沒有缺失或額 外的條帶。由于這是初步研究，所檢驗的摻雜物是日常生活中可能使用的易于 獲得的物品。然而，正如互聯(lián)網(wǎng)快速搜索顯示的，存在許多戰(zhàn)勝基于尿液的藥 物檢測的建議方法，包括用由這些網(wǎng)站出售的各種物質(zhì)對樣品進行吸收和摻 雜。這里所顯示摻雜結(jié)果是有前景的，因為看來抗體譜檢測不受通常可以在進 行唾液檢測前消費的食物的影響。
使用直接競爭檢測法開發(fā)了對可卡因和甲基苯丙胺的免疫檢測測試?？贡?甲酰愛康寧抗體用于可卡因檢測；然而，這一抗體對可卡因和苯甲酰愛康寧(可 卡因的主要代謝物)產(chǎn)生相同的反應，因此對檢測結(jié)果不產(chǎn)生影響。在這一檢 測中，存在于樣品中的藥物與固定在微滴定板的孔表面的BSA偶聯(lián)的藥物競 爭酶標抗體上的結(jié)合位點。在高藥物濃度的樣品中，大部分抗體-酶偶聯(lián)物會 與溶液中的藥物結(jié)合并會在最后步驟中被洗去。因此，微滴定平板中會存在極 少的酶并且顯色的量會很低。相反地，如果樣品中沒有藥物，抗體會與固定的 藥物結(jié)合并在洗滌步驟后留在孔內(nèi)，導致強烈的顯色。這導致與藥物濃度成反 比的信號(圖4和5)?？煽ㄒ驒z測的線性區(qū)間為0.1到5pg/ml，甲基苯丙胺檢 測的線性區(qū)間為0.1至lj 10pg/ml。這一區(qū)間涵蓋了目前由藥物濫用和心理健康月艮務署(Substance Abuse and Mental Health Services Administration)所設定的這 些藥物的臨界值(分別為0.3和1.0|ng/ml)。 M. Peat & A.E. Davis, Drug Abuse Handbook(藥物濫用手冊)(CRC出版社(CRC Press, Boca Raton, Fla.)， 1998)。
通過使用ELISA研究過程中所確定的最優(yōu)濃度BSA-藥物偶聯(lián)物，在PVDF 膜上進行了藥物檢測。因為免疫檢測與藥物濃度的相反關(guān)系，當藥物濃度低時 觀察到深色的點，隨著藥物濃度的增加，點逐漸消失(圖6和7)。
由于PVDF膜上的藥物測試是有前景的，評價了將兩種藥物測試與抗體譜 檢測合并的可能性。無論是否存在所述藥物，3名個體的AbP圖譜沒有改變(圖 8)。這一結(jié)果顯示，所述藥物的存在不干擾用于進行抗體譜檢測的試劑。
實施例2
在這一實施例中，遵照實施例1的過程，除了將分組的HeLa細胞抗原以 預先確定的圖案以二維陣列固定在PVDF膜上。此外，可卡因和甲基苯丙胺作 為所述陣列上額外的點固定在所述膜上。如所述的顯色后，結(jié)果基本與實施例 1中的類似。
實施例3
在這一實施例中，遵照實施例2的過程，除了將所述陣列固定在玻璃載片上。
實施例4
如實施例1中制備檢測試條并在PBS中預先封閉。試條隨后與介于50 ^ 至0.1 nl的各種量的血清接觸20分鐘。隨后將試條放入漂白溶液(0.5%體積比 的次氯酸鈉)并用PBS洗滌4次。
在試條經(jīng)受兩步層積操作的情況下，所述試條與兔抗人IgG接觸12分鐘后 用PBS洗滌4次。這些試條隨后與偶聯(lián)有堿性磷酸酶的羊抗兔IgG接觸12分 鐘。隨后洗滌所述試條并如實施例1中所述的進行顯色。兩個抗體層的結(jié)果可 參見圖9，其中在低至1微升血清時可以看到具有一些條帶缺失的可讀圖譜， 并在3微升血清時可以看到完整圖譜。在所述試條經(jīng)受3步層積處理的情況下，所述試條與兔抗人IgG接觸12分 鐘后用PBS洗滌4次。這些試條隨后與羊抗兔IgG接觸12分鐘。所述試條隨 后與偶聯(lián)有堿性磷酸酶的驢抗羊IgG接觸12分鐘。隨后洗滌所述試條并如實 施例1中所述的進行顯色。三個抗體層的結(jié)果可參見圖10，其中在低至0.5微 升血清時可以看到具有一些條帶缺失的可讀的圖譜，在1微升血清時可以看到 完整圖譜。
圖9和10的比較顯示，在提供個體特異性抗體的可讀圖譜方面，三抗體層 積處理比兩層處理提高了靈敏度。
實施例5
如實施例1中制備檢測試條并在PBS中預先封閉。所述試條與3微升血清 接觸20分鐘。隨后將試條放入漂白溶液(0.5%體積比次氯酸鈉)，之后用PBS 洗滌4次。
在所述試條經(jīng)受兩步沉積處理的情況下，所述試條與兔抗人IgG接觸12分 鐘后用PBS洗滌4次。這些試條隨后與偶聯(lián)有堿性磷酸酶的羊抗兔IgG接觸 12分鐘。隨后如實施例1中所述洗滌所述試條并顯色。
在所述試條經(jīng)受三步成績處理的情況下，所述試條與羊抗人IgG接觸12分 鐘后用PBS洗滌4次。這些試條隨后與兔抗羊IgG接觸12分鐘。所述試條隨 后與偶聯(lián)有堿性磷酸酶的驢抗兔IgG接觸12分鐘。隨后如實施例1中所述洗 滌所述試條并顯色。
圖11中并排展示了兩步和三步沉積處理的結(jié)果。試條A是三層試條，試 條B是兩層試條。如圖所示，用三層方法獲得了強得多的信號和靈敏度。
對所述兩種試條進行了光密度分析研究，結(jié)果顯示在圖12中，其中三層試 條是上面的線，兩層試條是下面的線。線的高度表示條帶的強度。如圖12所 示，三層方法對于特定條帶具有增強的讀出值，但在背景噪音中沒有成比例的 增強。因此，三層方法比兩層方法具有提高的靈敏度。
雖然在某些實施方式中已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，本發(fā)明可以在本公開的 精神和范圍內(nèi)作其他的改進。因此，本申請書意味著涵蓋使用其普通原理的本 發(fā)明的任何變化、應用或改裝。此外，本申請書意味著涵蓋那些隨著本發(fā)明所
31屬領(lǐng)域內(nèi)的已知或常規(guī)實踐所產(chǎn)生的并在附屬的權(quán)利要求書的限定之內(nèi)的對 本公開的偏離。
權(quán)利要求
1.一種用于分析含有個體特異性抗體的生物材料的方法，所述方法包括形成一種包含以預先選定的位點模式與固體支持物表面相連的多種抗原的陣列；獲得具有個體特異性抗體的生物材料樣品并將所述陣列與所述樣品接觸使得至少一部分所述個體特異性抗體與所述陣列的所述多種抗原結(jié)合，以形成免疫復合物；洗滌含有所述免疫復合物的所述陣列；通過對所述陣列使用至少三種不同抗體檢測所述免疫復合物；以及鑒定所述陣列上的所述免疫復合物，以獲得抗體譜。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，形成一種陣列包括通過共價鍵 將多種抗原與所述固體支持物相連。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法包括獲得選自下組的 生物材料的樣品組織、血液、唾液、尿液、汗液、淚液、精液、血清、血漿、 羊水、胸膜液、腦脊髓液及其組合。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，形成所述陣列包括多種抗原與 包括玻璃或硅石在內(nèi)的固體支持物相連。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測所述免疫復合物包括處理 所述陣列使得一個位點上免疫復合物的存在情況通過該位點上的顏色變化加 以表征。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，檢測所述免疫復合物包括使用 電荷耦合裝置獲得輸出值，其中所述顏色變化包括熒光或冷光發(fā)射。
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，檢測所述免疫復合物進一步包 括用固態(tài)顏色檢測電路監(jiān)測所述陣列并比較檢測所述免疫復合物前后的顏色 模式。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測所述免疫復合物進一步包 括獲得所述陣列與所述樣品接觸前和檢測所述免疫復合物后的顏色照片圖像， 以及對由顏色照片圖像所獲得的像素信息進行分析。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測所述免疫復合物進一步包 括在所述陣列與所述樣品接觸前后掃描所述陣列，其中所述固體支持物是表面 等離子共振芯片。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，形成所述陣列包括連接為獲 得抗體譜而設置的第一抗原亞組和為檢測所述樣品中所選的分析物而設置的 至少一種抗原的第二亞組。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，連接所述至少一種抗原的第 二亞組包括連接至少一種藥物。
12. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，連接至少一種藥物包括連接選自下組的一種藥物大麻、可卡因、甲基苯丙胺、安非他明、海洛因、甲基睪丸素、甲氫睪酮及其組合。
13. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，獲得一種生物材料的樣品包 括獲得來自法醫(yī)樣品的所述生物材料。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括將由來 自法醫(yī)樣品的所述生物材料所獲得的抗體譜與由來自犯罪嫌疑人的生物樣品 所制備的抗體譜進行比較。
15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過對所述陣列使用至少三種不同抗體檢測所述免疫復合物包括使所述免疫復合物與能夠結(jié)合所述免疫復合物的第一抗體接觸，其中所述 第一抗體來自于不同于所述個體特異性抗體的物種；除去沒有與所述免疫復合物結(jié)合的第一抗體；使與所述免疫復合物結(jié)合的所述第一抗體與能夠結(jié)合所述第一抗體的第二 抗體接觸，其中所述第二抗體來自于不同于所述個體特異性抗體和所述第一抗 體的物種；除去未結(jié)合的第二抗體；使與所述第一抗體結(jié)合的所述第二抗體與能夠結(jié)合所述第二抗體的酶偶聯(lián) 第三抗體接觸，其中所述酶偶聯(lián)第三抗體來自于不同于所述個體特異性抗體、 所述第一抗體和所述第二抗體的物種；除去未結(jié)合的酶偶聯(lián)第三抗體；以及檢測結(jié)合的酶偶聯(lián)第三抗體，以檢測所述陣列上的所述免疫復合物。
16. —種用于檢測包含個體特異性抗體的生物樣品中的一種所選藥物并鑒定所述生物樣品來源的方法，所述方法包括將多種抗原以預先選定的圖案固定在一種固體支持物上； 將可檢測量的一種所選藥物固定在所述固體支持物上，以形成一個陣列； 提供一種包含一種設置為與所述所選藥物結(jié)合的抗體的抗體-酶偶聯(lián)物和一種能夠?qū)@色性底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物的酶；所述陣列與一種生物樣品接觸，以使所述多種抗原中的至少一些與所述生物樣品中的個體特異性抗體結(jié)合，以形成免疫復合物；所述陣列與所述抗體-酶偶聯(lián)物接觸，其中所述抗體-酶偶聯(lián)物競爭性結(jié)合(i)固定在所述陣列上的所述所選藥物，以形成固定化的抗體-酶偶聯(lián)物，和(ii)所述生物樣品中可能存在的任何所選藥物，以形成可溶的藥物-抗體-酶偶聯(lián)物； 洗滌所述固體支持物，以除去至少所述可溶的藥物-抗體-酶復合物； 使所述固體支持物與一種顯色性底物接觸以通過所述固定化的抗體-酶偶聯(lián)物將所述顯色性底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物；測定所存在的所述有色產(chǎn)物的量，其中所述有色產(chǎn)物的所述量與所述生物樣品中的所述所選藥物的量相關(guān)；以及通過對所述固體支持物使用至少三種不同抗體以形成表征所述生物樣品來源的抗體譜檢測固定在所述固體支持物上的所述免疫復合物。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括將所述 抗體譜與來自候選來源的一個或多個候選抗體譜進行比較，其中所述抗體譜與所述一種或多種候選抗體譜的匹配確定所述生物樣品的來源。
18. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，將可檢測量的一種所選藥物 固定在所述固體支持物上包括從下組中選擇所選藥物大麻、可卡因、甲基苯 丙胺、安非他明、海洛因、甲基睪丸素、甲氫睪酮及其組合。
19. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述陣列與一種生物樣品接 觸包括從選自下組的來源獲得一種生物樣品組織、血液、唾液、尿液、汗液、 淚液、精液、血清、血漿、羊水、胸膜液、腦脊髓液及其組合。
20. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括從唾液獲得所述生物樣品。
21. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括固定化來自 HeLa細胞的多種抗原。
22. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括固定化來自隨 機肽文庫的多種抗原。
23. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括固定化來自表 位文庫的多種抗原。
24. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括固定化來自隨 機cDNA表達文庫的多種抗原。
25. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述固體支 持物上固定化多種抗原，其中所述固體支持物包含至少一種選自下組的物質(zhì)-玻璃、硅、硅石、聚合材料、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸 酯、聚甲基丙烯酸酯、陶瓷材料以及親水無機材料。
26. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括在所述固體支 持物上固定化多種抗原，其中所述固體支持物包含選自下組的親水無機材料-氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦和氧化鎳中的至少一種。
27. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，提供所述抗體-酶偶聯(lián)物包括 與堿性磷酸酶偶聯(lián)的所述抗體。
28. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，提供所述抗體-酶偶聯(lián)物包括 與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的所述抗體。
29. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，通過對所述固體支持物使用 至少三種不同抗體檢測固定在所述固體支持物上的所述免疫復合物包括使所述免疫復合物與能夠結(jié)合所述免疫復合物的第一抗體接觸，其中所述 第一抗體來自于不同于所述個體特異性抗體的物種； 除去沒有與所述免疫復合物結(jié)合的第一抗體；使與所述免疫復合物結(jié)合的所述第一抗體與能夠結(jié)合所述第一抗體的第二 抗體接觸，其中所述第二抗體來自于不同于所述個體特異性抗體和所述第一抗 體的物種；除去未結(jié)合的第二抗體；使與所述第一抗體結(jié)合的所述第二抗體與能夠結(jié)合所述第二抗體的酶偶聯(lián) 第三抗體接觸，其中所述酶偶聯(lián)第三抗體來自于不同于所述個體特異性抗體、 所述第一抗體和所述第二抗體的物種；除去未結(jié)合的酶偶聯(lián)第三抗體；以及檢測結(jié)合的酶偶聯(lián)第三抗體，以檢測所述陣列上的所述免疫復合物。
全文摘要
公開了一種用于鑒定法醫(yī)樣品或檢測一種分析物存在的通過抗體譜分析生物樣品的方法。在本發(fā)明的一種實施方式中，所述分析物是一種藥物，如大麻、可卡因、甲基苯丙胺、甲基睪丸素或甲氫睪酮。所述方法包括以預先選定的圖案將抗原與一種固體支持物的表面連接以形成陣列，其中所述抗原的位置是已知的；所述陣列與所述生物樣品接觸使得樣品中的一部分抗體與陣列中的抗原反應并結(jié)合以形成免疫復合物；洗去不形成免疫復合物的抗體；以及檢測所述免疫復合物以形成抗體譜。通過比較來自未知來源的樣品與來自已知來源的樣品鑒定法醫(yī)樣品。此外，諸如測試違禁藥物使用的檢測可以與身份測試相關(guān)聯(lián)，從而使得所述檢測結(jié)果與受試者的身份正相關(guān)。
文檔編號G01N33/53GK101657723SQ200880009863
公開日2010年2月24日 申請日期2008年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日
發(fā)明者V·S·湯普森, W·A·阿佩爾 申請人:巴特勒能源同盟有限公司