專利名稱：測定試劑、使用其的免疫比濁法和待測物分析用具的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及測定試劑、使用其的免疫比濁法和待測物分析用具。
背景技術：
一直以來，作為臨床檢查中的免疫學測定方法，使用酶免
疫分析法(EIA法)、免疫比濁法等。其中，使用膠乳顆粒作為 不溶性載體顆粒的免疫比濁法，由于改良了測定靈敏度(例如， 參照專利文獻l ~ 4),并且能夠利用自動分析儀器，因此近年來 被廣泛〗吏用。
所述使用膠乳顆粒的免疫比濁法也被稱作膠乳凝集免疫比 濁法。該方法是利用以下方式的測定方法使用負載有測定對 象的抗體的膠乳顆粒，所述一皮負載的抗體與待測物中的測定對 象(抗原)發(fā)生抗原抗體反應，從而所述膠乳顆粒凝集。所述 待測物中的測定對象中具有例如j象在體內(nèi)發(fā)生炎癥反應等時血 液中所出現(xiàn)的C反應性蛋白(CRP)那樣的、以4艮寬的濃度范圍 存在于血液中的物質(zhì)。因此，所述使用膠乳顆粒的免疫比濁法， 除了前述的提高靈敏度之外，還被要求能夠在很寬的濃度范圍 內(nèi)對所述測定對象進行定量。因此，提出了例如下述專利文獻 1 ~ 4中所記載的那樣的使用2種膠乳顆粒的方法。
專利文獻l中公開了 一種使用附加有不同量的同 一抗原或 同一抗體的、平均粒徑不同的2種膠乳顆粒的方法。另外，專利 文獻2中公開了以下方法將抗體或抗原致敏后的、平均粒徑不 同的2種以上的膠乳顆?；旌希⒄丈涮囟úㄩL的光。另外，專 利文獻3中公開了 一種使用固定有單克隆抗體的、平均粒徑不同的2種膠乳顆粒的方法。此外，專利文獻4中公開了 一種方法，該方法中使用了將分別用不同的單克隆抗體致敏而成的2種抗體致敏膠乳顆粒以特定比例混合后的物質(zhì)。
專利文獻l:日本特7>昭63 - 14783號7>凈艮
專利文獻2:日本專利第2588174號公報
專利文獻3;曰本凈爭開2005 _ 106609號7>寺艮
專利文獻4:日本專利第3598701號乂>凈艮

發(fā)明內(nèi)容
然而，如所述專利文獻l ~ 3中所公開的那樣的、使用平均粒徑不同的2種l交乳顆4立的免疫比濁法，例如如下所述，難以確保測定對象(抗原)的可測定的濃度范圍和測定靈敏度。即，所述免疫比濁法中，例如，為了確保對于低濃度的測定對象的測定靈敏度，需要增多平均粒徑大的顆粒(大顆粒)的抗體致敏量，減少平均粒徑小的顆粒(小顆粒)的抗體致敏量。然而，若減少對所述小顆粒的抗體致敏量，則為了確保測定對象的可測定的濃度范圍，需要增加抗原抗體反應時的小顆粒量。其結果，膠乳顆粒所需要的成本升高。另外，由于抗原抗體反應時整體顆粒濃度變高，容易發(fā)生非特異性凝集。此外，若過量增加抗原抗體反應時的小顆粒量，則對于低濃度的測定對象的測定靈敏度反而會降低。另一方面，代替增加抗原抗體反應時的小顆粒量，而增加致敏反應時用于致每文小顆粒的抗體量，則測定對象為低濃度的情況下，小顆粒先于大顆粒而更多地與測定對象反應，因此難以確保對于低濃度的測定對象的測定靈敏度。此外，若減少小顆粒量，則可能會發(fā)生前區(qū)現(xiàn)象，另外，由于凝集的顆粒數(shù)減少，所以難以獲得高濃度側的靈敏度。這樣，
濁法中，例如，對最佳平均粒徑的組合、用于致敏膠乳顆粒的抗體的比例、2種膠乳顆粒的混合比例、抗原抗體反應時的膠乳顆粒濃度等的控制很困難，難以確保對于低濃度的測定對象的測定靈敏度和測定對象的可測定的濃度范圍。
另一方面，如所述專利文獻3和4中所/>開的那樣的、使用
負載有單克隆抗體的膠乳顆粒的方法，其目的在于防止前述非特異性凝集和確保測定靈敏度。然而，該方法由于使用單克隆抗體，因此存在成本高的問題。此外，單克隆抗體由于只有一種抗原識別部位，因此除了測定對象抗原為多價或多聚體的情況外，僅使用一種抗體則無法通過抗原抗體反應發(fā)生凝集。因此，在使用單克隆抗體的情況下，需要將多種單克隆抗體進行組合，但由于所選擇的抗體需要滿足相互的抗原識別部位不同、不會接近、不受位阻等條件，因此非常復雜。而且，通常僅單克隆抗體的話，則對于低濃度的測定對象的測定靈敏度較低。另外，膠乳凝集免疫比濁法中，在待測物中的測定對象(抗原)的濃度高的情況下，例如，若所述待測物的稀釋率低，則稀釋后的待測物(測定試樣)中的測定對象的濃度依然4艮高，因此存在測定范圍窄的問題。因此，膠乳凝集免疫比濁法無法像例如使用微芯片的測定方法那樣應用于待測物稀釋率低的測定方法中。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種例如可以抑制不溶性載體顆粒量和單克隆抗體量、提高對于低濃度范圍的測定對象(抗
原)的測定靈敏度、能夠在寬濃度范圍對測定對象進行測定，并且，還能夠應用于試驗片等待測物分析用具的測定試劑，以及使用該測定試劑的免疫比濁法和待測物分析用具。
為了達成所述目的，本發(fā)明的測定試劑的特征在于，其為用于免疫比濁法的測定試劑，所述測定試劑包含含有多個負載有抗體的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群，
所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群，
所述平均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群中，至少
l種不溶性載體顆粒群中所含有的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體，
其他種類的不溶性載體顆粒群中所含有的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
本發(fā)明的免疫比濁法的特征在于，該方法使用了具有不溶性載體顆粒群的測定試劑，所述不溶性載體顆粒群含有多個負載有抗體的不溶性載體顆粒，
通過使作為抗原的測定對象與所述抗體反應，從而使所述不溶性載體顆粒群凝集，作為所述測定試劑，使用本發(fā)明的測定試劑。本發(fā)明的待測物分析用具的特征在于，其為用于免疫比濁
法的待測物分析用具，其具有基板和測定試劑，并且在所述基
板上配置有所述測定試劑，
所述測定試劑為本發(fā)明的測定試劑。
本發(fā)明人等為了達成所述目的，反復進行了一系列的研究。
結果發(fā)現(xiàn)，如果使用以下測定試劑作為測定試劑的話，則能夠
以很少的顆粒量和單克隆抗體量對從低濃度至高濃度的測定對
象(抗原)進行測定，從而完成了本發(fā)明。該測定試劑為包含不溶性載體顆粒群，所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群，其中，至少l種不溶性載體顆粒群負載有多克隆抗體和單克隆抗體，其他的不溶性載體顆粒群負載有所述兩種抗體中的至少一種抗體。根據(jù)本發(fā)明，能夠在很寬的濃度范圍對測定對象進行定量，而且，能夠高靈敏度地測定低濃度的測定對象。另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠利用待測物分析用具等，并且能夠降低成本。


圖l為示出本發(fā)明的實施例中使用各種測定試劑對CRP濃度和吸光度變化量的關系進行測定的結果的圖。
圖2為示出本發(fā)明的其他實施例中使用各種測定試劑對CRP濃度和吸光度變化量的關系進行測定的結果的圖。
圖3為本發(fā)明的待測物分析用具的一個例子，(A)為所述待測物分析用具的平面圖，(B)為所述(A)中所示的待測物分析用具的從I - I方向所觀察的截面圖。
圖4為示出本發(fā)明的其他實施例中使用配置有千系測定試劑的待測物分析用具對CRP濃度和吸光度變化量的關系進行測定的結果的圖。
附圖標記說明
1 待測物分析用具
2a 上基板
2b 下基板
3 試劑部
4 測定部5a、 5b 流路
6 測定試劑
7 貫通孔、導入口
8 開口部
具體實施方式
本發(fā)明的測定試劑中，所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的2種不溶性載體顆粒群，
所述2種不溶性載體顆粒群中，優(yōu)選平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體，
優(yōu)選平均粒徑大的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。另外，本發(fā)明的測定試劑不限于上述形態(tài)，例如，也可以為以下形態(tài)。
即，也可以是以下形態(tài)本發(fā)明的測定試劑中，所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的2種不溶性載體顆粒群，
所述2種不溶性載體顆粒群中，平均粒徑大的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體，
平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
本發(fā)明的測定試劑中，所述不溶性載體顆?？梢詾槟z乳顆
粒o
本發(fā)明的測定試劑中，用于致敏所述平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒的、所述多克隆抗體和所述單
克隆抗體的抗體濃度比優(yōu)選為1: 9~7: 3。
本發(fā)明的待測物分析用具中，用于致敏所述平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒的、所述多克隆抗體和所述單克隆抗體的抗體濃度比優(yōu)選為1: 9~7: 3。本發(fā)明的待測物分析用具，例如，可以為試^r片、測試盒(cartridge)和微芯片中的任意一種。
以下，對本發(fā)明進行詳細說明。但是，本發(fā)明不限于此。
<免疫比濁法>
本發(fā)明的免疫比濁法，如前所述，其特征在于，該方法使用了具有不溶性載體顆粒群的測定試劑，所述不溶性載體顆粒群含有多個負載有抗體的不溶性載體顆粒，通過使作為抗原的測定對象與所述抗體反應，從而使所述不溶性載體顆粒群凝集，作為所述測定試劑， -使用本發(fā)明的測定試劑，即，4吏用如下測定試劑作為所述測定試劑包含含有多個負載有抗體的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群，所述不溶性載體顆粒群包含平
均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群，所述平均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群中，至少l種不溶性載體顆粒群中所含有的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體，
有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
本發(fā)明中，只要使用2種以上平均粒徑不同的不溶性載體顆粒群即可，例如，用以往一^知的^見定的方法求算平均粒徑時，優(yōu)選使用顯示為不同平均粒徑的2種以上的不溶性載體顆粒群。本發(fā)明中，"平均粒徑"的種類沒有特別限定，但通?？梢粤信e數(shù)均粒徑、長度平均粒徑、平均(體積-面積)粒徑(Volume-Surface meandiameter )、 質(zhì)量平均粒徑、體積平均粒徑、表面積平均3f立;f圣、比表面積等^f介4立4圣(equivalent specificsurface diameter )、中值粒徑、眾數(shù)徑等，這些平均粒徑的測定可以采用各自分別對應的公知的測定方法。另外，也可以使用
能通過篩孔大小不同的2種篩子進行分類的2種以上的不溶性載
體顆粒群。
另外，本發(fā)明中，"所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群，，也可以指例如在測定所使用的全部不溶性載體顆粒的粒徑分布時，直方圖中顯示2個以上的峰。即，本發(fā)明中，"包含平均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群的所述不溶性載體顆粒群"可以指例如"其粒度分
ii布具有2個以上的峰的不溶性載體顆粒群"。另外，作為所述粒
度分布的測定方法，可以列舉例如4吏用光學顯凝:4竟或電子顯凝: 鏡的顯微鏡法、光散射法、遮光法、激光衍射法、電阻法、電 感帶法(electric sensing zone method )、 篩分法、液相沉降法、 離心沉降法、慣性碰撞法等。另外，也可以從這種粒度分布算 出平均粒徑。
另外，以各自的平均粒徑作為基準，所述不溶性載體顆粒 群中所含有的平均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群例 如可以含有粒徑為平均粒徑±15%的顆粒，優(yōu)選含有粒徑為平 均粒徑士5 %的顆粒。
所述平均粒徑不同的不溶性載體顆粒群的種類只要為2種 以上，則沒有特別限定，例如為2 5種，優(yōu)選為2 3種，更優(yōu) 選為2種。
所述不溶性載體顆粒群的所述平均粒徑?jīng)]有特別限定，例 如為0.03 2fim, 4尤選為0.05 ~ lpm,更^尤選為0.07 ~ 0.5fim。本 發(fā)明中，例如，4吏用平均粒徑不同的2種顆粒群的情況下，所述 平均粒徑小的顆粒(以下，稱為"小顆粒"。)群的所述平均粒徑 例^口為0.03 ~ 0.2|im， ^尤選為0.05 ~ 0.15fim, 更4尤選為0.07 ~ 0.12|xm,相同情況下，所述平均粒徑大的顆粒(以下，稱為"大 顆粒"。)群的所述平均粒徑?jīng)]有特別限定，例如為0.08 ~ 2fim， 優(yōu)選為0.1 liim，更優(yōu)選為0.12~ 0.5pm。
作為所述不溶性載體顆粒的材質(zhì)，沒有特別限定，可以使 用例如合成高分子等有機化合物、多孔玻璃、硅膠等無機化合 物等。所述不溶性載體顆粒的形態(tài)沒有特別限定，可以列舉例 如膠乳顆粒、珠、板等，優(yōu)選膠乳顆粒。
作為所述膠乳顆粒的材質(zhì)，沒有特別限定，可以列舉例如 聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物等。另外，所述膠乳顆粒例如也可以在顆粒表面附加官能團等。 作為所述官能團，可以列舉例如羧基、氨基、磺基、曱醇基、 酰氨基等。
本發(fā)明中，所述2種以上的不溶性載體顆粒群中，如前所述， 至少l種不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載有多克隆 抗體和單克隆抗體兩者，與其平均粒徑不相同的其他不溶性載 體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體 中的至少任一者。后者的顆粒群，例如，可以僅負載多克隆抗 體和單克隆抗體中的任一者，也可以負載兩者，優(yōu)選多克隆抗 體、或多克隆抗體與單克隆抗體兩者，更優(yōu)選所述兩者。本發(fā) 明中，使用平均粒徑不同的2種不溶性載體顆粒群的情況下，例 如，可以使所述小顆粒負載多克隆抗體和單克隆抗體兩者，使 所述大顆粒負載多克隆抗體和單克隆抗體中的至少任一者。另 外，也可以與之相反，例如，使所述小顆粒負載多克隆抗體和 單克隆抗體中的至少任一者，使所述大顆粒負載多克隆抗體和 單克隆抗體兩者。其中，所述小顆粒優(yōu)選負載多克隆抗體和單 克隆抗體兩者，所述大顆粒優(yōu)選負載多克隆抗體或單克隆抗體 中的至少任一者，更優(yōu)選負載多克隆抗體、或多克隆抗體與單 克隆抗體兩者。
負載有多克隆抗體和單克隆抗體兩者的所述不溶性載體顆 粒中，所負載的所述多克隆抗體與單克隆抗體的比率沒有特別 限定。作為具體例子，在所述小顆粒的情況下，多克隆抗體 單克隆抗體例如優(yōu)選為l: 9~7: 3,更優(yōu)選為l: 9~5: 5。另 一方面，在大顆粒的情況下，所述多克隆抗體單克隆抗體例 如優(yōu)選為l: 9~5: 5。另外，所述不溶性載體顆粒所負載的所 述多克隆抗體與單克隆抗體的比率例如為重量比或抗體分子數(shù) 的比。
13定，例如可 以用抗體致壽丈所述顆粒而進行。所述抗體對所述顆粒的致l丈反 應沒有特別限定，可以使用例如物理吸附法或化學結合法等公 知的方法等而適當實施。另外，在所述不溶性載體顆粒的表面 附加有所述官能團的情況下，例如，可以在對所述官能團進行 了活化處理后，進行所述致敏反應。
在所述致敏反應時，所述不溶性載體顆粒的濃度沒有特別 限定。所述不溶性載體顆粒的濃度是指例如，在進行用所述 抗體致敏所述不溶性載體顆粒的反應時，致敏反應液中的不溶
性載體顆粒的濃度。所述不溶性載體顆粒濃度例如為0.001 ~ 5w/v%, ^尤選為0.01 ~ 2w/v% ，更4尤選為0.1 ~ lw/v% 。
所述致敏反應中，多克隆抗體或單克隆抗體相對于所述不 溶性載體顆粒的濃度沒有特別限定，例如，可以根據(jù)所述不溶 性載體顆粒的濃度而適當決定。所述抗體的濃度是指例如， 在進行所述抗體致敏所述不溶性載體顆粒的反應時，致敏反應 液中的抗體的濃度。使所述大顆粒負載多克隆抗體的情況下， 例如，含有l(wèi)w/v。/c不溶性載體顆粒的所述反應液中的所述多克 隆抗體的濃度例A。為0 ~ 2mg/mL, <尤選為0.001 ~ 2mg/mL,更 優(yōu)選為0.005 ~ 1.5mg/mL,進一 步優(yōu)選為0.01 ~ lmg/mL。另夕卜， 使所述大顆粒負載單克隆抗體的情況下，例如，含有l(wèi)w/v。/。不 溶性載體顆粒的所述反應液中的所述單克隆抗體的濃度優(yōu)選為
0 ~ 2mg/mL,更優(yōu)選為0 ~ 1.5mg/mL,進一 步優(yōu)選為0 ~ lmg/mL。 另一方面，使所述小顆粒負載多克隆抗體的情況下，例如，含 有l(wèi)w/v%不溶性載體顆粒的所述反應液中的所述多克隆抗體的 所述4元體;農(nóng)度例^口為0 2mg/mL, <尤選為0.001 ~ 2mg/mL,更 優(yōu)選為0.005 ~ lmg/mL，進一 步優(yōu)選為0.01 ~ 0.5mg/mL。另夕卜， 使所述小顆粒負載單克隆抗體的情況下，例如，含有l(wèi)w/v。/。不20
溶性載體顆粒的所述反應液中的所述單克隆抗體的濃度，例如
為0 ~ 2mg/mL , 優(yōu)選為0.001 ~ 2mg/mL ， 更優(yōu)選為0.005 ~ 1.5mg/mL,進一 步優(yōu)選為0.01 ~ lmg/mL。
使所述不溶性載體顆粒負載多克隆抗體和單克隆抗體兩者 的情況下，所述致敏反應時的所述全部抗體的濃度沒有特別限 定。使所述小顆粒負載兩種抗體的情況下，例如，含有l(wèi)w/v。/。 不溶性載體顆粒的所述反應液中的全部抗體的濃度例如為 0.001 ~ 5mg/mL , 優(yōu)選為0.01 ~ lmg/mL , 更優(yōu)選為0.1 ~ 0.5mg/mL。使所述大顆粒負載兩種抗體的情況下，例如，含有 lw/v%不溶性載體顆粒的所述反應液中的全部抗體的濃度例如 為0.001 ~ 5mg/mL , 優(yōu)選為0.01 ~ 2mg/mL , 更優(yōu)選為0.1 ~ lmg/mL。
另外，如前所述，使所述不溶性載體顆粒負載多克隆抗體 和單克隆抗體兩者的情況下，所述致敏反應時，所述多克隆抗
特別限定。所述抗體濃度比是指例如，在進行所述兩抗體致 敏所述不溶性載體顆粒的反應時，致壽丈反應液中的所述兩抗體 濃度比(多克隆抗體單克隆抗體)。另外，所述抗體濃度比例 如為重量比。使所述大顆粒負載所述多克隆抗體和單克隆抗體 的情況下，例如，含有l(wèi)w/v。/。不溶性載體顆粒的所述反應液中 的所述多克隆抗體與所述單克隆抗體的抗體濃度比沒有特別限 定，例如優(yōu)選為l: 9~5: 5。另一方面，使所述小顆粒負載所 述多克隆抗體和所述單克隆抗體的情況下，例如，含有l(wèi)w/v。/。 不溶性載體顆粒的所述反應液中的所述多克隆抗體與所述單克 隆抗體的濃度比例如優(yōu)選為1: 9~7: 3,更優(yōu)選為l: 9~5: 5。 作為所述抗體，只要是與作為測定對象的抗原發(fā)生抗原抗 體反應的抗體即可，可以列舉例如Fab、 Fab，、 F(ab，)2等抗體片段、免疫球蛋白分子等。所述多克隆抗體可以使用以往公 知的方法從例如小鼠、兔、山羊、綿羊、雞等來源的血清中采 集，或者也可以是市售的各種抗體。另外，所述單克隆抗體也 沒有特別限定，例如，可以使用市售的各種抗體，也可以適當 使用通過采用了細胞融合技術或基因重組技術等公知方法而制 作的抗體。
接著，就本發(fā)明的免疫比濁法，示出具體方法的一個例子， 但本發(fā)明不限于此。
首先，使用前述2種以上的不溶性載體顆粒群，使這些顆粒 所負載的抗體與待測物中的測定對象(抗原)發(fā)生抗原抗體反 應，使所述不溶性載體顆粒群凝集。
作為所述測定對象(抗原)，只要可以發(fā)生抗原抗體反應， 則沒有任何限制。作為具體例子，可以列舉例如C反應性蛋白、 ASO (抗《連球菌溶血素0 )、類風濕因子、HbAlc、肌酐、肝炎 病毒、各種酶等。
含有所述測定對象(抗原)的待測物沒有特別限定，可以 列舉例如臨床檢查中的一般的待測物。作為所述待測物，可以 列舉例如全血、血細胞、血清、血漿、尿等生物試樣。本發(fā)明 中，例如，可以將所采集的所述待測物直接作為測定試樣使用， 也可以將在抗原抗體反應之前預先對待測物實施了稀釋處理、 過濾處理、加熱處理等的待測物作為測定試樣^吏用。作為用于 所述稀釋處理的溶劑，沒有特別限定，可以列舉水、生理鹽水、 緩沖液等。作為所述緩沖液的緩沖劑，例如，只要不妨礙所述 反應即可，可以列舉例如MES(2-(N-嗎啉代)乙石黃酸)、磷酸、 三羥甲基氨基甲烷(Tris)等。所述緩沖液中例如還可以添加 其他成分，例如，為了穩(wěn)定反應，可以添加BSA (牛血清白蛋 白)等。另外，所述稀釋處理中的待測物的稀釋率沒有特別限定，例如，在使用后述那樣的試驗片的測定的情況下，也可以 為低稀釋率，作為稀釋率的具體例子，例如優(yōu)選為5 100倍，
更優(yōu)選為10 80倍，進一步優(yōu)選為15 ~ 50倍。
作為使負載有所述抗體的不溶性載體顆粒與所述測定對象 (抗原)發(fā)生抗原抗體反應的方法，沒有特別限定，例如，可 以使用/>知的方法。作為所述反應方法，例如，可以向所述測 定試樣中添加分散有所述不溶性載體顆粒群的分散液而進行反 應，也可以向所述不溶性載體顆粒群中添加所述測定試樣而進 行反應。后者的情況下，所述不溶性載體顆粒群例如可以是分 散液，也可以是干燥狀態(tài)。作為所述后者的方法，例如可以應 用后述的試驗片、微芯片、測試盒等待測物分析用具。具體而 言，將所述不溶性載體顆粒群以例如分散液或干燥狀態(tài)預先配 置在基板的試劑部，向所述試劑部添加所述測定試樣，從而能 夠進行抗原抗體反應。
限定。所述不溶性載體顆粒濃度是指例如，在所述不溶性載 體顆粒的抗體與測定對象發(fā)生抗原抗體反應時，抗原抗體反應 液中的不溶性載體顆粒的濃度。作為所述不溶性載體顆粒濃度， 例如優(yōu)選為O.Oll ~ lw/v% ,更優(yōu)選為0.033 ~ 0.5w/v% ,進一步 優(yōu)選為0.055 ~ 0.3w/v% 。另外，所述不溶性載體顆粒濃度中， 所述小顆粒群的所述顆粒濃度優(yōu)選為O.Ol ~ 0.5w/v% ,更優(yōu)選 為0.03 ~ 0.3w/v% ,進一步優(yōu)選為0.05 ~ 0.2w/v% 。另夕卜，所述 不溶性載體顆粒濃度中，所述大顆粒群的顆粒濃度優(yōu)選為 0.001 ~ 0.05w/v% ，更優(yōu)選為0.003 ~ 0.04w/v% ，進一步優(yōu)選為 0.005 ~ 0.03w/v% 。
所述抗原抗體反應時，所述小顆粒群的顆粒與所述大顆粒 群的顆粒的比例沒有特別限定。作為具體例子，所述小顆粒群
17的顆粒與所述大顆粒群的顆粒的重量比優(yōu)選為100: 1~1: 100， 更優(yōu)選為10: 1-1: 10,進一步優(yōu)選為5: 1~1: 5。
作為具體例子，以血液作為待測物，將用于通過免疫比濁 檢測CRP的反應液的條件示于以下，但本發(fā)明不限于此。所述 抗原抗體反應時的所述不溶性載體顆粒濃度沒有特別限定。所 述不溶性載體顆粒濃度是指例如，在所述不溶性載體顆粒的 抗體與測定對象發(fā)生抗原抗體反應時，抗原抗體反應液中的不 溶性載體顆粒的濃度。作為所述不溶性載體顆粒濃度，例如優(yōu) 選為O.Oll ~ lw/v% ，更優(yōu)選為0.033 ~ 0.5w/v% ，進一步優(yōu)選為 0.055 ~ 0.3w/v% 。另外，所述不溶性載體顆粒濃度中，所述小 顆粒群的所述顆粒濃度^尤選為0.01 ~ 0.5w/v% ，更優(yōu)選為0.03 ~ 0.3w/v%，進一步優(yōu)選為0.05 ~ 0.2w/v% 。另夕卜，所述不溶性載 體顆粒濃度中，所述大顆粒群的顆粒濃度優(yōu)選為0.001 ~ 0.05w/v%,更優(yōu)選為0.003 ~ 0.04w/v% ，進一步優(yōu)選為0.005 0.03w/v。/0。
接著，測定前述的抗原抗體反應。即，例如，通過檢測由
度，乂人而測定所述抗原抗體反應。由此，可以間^妾地定量所述 測定對象。
作為所述抗原抗體反應的測定方法，沒有特別限定，例如， 可以列舉通過光學方法測定抗原抗體反應后的反應液的吸光度 或散射光等的方法。所述光學方法中，例如，可以z使用通用的 光學測定儀器。另外，測定結果的評價方法也沒有特別限定， 例如，可以將所述抗原抗體反應的反應開始后一定時間內(nèi)的吸 光度變化量作為指標。此時，作為所述反應開始后一定時間， 沒有特別限定，優(yōu)選反應開始后0 5分鐘，更優(yōu)選30 180秒， 進一步優(yōu)選30 ~ 150秒。所述定量，例如，可以基于含有已知濃度的測定對象的標 準試樣的標準曲線而進行。作為具體例子，首先，準備多種設 定為目標濃度范圍的標準試樣，使這些標準試樣在同樣的條件
下發(fā)生抗原抗體反應，檢測其凝集程度。然后，由表示所述凝 集程度的吸光度等的測定值和所述已知濃度制作標準曲線，并 將待觀'J物的測定值代入所述標準曲線，從而定量所述待測物中 的測定對象。
<測定試劑〉
本發(fā)明的測定試劑為用于本發(fā)明的免疫比濁法的測定試 劑，含有前述的所述不溶性載體顆粒群。本發(fā)明的測定試劑只 要含有前述的所述不溶性載體顆粒群，則其他構成和條件沒有 任何限制。另外，只要沒有特別表明，則如所述本發(fā)明的免疫 比濁法中所述。
本發(fā)明中，所述2種以上的不溶性載體顆粒群各自的含有比 例沒有特別限定，例如，將本發(fā)明的測定試劑用于免疫比濁法
的免疫比濁法中所述那樣的條件的方式而含有所述各顆粒群。
本發(fā)明的測定試劑，除了所述不溶性載體顆粒群以外，還 可以含有例如如前所述的緩沖劑、分散劑、穩(wěn)定劑等。另外， 本發(fā)明的測定試劑例如可以是千燥體，也可以是液體。 <待測物分析用具〉
本發(fā)明的待測物分析用具，如前所述，其特征在于含有本 發(fā)明的測定試劑。具體而言，本發(fā)明的待測物分析用具的特征 在于，其為用于免疫比濁法的待測物分析用具，其具有基板和 測定試劑，并且在所述基板上配置有所述測定試劑，所述測定 試劑為本發(fā)明的測定試劑。本發(fā)明的待測物分析用具只要含有 本發(fā)明的測定試劑，則其他構成和條件沒有任何限制。本發(fā)明的待測物分析用具中，所述測定試劑例如才艮據(jù)其形態(tài)，可以以 干燥體形式進行配置，也可以以液體(分散液)形式進行配置。 本發(fā)明的待測物分析用具的形態(tài)沒有任何限定，可以列舉 例如測試盒、試驗片、微芯片等芯片等。所述待測物分析用具，
優(yōu)選能夠連接到例如用于#r測通過前述那樣的抗原抗體反應的 凝集程度的通用的測定4義器上。作為所述測試盒，例如可以列 舉以下形態(tài)所述基板具備配置有所述測定試劑的試劑槽。關 于所述測試盒，例如，在連接到所述測定儀器上之前或之后， 將測定試樣導入配置有所述測定試劑的所述試劑槽，在抗原抗 體反應后，通過所述測定儀器，可以測定所述試劑槽內(nèi)的凝集 程度。另夕卜，關于所述測試盒，例如，所述基斧反可以進一步具 有通過流^各而與所述試劑槽連結的反應槽。此時，可以向所述 試劑槽導入測定試樣，使所述測定試樣與所述測定試劑的混合 液通過所述流^各而移動到所述反應槽中，/人而測定所述反應槽 內(nèi)的凝集程度。配置于所述測試盒的所述試劑槽中的所述本發(fā) 明的測定試劑，例如可以是液體(分散液)，也可以是干燥體。 另外，作為所述試驗片，例如可以列舉在長方形等的基板上 配置有具有本發(fā)明的測定試劑的試劑部的形態(tài)。作為所述試劑 部的材質(zhì)，可以列舉例如濾紙或各種聚合物制的多孔質(zhì)體。這 種試驗片，例如，將測定試樣添加到配置有所述測定試劑的所 述試劑部，在抗原抗體反應后，通過所述測定4義器，可以測定 所述試劑部中的凝集程度。在所述試驗片中，所述本發(fā)明的測 定試劑優(yōu)選例如以干燥狀態(tài)進行配置。例如，在將所述多孔質(zhì) 體等配置于所述基板之前或之后，向所述多孔質(zhì)體等供給分散 液狀的所述測定試劑，然后將其干燥即可。另外，所述微芯片 等芯片例如可以列舉以下形態(tài)所述基板具有試樣的導入口 、 試劑部和流^各，所述導入口和所述試劑部通過所述流^各而連結。
20這種芯片，例如，^v所述導入口導入測定試樣， -使所述測定試 樣通過所述流^各向所述試劑部移動，在所述試劑部進行抗原抗 體反應后，通過所述測定4義器，可以測定所述試劑部內(nèi)的凝集 程度。配置于所述芯片的所述試劑部的所述本發(fā)明的測定試劑， 例如可以為液體，也可以為干燥體。另夕卜，這些^f寺測物分析用 具的例如所述試劑部或試劑槽根據(jù)需要可以進 一 步含有用于檢 測;疑集體的纟企測試劑。
以下，結合比較例而對本發(fā)明的實施例進行說明。另夕卜， 本發(fā)明不受以下的實施例和比較例的限制。
〔實施例1 〕
本例中，作為平均粒徑不同的不溶性載體顆粒群，使用負 載有單克隆抗體和多克隆抗體的小顆粒群、和負載有多克隆抗
體的大顆粒群，通過下述A和B工序，調(diào)制測定試劑。 A.不溶性載體顆粒的調(diào)制
本例中，使用平均粒徑0.096pm的羧基改性聚苯乙烯膠乳 顆粒(ceradyne， inc.制)作為所述小顆粒群的不溶性載體顆粒 (小顆粒)，使用平均粒徑0.213pm的羧基改性聚苯乙烯膠乳顆 粒(ceradyne， inc.制)作為所述大顆粒群的不溶性載體顆粒(大 顆粒)。首先， 一邊攪拌含有所述小顆粒的下述組成的活化液一 邊混合，在室溫(25°C )下反應l小時，使顆粒表面的官能團活 化。反應結束后，離心分離(6000rpm, 15分鐘)，除去上清， 將活化了官能團的所述小顆粒懸浮于4mL 5Ommol/L MES緩沖 液(pH6.1)中，用超聲波使其再分散，然后清洗。再次進行所 述清洗操作后，離心分離(6000rpm, 15分鐘)，除去上清。使 用5Ommol/L MES緩沖液(pH6.1 )懸浮所獲得的所述小顆粒， 用超聲波使其再分散，獲得小顆粒的膠乳分散液。另外，使所述膠乳分散液中的所述小顆粒的濃度為2W/V。/。。另一方面，使
與調(diào)制所述小顆粒的膠乳分散液同樣，調(diào)制大顆粒的膠乳分散液。
(活^:液的組成) 試劑_最終濃度_
MES (pH6.1，同仁化學研究所制) 50mmol/L NHS水溶液※1 100mmol/L EDAC水溶液※2 1 .Ommol/L
羧基改性聚苯乙烯月交乳顆粒(10%溶液) lw/v%
※1 NHS ( N-羥基琥珀酰亞胺，大力，4 f義夕公司制) ※2EDAC( l-乙基-3-( 3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽， Sigma乂^司制)
接著，一邊以不起泡的方式攪拌， 一邊向所述小顆粒的膠 乳分散液2mL中添加下述組成的用于致敏小顆粒的抗體液 2mL,在室溫(25°C )下反應l小時，進行對小顆粒的致敏反應。 下述組成中所示的濃度為致敏反應液中的各成分的最終濃度， 使所述致敏反應液中的小顆粒的最終濃度為lw/v% 。另外，所 述致敏反應液中，使所述小顆粒負載的多克隆抗體與單克隆抗 體的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=7: 3。
(用于致敏小顆粒的抗體液的組成) 組成 致敏反應時的最終濃度
MES(pH6.1,同仁化學研究所制) BSA ( Sigma公司制) 單克隆抗體液※1 多克隆抗體液※2
50mmol/L lmg/mL 0.12mg/mL 0.28mg/mL
※l兔來源的抗人CRP單克隆抗體液(抗體濃度10.5mg/mL，克隆號No.8, Immuno Probe Co.， Ltd.制)
※2兔來源的抗人CRP多克隆抗體液
(蛋白質(zhì)濃度12.2mg/mL ,貝克爾(Becker )滴定度 3.5mg/mL， Oriental Yeast Co., ltd.制)
反應結束后，離心分離(6000rpm, 15分4f ),除去上清， 將致敏的所述小顆粒懸浮于50mmol/L MES緩沖液(pH6.1 ) 4mL 中，通過超聲波處理使其分散，然后清洗。再次離心分離 (6000rpm, 15分鐘)，除去上清后，將清洗后的所述小顆粒懸 浮于50mmol/L MES緩沖液(pH6.1) 2mL中，通過超聲波處理 使其再分散。將再分散的所述小顆粒與封閉緩沖液(50mmol/L MES緩沖液(pH6丄)，4w/v。/。
BSA)2mL混合，通過超聲波處 理使其分散后，在4。C下靜置一晚，進行封閉處理。封閉處理結 束后，離心分離(6000rpm, 15分鐘)，除去上清，4吏用下述組 成的分散液分散所述小顆粒，使小顆粒的分散濃度為3.33w/v % 。
(分散液的組成)
組成__
Tris畫HCl ( pH7.5，大力，4 f ^夕公司制) 50mmol/L BSA ( Sigma乂A司制) lw/v% 皂角苷(大力，4r義夕公司制) 2.14w/v% D (-)甘露醇(大力，4 f1 X夕公司制) 2w/v%
另一方面，所述大顆粒使用下述組成的用于致敏大顆粒的 抗體液，使致敏反應液中的大顆粒的最終濃度為0.5w/v。/。，使 多克隆抗體的最終濃度為0.5mg/mL，不添加單克隆抗體，除此 以外與所述小顆粒同樣地進行致敏反應，進而，使大顆粒的分 散濃度為1.67w/v% ，除此之外與所述小顆粒同樣地分散于分散液中。所述致敏反應液中，使所述大顆粒負載的多克隆抗體與單克隆抗體的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=
10: 0。另外，下述組成所示的濃度表示致敏反應液中的各成分的最終濃度。
(用于致每丈大顆粒的抗體液的組成)
組成_致敏反應時的最終濃度
MES (pH6.1,同仁化學研究所制) 5Ommol/LBSA ( Sigma7i^司制) lmg/mL多克隆抗體液※ 0.5mg/mL※兔來源的抗人CRP多克隆抗體液
(蛋白質(zhì)濃度12.2mg/mL ,貝克爾(Becker )滴定度3.5mg/mL, Oriental Yeast Co., ltd.制)B.測定試劑的調(diào)制
首先，將所調(diào)制的所述含有小顆粒的分散液和所述含有大顆粒的分散液按照所述小顆粒與所述大顆粒的濃度比(重量比)為10: l進行混合，獲得膠乳混合液。然后，用所述分散液稀釋所述膠乳混合液，〗吏所述小顆粒濃度為0.372w/v。/a ,所述大顆粒濃度為0.036w/v。/Q ，調(diào)制本例的測定試劑。另夕卜，所述膠乳混合液中，所述小顆粒與所述大顆粒的重量比為小顆粒大顆粒=10: 1。
〔實施例2〕
在小顆粒的致敏反應中，使致敏反應液中的多克隆抗體液和單克隆抗體液的最終濃度分別為0.2mg/mL，除此之外與所述實施例1同樣地調(diào)制本例的測定試劑。另夕卜，所述致敏反應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=5: 5?！矊嵤├?〕在小顆粒的致壽文反應中，使致敏反應液中的多克隆抗體液
的最終濃度為0.12mg/mL ,使單克隆抗體液的最終濃度為0.2 8 mg/mL,除此之外與所述實施例1同樣地i調(diào)制本例的測定試劑。另外，所述致敏反應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=3: 7?！矊嵤├?〕
在小顆粒的致每丈反應中，^吏致敏反應液中的多克隆抗體液的最終濃度為0.04mg/mL ,使單克隆抗體液的最終濃度為0.3 6mg/mL ，除此之外與所述實施例1同樣地調(diào)制本例的測定試劑。另外，所述致敏反應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=1:9?！脖容^例1 〕
本例的測定試劑中，使小顆粒僅負載多克隆抗體。具體而言，在小顆粒的致敏反應中，使致敏反應液中的多克隆抗體的最終濃度為0.4mg/mL (未添加單克隆抗體)，除此之外與所述實施例1同樣地調(diào)制本例的測定試劑。另夕卜，所述致敏反應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體==10: 0。〔比較例2〕
本例的測定試劑中，使小顆粒僅負載單克隆抗體。具體而言，在小顆粒的致敏反應中，使致敏反應液中的單克隆抗體的最終濃度為0.4mg/mL (未添加多克隆抗體)，除此之外與所述實施例1同樣地調(diào)制本例的測定試劑。另夕卜，所述致敏反應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比為多克隆抗體單克隆抗體=0: 10。
使用所述實施例1~4、比較例1和2的測定試劑，如下所述，通過免疫比濁法進行CRP的測定。CRP使用的是高純的C反應性說明書第22/29頁
蛋白抗體(C-Reactive Protein Antigen, High Pure) ( Capricon
公司制)。
即，首先，將所述CRP用稀釋液(50mniol/L Tris=HCl(pH7.5), 100mmol/LNaCl (大力，4亍X夕公司制)，lw/v%BSA)一希釋，調(diào)制^見定濃度(0、 0.05、 0.1、 0.15、 0.5、 1、 2.5、5、 10、 20mg/100mL)的CRP溶液(待測物)。然后，將所述各CRP溶液(待測物)用所述稀釋液進一步稀釋至1.66倍，調(diào)制測定試樣。向所述各測定試樣6jiL中添加反應緩沖液(1.28w/v%NaCl) 63(iL和所述各測定試劑21jiL,在37。C下^f吏其反應。反應開始(添加)后5分鐘，使用自動通用測定儀器(商品名Bio-majesty ( BM-8 )，日本電子司制)測定所述反應液的658nm處的吸光度。然后，從所述反應開始150秒后的吸光度測定值減去所述反應開始30秒后的吸光度測定值，算出吸光度的變化量，將該變化量用于測定評價。另外，所述反應液中的膠乳顆粒濃度為所述小顆粒的所述濃度為0.087w/v。/。，所述大顆粒的所述濃度為0.008w/v % , 全部膠#L顆粒的濃度為0.095w/v% 。
圖l的圖中示出了通過實施例1 ~ 4、比較例l和2的測定試劑的測定結果。該圖中，橫軸為各CRP溶液(待測物)的CRP的濃度(mg/100mL),縱軸為各CRP濃度下的所述吸光度的變化量。另外，該圖的圖中，各實施例和比較例的圖標為實施例l為令，實施例2為A，實施例3為國，實施例4為參，比較例l為o,比較例2為口。如該圖中所示，在使用使所述小顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體兩者的實施例1 ~ 4的測定試劑時，伴隨CRP濃度的增加，吸光度的變化量增大。與其相對，在使用使所述小顆粒僅負載任一者的抗體的比較例的測定試劑時，若CRP濃度超過10mg/100mL,則比較例2中吸光度變化量幾乎沒 26有變化，比較例l中則反而減少了。這樣表明通過使所述小顆粒負載多克隆抗體和單克隆抗體兩者，能夠在從低濃度至高濃度的很寬的濃度范圍內(nèi)，以高靈敏度進行測定。并且，如使用了實施例1 ~ 4的測定試劑的測定結果所示，通過改變負載的多克隆抗體和單克隆抗體的比例，能夠容易地調(diào)整靈敏度。另夕卜，
即使所述反應液中的所述CRP溶液(待測物)的稀釋率為非常低的約25倍，在使用實施例l ~ 4的測定試劑時，隨著CRP濃度的增加，吸光度變化量增大，可以獲得良好的測定結果。此外，在使用減少了負載的單克隆抗體的比例的實施例1 ~ 4的測定試劑的測定中，與使用僅負載單克隆抗體的比較例2的測定試劑的情況相比，吸光度增加量變大，測定靈敏度均提高?！矊嵤├?〕
本例中，使致敏反應液中的多克隆抗體液的最終濃度為0.04mg/mL,使單克隆抗體液的最終濃度為0.36mg/mL,除此之外與所述實施例l同樣地進行小顆粒的致敏反應。另外，致敏反應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=1: 9。另一方面，使致敏反應液中的多克隆抗體液的最終濃度為0.25mg/mL,使單克隆抗體液的最終濃度為0.25mg/mL,除此之外與所述實施例1同樣地進行大顆粒的致敏反應。另外，致敏反應液中，使所述大顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=5: 5。并且，將含有小顆粒的分散液與含有大顆粒的分散液按照所述小顆粒與大顆粒的濃度比(重量比)為5: l進行混合，用所述分散液進一步稀釋，使所述小顆粒的濃度為0.417w/v。/。，所述大顆粒的濃度為0.083w/v % ，除此之外與所述實施例1同樣地調(diào)制本例的測定試劑。
〔實施例6〕本例中，使致敏反應液中的多克隆抗體液的最終濃度為
0.04mg/mL，使單克隆抗體液的最終濃度為0.36mg/mL，除此之 外與所述實施例l同樣地進行小顆粒的致敏反應。另外，致敏反 應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克 隆抗體單克隆抗體=1: 9。另一方面，z使致每丈反應液中的多 克隆抗體液的最終濃度為0.15mg/mL,使單克隆抗體液的最終 濃度為0.35mg/mL，除此之外與所述實施例1同樣地進行大顆粒 的致敏反應。另外，致敏反應液中，使所述大顆粒負載的抗體 的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=3: 7。并且， 將含有小顆粒的分散液與含有大顆粒的分散液按照所述小顆粒 與大顆粒的濃度比(重量比)為5: l進行混合，用所述分散液 進一步稀釋，使所述小顆粒的濃度為0.417w/vS ,所述大顆粒 的濃度為0.083w/v % ，除此之外與實施例1同樣地調(diào)制本例的測 定試劑。
〔實施例7〕
本例中，使致敏反應液中的多克隆抗體液的最終濃度為 0.04mg/mL，使單克隆抗體液的最終濃度為0.36mg/mL,除此之 外與所述實施例l同樣地進行小顆粒的致敏反應。另外，致敏反 應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克 隆抗體單克隆抗體=1: 9。另一方面，z使致壽丈反應液中的多 克隆抗體液的最終濃度為0.1mg/mL,使單克隆抗體液的最終濃 度為0.4mg/mL ,除此之外與所述實施例1同樣地進行大顆粒的 致敏反應。另外，致敏反應液中，使所述大顆粒負載的抗體的 濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=2: 8。并且， 將含有小顆粒的分散液與含有大顆粒的分散液按照所述小顆粒 與大顆粒的濃度比(重量比)為5: l進行混合，用所述分散液 進一步稀釋，使所述小顆粒的濃度為0.417w/v。/。，所述大顆粒的濃度為0.083w/v。/c)，除此之外與實施例l同樣地調(diào)制本例的測
定^式劑。
〔實施例8〕
本例中，橫_致敏.良應液中的多克隆抗體的最終濃度為
0.04mg/mL,使單克隆抗體液的最終濃度為0.36mg/mL,除此之 外與所述實施例l同樣地進行小顆粒的致敏反應。另外，致每丈反 應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克 隆抗體單克隆抗體=1: 9。另一方面，^吏致每丈反應液中的多 克隆抗體液的最終濃度為0.05mg/mL,使單克隆抗體液的最終 濃度為0.45mg/mL,除此之外與所述實施例1同樣地進4亍大顆粒 的致敏反應。另外，致敏反應液中，使所述大顆粒負載的抗體 的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=1: 9。并且， 將含有小顆粒的分散液與含有大顆粒的分散液按照所述小顆粒 與大顆粒的濃度比(重量比)為5: l進行混合，用所述分散液 進一步稀釋， -使所述小顆粒的濃度為0.417w/v。/。，所述大顆粒 的濃度為0.083w/v。/。，除此之外與實施例l同樣地調(diào)制本例的測 定試劑。
〔實施例9〕
本例中，使致敏反應液中的多克隆抗體的最終濃度為 0.04mg/mL,使單克隆抗體液的最終濃度為0.36mg/mL,除此之 外與所述實施例l同樣地進行小顆粒的致敏反應。另外，致敏反 應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克 隆抗體單克隆抗體=1: 9。另一方面，使致壽丈反應液中的多 克隆抗體液的最終濃度為0.5mg/mL,不添加單克隆抗體，除此 之外與所述實施例l同樣地進行大顆粒的致敏反應。另外，致敏 反應液中，使所述大顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多 克隆抗體單克隆抗體=10: 0。并且，將含有小顆粒的分散液與含有大顆粒的分散液按照所述小顆粒與大顆粒的濃度比(重
量比)為5: l進行混合，用所述分散液進一步稀釋，使所述小 顆粒的濃度為0.417w/v。/。，所述大顆粒的濃度為0.083w/v。/0 ， 除此之外與實施例l同樣地調(diào)制本例的測定試劑。
作為所述測定試劑，^吏用所述實施例5 ~ 9的測定試劑，關
顆粒的所述濃度為0.097w/v % ,使所述大顆粒的所述濃度為 0.019w/v% (全部膠乳顆粒濃度為0.116w/v。/。)，除此之外與前 述的實施例1 4、比較例1和2的測定同樣，通過免疫比濁法進 行測定。
圖2的圖中示出了通過實施例5 ~ 9的測定試劑的測定結果。 該圖中，橫軸為各CRP溶液(待測物)的CRP的濃度
另外，各實施例在該圖中的圖標為實施例5為令，實施例6為 ■，實施例7為A，實施例8為參，實施例9為口。如該圖所示，在 使用實施例5 ~ 9中任一者的測定試劑時，伴隨CRP的濃度的增 加，吸光度的變化量均增大，能夠在寬濃度范圍進行測定。另 外，使用了使大顆粒負載所述兩抗體的大顆粒的實施例5 8的 測定試劑的測定，與4吏用了僅負載多克隆抗體的實施例9的測定 試劑的測定相比，高濃度范圍的測定靈敏度進 一 步提高。 〔實施例10〕
本例中，^使致敏反應液中的多克隆抗體的最終濃度為 0.04mg/mL,使單克隆抗體液的最終濃度為0.36mg/mL，除此之 外與所述實施例l同樣地進行小顆粒的致敏反應。另外，致敏反 應液中，使所述小顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克 隆抗體單克隆抗體=1: 9。另一方面，與所述實施例l同樣地 進行大顆粒的致敏反應。另外，致敏反應液中，使所述大顆粒負載的抗體的濃度比(重量比)為多克隆抗體單克隆抗體=
10: 0。另外，本例中，含有小顆粒的分散液和含有大顆粒的分 散液的調(diào)制，分別使用下述組成的分散液進行分散，使所述分 散液中的所述小顆粒的濃度為2w/v。/。，所述分散液中的所述大 顆粒的濃度為0.4w/v。/c),除此之外與實施例l同樣地進行。并且， 將所述小顆粒的分散液與所述大顆粒的分散液按照1: 1的體積 比混合，調(diào)制下述組成的測定試劑。另外，本例的測定試劑中， 所述小顆粒與大顆粒的濃度比(重量比)為5: 1。
(分散液的組成) 組成 濃度
Tris-HCl ( pH7.5,大力，4 f義夕乂>司制)
BSA ( Sigma/^司制)
皂角苷(大力，4^義夕公司制)
蔗糖(大力，4亍義夕公司制)
(測定試劑的組成)
組成
200mmol/L 4w/v% 8.56w/v% 4w/v%
濃度
Tris-HCl ( pH7.5,大力，4 f義夕公司制) lOOmmol/L BSA ( Sigma^^司制) 2w/v% 皂角苷(大力，4^只夕公司制) 4.28w/v% 蔗糖(大力，4 f義夕公司制) 2w/v% 小顆粒(0.096jim) lw/v% 大顆粒(0.213pm) 0.2w/v%
接著，制作以下所示的本例的待測物分析用具l。圖3示出 了本例的待測物分析用具l。圖3的(A)為所述待測物分析用 具1的平面圖，圖3的(B)為從I-I方向觀察該圖的(A)的所 述待測物分析用具l的截面圖。另外，該圖為本例的待測物分析 用具l的概略圖，整體和各結構的大小和比率等與實際不同。待測物分析用具l具備上基板2a和下基板2b,在所述下基板2b上層 壓有所述上基板2a。所述下基板2b在長度方向的左端附近和中 央附近分別形成有凹部，前者成為配置測定試劑6的試劑部3 , 后者成為反應液的測定部4。所述下基—反2b中，所述試劑部3和 所述測定部4之間、以及所述測定部4和長度方向的右端部之間 分別形成有槽，這些槽通過所述上基板2a的層壓而形成流路5a、 5b。另外，待測物分析用具l中，流路5b的右端的開口部8為與 用于使流路5a、 5b內(nèi)部為負壓的負壓產(chǎn)生裝置(例如，吸量管) 的連結部。另一方面，上基板2a在長度方向的左端附近、且與 所述下基板2b的試劑部3對應的部位具有貫通孔7,其成為測定 試樣的導入口 7。上基板2a的材質(zhì)為PET (聚對苯二甲酸乙二 酯)，下基板2b的材質(zhì)為PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)。
本例中，首先，在下基板2b上層壓上基板2a,使用吸量管， 通過所述導入口7向所述下基板2b的所述試劑部3添加所述測定 試劑2.45iiiL,在室溫下干燥2小時后，在濕度1%以下的環(huán)境下 放置3天，制作待測物分析用具l。所述待測物分析用具l直到使 用時保存在裝有硅膠的鋁包中。
將血液采集到采血管中，離心分離后，除去血漿。將所獲 得的血細胞用生理鹽水清洗3次，調(diào)制洗凈血細胞。另一方面， 向無CRP的血清(Biopool公司)中以頭見定濃度(0、 0.2、 0.4、 20、 40、 80mg/100mL)添加CRP，調(diào)制CRP溶液。然后，向所 述無CRP的血清60)iL和所述洗凈血細胞90iaL中添加所述CRP溶 液50iiL,使合計為200(iL。將該混合液200(iL中的25pL，使用 生理鹽水600pL進一 步稀釋至25倍，調(diào)制CRP-洗凈血細胞溶液。 以此作為測定試樣。所述CRP-洗凈血細胞溶液中的CRP濃度分 別為0、 0.05、 0.1、 5、 10、 20mg/100mL。將所述CRP-洗凈血 細胞溶液21 |iL滴入所述試劑部3 ，將干燥的所述測定試劑6懸浮。然后，立即通過連結到流路5b端部的開口部8的吸量管，向 圖3的(B)的箭頭方向吸引，使所述流路5b內(nèi)部為負壓，使所 述懸浮液移動到測定部4， -使CRP與本例的測定"^式劑反應。另夕卜， 所述反應時的所述懸浮液中的不溶性載體顆粒濃度為小顆粒 為0.117w/v。/。，大顆粒為0.023w/v。/。，總顆粒濃度為0.14w/v0/)。 以所述懸浮液移動到所述測定部4的時刻作為反應開始，在所述 反應開始l分鐘后和4分鐘后，使用分光光度計，對測定波長分鐘后的吸光度減去所述反應開始l分鐘后的吸光度，算出3分 鐘的吸光度變化量。圖4的圖中示出所述吸光度變化量的測定結果。該圖中，縱 軸為吸光度變化量， 一黃軸為CRP-洗凈血細胞溶液中的CRP濃度 (mg/100mL)。如該圖所示，在4吏用本例的待測物分析用具1 的測定中，伴隨CRP的濃度的增加，吸光度的變化量增大，能 夠在寬濃度范圍進行測定。 產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的用途可以列舉例如臨床檢查或各種篩查等，其用 途不受限制，能夠在很廣泛的領域中使用。
權利要求
1.一種用于免疫比濁法的測定試劑，其特征在于，所述測定試劑包含含有多個負載有抗體的不溶性載體顆粒的不溶性載體顆粒群，所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群，所述平均粒徑不同的2種以上的不溶性載體顆粒群中，至少1種不溶性載體顆粒群中所含有的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體，其他種類的不溶性載體顆粒群中所含有的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
2. 根據(jù)權利要求l所述的測定試劑，其中，所述不溶性載 體顆粒群包含平均粒徑不同的2種不溶性載體顆粒群，所述2種不溶性載體顆粒群中，平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載 有多克隆抗體和單克隆抗體，有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
3. 根據(jù)權利要求l所述的測定試劑，其中，所述不溶性載所述2種不溶性載體顆粒群中，有多克隆抗體和單克隆抗體，平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載 有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
4. 根據(jù)權利要求l所述的測定試劑，其中，所述不溶性載 體顆粒為力交乳顆粒。
5. 根據(jù)權利要求2所述的測定試劑，其中，用于致敏所述平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒的所述多克隆抗體和所述單克隆抗體的抗體濃度比為1: 9~7: 3。
6. —種免疫比濁法，其特征在于，該方法使用了具有不溶 性載體顆粒群的測定試劑，所述不溶性載體顆粒群含有多個負 載有抗體的不溶性載體顆粒，通過使作為抗原的測定對象與所述抗體反應，從而使所述不溶性載體顆粒群凝集，作為所述測定試劑，使用權利要求l所述的測定試劑。
7. 根據(jù)權利要求6所述的免疫比濁法，其中，所述測定試 劑中的所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的2種不溶性 載體顆粒群，所述2種不溶性載體顆粒群中，平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載 有多克隆抗體和單克隆抗體，有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
8. 根據(jù)權利要求6所述的免疫比濁法，其中，所述測定試載體顆粒群，所述2種不溶性載體顆粒群中，有多克隆抗體和單克隆抗體，平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載 有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
9. 根據(jù)權利要求6所述的免疫比濁法，其中，所述測定試 劑中的所述不溶性載體顆粒為膠乳顆粒。
10. 根據(jù)權利要求7所述的免疫比濁法，其中，致敏所述平隆抗體和所述單克隆抗體的抗體濃度比為1: 9~7: 3。
11. 一種用于免疫比濁法的待測物分析用具，其特征在于， 其具有基板和測定試劑，并且在所述基板上配置有所述測定試 劑，所述測定試劑為；^又利要求1所述的測定試劑。
12. 根據(jù)權利要求ll所述的待測物分析用具，其中，所述 測定試劑中的所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的2種 不溶性載體顆粒群，所述2種不溶性載體顆粒群中，平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載 有多克隆抗體和單克隆抗體，有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
13. 根據(jù)權利要求ll所述的待測物分析用具，其中，所述 測定試劑中的所述不溶性載體顆粒群包含平均粒徑不同的2種 不溶性載體顆粒群，所述2種不溶性載體顆粒群中，平均粒徑大的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載 有多克隆抗體和單克隆抗體，平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒負載 有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。
14. 根據(jù)權利要求12所述的待測物分析用具，其中，致敏 所述平均粒徑小的不溶性載體顆粒群中的不溶性載體顆粒的所 述多克隆抗體和所述單克隆抗體的抗體濃度比為1: 9~7: 3。
15. 根據(jù)權利要求ll所述的待測物分析用具，其中，所述 待測物分析用具為試驗片、測試盒或微芯片。
全文摘要
提供一種用于免疫比濁法的測定試劑，該測定試劑可以抑制不溶性載體顆粒量和單克隆抗體量，提高對于低濃度范圍的測定對象的測定靈敏度，能夠在寬濃度范圍對測定對象進行測定，并且，還能夠應用于試驗片等待測物分析用具。所述測定試劑包含平均粒徑不同的2種不溶性載體顆粒群，其構成為其中一種不溶性載體顆粒群中所含有的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體，另一種不溶性載體顆粒群中所含有的不溶性載體顆粒負載有多克隆抗體和單克隆抗體中的至少一種抗體。優(yōu)選前者為平均粒徑小的不溶性載體顆粒群，后者為平均粒徑大的不溶性載體顆粒群。
文檔編號G01N33/543GK101680891SQ20088001770
公開日2010年3月24日 申請日期2008年11月20日 優(yōu)先權日2007年11月21日
發(fā)明者高木英紀 申請人:愛科來株式會社