專利名稱：：通過(guò)從活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)將能量轉(zhuǎn)移至能量受體染料來(lái)檢測(cè)生物分子的試劑、試劑...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請(qǐng)通常涉及用于檢測(cè)樣品中的生物分子的試劑、試劑盒和方法。引言生物測(cè)定用戶逐漸采用均相測(cè)定法方式代替非均相測(cè)定法，優(yōu)選更簡(jiǎn)單、步驟更少(例如，沒(méi)有分離步驟)的測(cè)定法，其意味著獲得結(jié)果需要更少的勞動(dòng)和更快的時(shí)間。如本文描述的，靈敏的均相生物測(cè)定可以在載體表面上進(jìn)行，其中定位酶翻轉(zhuǎn)產(chǎn)生受體染色層(例如J-聚集的染料)在所述載體上的定位化學(xué)激發(fā)，其與附近俘獲的分析物檢測(cè)相關(guān)?？梢允褂幂d體組裝作為用于芯片方式的化學(xué)發(fā)光的均相酶標(biāo)記的生物測(cè)定和溶液測(cè)定的靈敏的生物測(cè)定載體。該測(cè)定設(shè)計(jì)也可以適合不同的載體組裝的混合，提供以均相測(cè)定方式的多重測(cè)定。波長(zhǎng)轉(zhuǎn)移發(fā)光信號(hào)遠(yuǎn)離自身熒光帶和引發(fā)來(lái)自化學(xué)激發(fā)的信號(hào)的能力可以提供更低的背景、增加信噪比、增加動(dòng)態(tài)范圍、增加檢測(cè)靈敏度和顯著地簡(jiǎn)化儀器讀出信號(hào)。發(fā)明概述提供一種制品，其包括具有表面的載體；所述載體表面上的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的能量受體染料；禾口所述載體表面上的一種或多種生物分子探針。還提供一種用于檢測(cè)樣品中分析物的試劑盒，其包括如上述的制品，其中所述一種或多種生物分子探針包括能夠結(jié)合分析物的探針，或者當(dāng)分析物存在時(shí)，其結(jié)合分析物的探針；化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)；禾口任選地，酶標(biāo)記的生物分子或酶標(biāo)記的分析物。當(dāng)分析物結(jié)合表面結(jié)合探針時(shí)，所述酶標(biāo)記的生物分子可以結(jié)合所述分析物。所述酶標(biāo)記的分析物可以與樣品中未標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合表面結(jié)合探針。還提供一種用于檢測(cè)樣品中分析物的方法，其包括用如上所述制品接觸樣品，其中所述一種或多種生物分子探針包括能夠結(jié)合分析物的探針；使樣品中的分析物結(jié)合所述探針；其中(a)所述分析物是一種酶；(b)用酶標(biāo)記所述分析物；(c)用結(jié)合分析物的酶標(biāo)記的生物分子接觸所述載體表面；或(d)所述分析物是8未標(biāo)記的，并且將酶標(biāo)記的分析物加入樣品中，以使樣品中酶標(biāo)記的分析物與未標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述探針；用所述酶活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸所述載體表面，其中所述活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)能量受體染料，引起從其中發(fā)射；禾口檢測(cè)來(lái)自所述能量受體染料的發(fā)射。還提供一種用于檢測(cè)樣品中分析物的試劑盒，其包括制品，其包括具有表面的載體，所述載體表面上的能量受體染料，和所述載體表面上的一種或多種生物分子探針，其中所述一種或多種生物分子探針包括能夠結(jié)合分析物的探針，或者當(dāng)存在分析物時(shí)，其結(jié)合所述分析物的探針；化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)；禾口任選地，酶標(biāo)記的生物分子或酶_標(biāo)記分析物。當(dāng)分析物結(jié)合表面結(jié)合探針時(shí)，所述酶標(biāo)記的生物分子可以結(jié)合所述分析物。所述酶標(biāo)記的分析物可以與樣品中未標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述表面結(jié)合探針。還提供一種用于檢測(cè)樣品中多種分析物的方法，其包括用第一制品接觸樣品，所述制品包括具有表面的載體；所述載體表面上的第一化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第一能量受體染料；和所述載體表面上的第一生物分子探針，其中所述第一生物分子探針能夠結(jié)合第一分析物；用第二制品接觸樣品，所述制品包括具有表面的載體；所述載體表面上的第二化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第二能量受體染料；和所述載體表面上的第二生物分子探針，其中所述第二生物分子探針能夠結(jié)合第二分析物；使樣品中的第一分析物結(jié)合第一生物分子探針，其中(a)第一分析物為第一酶，(b)用第一酶標(biāo)記第一分析物，(c)用第一酶標(biāo)記的和結(jié)合第一分析物的生物分子接觸第一制品的載體表面；或(d)第一分析物為未標(biāo)記，和將第一酶標(biāo)記的第一分析物加入到樣品中以使樣品中的酶_標(biāo)記的第一分析物與未標(biāo)記的第一分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合第一生物分子探針；使樣品中的第二分析物結(jié)合第二生物分子探針，其中(a)第二分析物為第二酶，(b)用第二酶標(biāo)記第二分析物，(c)用第二酶標(biāo)記的和結(jié)合第二分析物的生物分子接觸第二制品的載體表面；或(d)第二分析物為未標(biāo)記，和將第二酶標(biāo)記的第二分析物加入到樣品中以使樣品中的酶_標(biāo)記的第二分析物與未標(biāo)記的第二分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合第二生物分子探針；用第一酶活化的第一化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸第一制品，其中所述活化的第一化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第一能量受體染料，引起其發(fā)射，和用第二酶活化的第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸第二制品，其中所述活化的第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第二能量受體染料，引起從其中發(fā)射；和檢測(cè)來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射和檢測(cè)來(lái)自第二能量受體染料的發(fā)射，其中來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射與來(lái)自第二能量受體染料的那些是可區(qū)別的。還提供一種用于檢測(cè)樣品中多種分析物的試劑盒，其包括第一制品，其包括具有表面的第一載體；所述載體表面上的第一化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第一能量受體染料；和所述載體表面上的第一生物分子探針，其中所述第一生物分子探針能夠結(jié)合第一分析物，或者當(dāng)存在第一分析物時(shí)，其結(jié)合第一分析物；第二制品，其包括具有表面的載體；所述載體表面上的第二化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第二能量受體染料；和所述載體表面上的第二生物分子探針，其中所述第二生物分子探針能夠結(jié)合第二分析物，或者當(dāng)存在第二分析物時(shí)，其結(jié)合第二分析物；第一化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)，其中所述活化的第一化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第一能量受體染料，引起從其中發(fā)射；第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)，其中所述活化的第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第二能量受體染料，引起從其中發(fā)射，其中來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射與來(lái)自第二能量受體染料的那些是可區(qū)別的；任選地，第一酶標(biāo)記的生物分子或第一酶標(biāo)記的第一分析物；任選地，第二酶標(biāo)記的生物分子或第二酶標(biāo)記的第二分析物。本文中給出了本發(fā)明教導(dǎo)的這些及其它特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解如下所述的附圖僅僅是用于闡述的目的。所述附圖并不意味著以任何方式限制本發(fā)明教導(dǎo)的范圍。圖1為圖解用于堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG抗體的測(cè)定的示意圖，其中POROS⑧-A載體，其包括化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑(即TPQ)、陰離子花青染料和生物分子探針(即蛋白質(zhì)-A)和具有結(jié)合所述探針的堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG抗體，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)的化學(xué)激發(fā)，引起所述載體上的J-聚集的花青染料的窄帶發(fā)射。圖2為具有POROS⑧-A載體的構(gòu)建物的示意圖，所述載體包括化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑(即，TPQ)、J-聚集的染料和生物分子探針(即，蛋白質(zhì)A)，且具有結(jié)合所述探針的兔子cAMP抗體。圖3為圖解使用圖2的構(gòu)建物的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法的示意圖，其中將加入到樣品中的堿性磷酸酶標(biāo)記的cAMP與樣品中的cAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合兔子cAMP抗體，所述兔子cAMP抗體已結(jié)合在所述載體表面上的A蛋白生物分子探針。圖4為顯示在圖3中描述的均相cAMP測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，所述測(cè)定使用在01103@構(gòu)建物上的40ii1cAMP抗體和1:50稀釋度的cAMP-堿性磷酸酶結(jié)合物。圖5為使用圖2的構(gòu)建物的均相cAMP-AP測(cè)定的能量轉(zhuǎn)移(ET)譜圖。圖6為圖解夾心測(cè)定的示意圖，其使用的載體包括表面、化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑(即TPQ)、陰離子花青染料(例如，J-聚集的染料)、用于俘獲樣品中分析物的生物分子探針(即，俘獲抗體)和能夠結(jié)合結(jié)合分析物的載體的酶標(biāo)記的抗體。如圖6中圖解的，二氧雜環(huán)丁烷基質(zhì)的酶的翻轉(zhuǎn)產(chǎn)生活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)，其分裂產(chǎn)生光，該光經(jīng)由能量轉(zhuǎn)移(ET)引起花青染料產(chǎn)生熒光。圖7為描述多路復(fù)用、均相測(cè)定的示意圖。多種實(shí)施方案的說(shuō)明為了解釋本說(shuō)明書的目的，將使用下述定義，只要適當(dāng)時(shí)，以單數(shù)應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)也將包括其復(fù)數(shù)形式，反之亦然。為了解釋本說(shuō)明書及其相關(guān)權(quán)利要求的目的，下述給出的任何定于與在任何其它文件，包括引入本文作為參考的任何文件中術(shù)語(yǔ)的用法相抵觸時(shí)，將總是以下列定義為準(zhǔn)，除非明確指出相反的含義(例如，在揭示最初使用該術(shù)語(yǔ)的文件時(shí))。除非另有說(shuō)明或當(dāng)使用"和/或"明顯不合適的情況下，本文使用的"或"指"和/或"。除非另有說(shuō)明或當(dāng)使用"一個(gè)(種)或多個(gè)(種)"明顯不合適的情況下，本文使用的"一個(gè)(種)"指"一個(gè)(種)或多個(gè)(種)"。使用的"包括"、"包含"、"含有"、"包括"、"包括"、和"包括"可互換地使用，而不意味著限制。而且，當(dāng)在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的描述中使用術(shù)語(yǔ)"包括"時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在某些具體實(shí)例中，該實(shí)施方案或多個(gè)實(shí)施方案可以作為替代地使用措辭"基本上由...組成"和/或"由...組成"來(lái)描述。如本文使用的能量受體染料為能夠接受經(jīng)由來(lái)自供體(例如，化學(xué)激發(fā)的供體)的能量轉(zhuǎn)移(ET)和將該能量轉(zhuǎn)化成輻射(例如發(fā)光)的分子。一類示例性的受體染料為J-聚集的染料。如本文使用的化學(xué)激發(fā)的供體為可以被活化(例如，酶活化)以使其初始基能狀態(tài)處于(populate)激發(fā)態(tài)片段的分子。所述片段能夠?qū)⑵浼ぐl(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移至受體分子，同時(shí)其退回至基態(tài)能水平。如本文使用的分子過(guò)濾器為干擾被檢測(cè)信號(hào)的屏蔽(或淬滅)光發(fā)射的分子。分子過(guò)濾器的非限制性實(shí)例為血紅蛋白，其屏蔽<600納米的光發(fā)射和淬滅染料。干擾信號(hào)的光發(fā)射的一個(gè)實(shí)例是自身熒光(例如，來(lái)自生物試樣的高能、藍(lán)色背景發(fā)射)。如本文使用的J-聚集的染料是一種其中分子結(jié)合形成聚集體的染料，該聚集體具有紅移的和比單體染料種類更窄的發(fā)射帶寬的熒光發(fā)射。例如，一些花青染料的J-聚集可以顯著地紅移熒光發(fā)射(即，從單體的530-550nm紅移至J-聚集體的590-620nm)，并且可以使發(fā)射帶寬縮窄至約15nm(半寬度)。J-聚集的染料公開于:T.Kobayashi(ed.)，〃J-Aggregates〃，WorldScientificPublishingCo.，1996;Whittenetal.，〃StabilizationoftheAggregationofCyanineDyesattheMolecularandNanoscopicLevel,〃Langmuir，2000，16，9042-9048;Mishraetal.，〃CyaninesDuringthe1990s:AReview〃，Chem.Rev.2000，100，1973-2011s以及vonBerl印schetal.，〃EffectofalcoholsonJ_aggregationofacarbocyaninedye，〃Langmuir2002，7699-7705。如下給出J-聚集的花青染料的通式結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中X=COO—或S03—，m為0-9的整數(shù)，n為1-9的整數(shù)。這些染料已經(jīng)描述在文獻(xiàn)中，并且是市售可獲得的(例如，F(xiàn)EWChemicals,Wolfen，Germany)。如本文使用的供體和受體部分之間的能量轉(zhuǎn)移可以通過(guò)任何能量轉(zhuǎn)移(ET)過(guò)程出現(xiàn)，比如通過(guò)能量轉(zhuǎn)移裝置的接近相關(guān)部分的碰撞或通過(guò)非輻射過(guò)程比如能量共振轉(zhuǎn)移(RET)。應(yīng)當(dāng)理解，在本申請(qǐng)中任何提及的能量轉(zhuǎn)移都包括所有這些機(jī)械化不同的(mechanistically-distinct)現(xiàn)象。應(yīng)當(dāng)理解能量轉(zhuǎn)移也可以通過(guò)沒(méi)有描述的或仍然沒(méi)有充分理解的機(jī)制出現(xiàn)。也應(yīng)當(dāng)理解能量轉(zhuǎn)移可以同時(shí)和/或順次通過(guò)超過(guò)一種能量轉(zhuǎn)移過(guò)程出現(xiàn)，并且可檢測(cè)信號(hào)可以是測(cè)量?jī)煞N或多種能量轉(zhuǎn)移過(guò)程的活性。因此，能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制不限于本發(fā)明中的。通常，能量轉(zhuǎn)移將通過(guò)單個(gè)供體部分和單個(gè)受體部分的作用出現(xiàn)，但本發(fā)明不限于此。所述供體和受體部分可以作用，使得一種或多種受體部分接受從一種或多種供體部分轉(zhuǎn)移的能量。應(yīng)當(dāng)理解一旦化學(xué)激發(fā)的能量已經(jīng)轉(zhuǎn)移到第一個(gè)受體，則該能量可以轉(zhuǎn)移到第二個(gè)受體，從而通過(guò)能量的級(jí)聯(lián)從隨后的供體到受體，其中每個(gè)能量受體是下一個(gè)能量轉(zhuǎn)移事件中的能量供體。如本文使用的"載體"可以與術(shù)語(yǔ)比如"固體載體"、"固體載體"、"固相"、"表面"、"膜"或"樹脂"可互換地使用。所有的"載體"都包括至少一個(gè)表面。表面可以使平面的、基本上平面的或者非平面的。載體可以由有機(jī)聚合物組成，比如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧化物和聚丙烯酰胺，以及任意前述物質(zhì)的共聚物和接枝物。其它示例性的載體物質(zhì)包括，但不限于膠乳、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、尼龍、聚丙烯酰胺或聚(苯乙烯二乙烯基苯)(例如POROS⑧)珠粒。載體也可以無(wú)機(jī)物，比如玻璃、二氧化硅或孔徑可控玻璃(CPG)。載體的構(gòu)型可以是珠粒、球形、微粒、顆粒、凝膠或膜的形式。合適載體的某些非限制性實(shí)例包括，但不限于微粒、納米顆粒、層析載體、膜或微孔(microwell)表面。載體可以是多孔的或無(wú)孔的，并且可以具有膨脹或非膨脹特征。載體可以是剛性的，或者可以是柔性的。載體可以裝配成井狀、凹陷或其它容器、器皿、部件(feature)或位置的形式。多個(gè)載體可以以陣列的形式被裝配在不同位置，所述位置對(duì)于自動(dòng)遞送試劑或通過(guò)檢測(cè)方法和/或儀器是可尋址的。所述載體可以具有帶電的、中性的、疏水性的或親水性的表面。根據(jù)某些實(shí)施方案，帶電荷的載體表面可以起用于聚電解質(zhì)多層(PEM)涂層、制備(例如通過(guò)連續(xù)裝配或帶相反電荷的有機(jī)分子)的載體的作用。聚電解質(zhì)多層涂層公開在Decher等人編著的〃MultilayerThinFilms-SequentialAssemblyofNanocompositeMaterials〃，Wiley-VCH，(2003);Harris等人的〃SynthesisofPassivating，Nylon-LikeCoatingsThroughCross-LinkingofUltrathinPolyelectrolyteFilms,〃J.Am.Chem.Soc，1999，121:1978-1979;和美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2002-053514A1中。例如，可以使用疏水性吸附作用"涂層"聚苯乙烯珠粒。也可以使用電荷相互作用、疏水性相互作用或這些作用的組合涂層載體。所述載體本身可以是化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑(例如尼龍)。在某些情況下，為了形成能夠增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的構(gòu)建物，所述載體表面可以是直接衍生化的。例如，可以通過(guò)部分季銨化Merrifield樹脂(即，基于苯乙烯和與二乙烯基苯交聯(lián)的氯甲基苯的共聚物的聚苯乙烯樹脂)中的氯甲基制備用于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的衍生化載體。如本文使用的"結(jié)合載體"指共價(jià)連接載體表面的化合物或非常接近地保留在載體表面的化合物。所述化合物可以非常接近地保留在所述載體表面，例如l)通過(guò)與表面或其上放置的化合物的靜電相互作用；2)通過(guò)與表面或其上放置的化合物的疏水性相互作用；或3)通過(guò)其組合。所述化合物可以通過(guò)包埋在覆蓋所述載體表面的聚合物層(例如涂層)非常接近地保留在所述載體表面(例如美國(guó)專利No.5，071，909)。非常接近指1)在某些實(shí)施方案中，在表面的約200A之內(nèi)；2)在某些實(shí)施方案中，在表面的約150人之內(nèi)；3)在某些實(shí)施方案中，在表面的約75A之內(nèi)；或4)在某些實(shí)施方案中，在表面的約50人之內(nèi)。根據(jù)某些實(shí)施方案，如上所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)、能量受體染料和一種或多種生物分子探針在所述載體的"表面上"。"表面上"指這些組分與所述載體的表面物理地接觸或者與所述載體的表面保持非常接近。非常接近意味著l)在某些實(shí)施方案中，在表面的約200^之內(nèi)；2)在某些實(shí)施方案中，在表面的約150^之內(nèi)；3)在某些實(shí)施方案中，在表面的約75A之內(nèi)；或4)在某些實(shí)施方案中，在表面的約50A之內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，比如當(dāng)用能量受體染料和/或化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)涂層所述載體的表面時(shí)，"表面"指用于確定組分是否與所述表面保持非常接近的目的的涂層和本體溶液定義的界面。在某些實(shí)施方案中，"表面"指用于確定組分是否與所述表面保持非常接近的目的的載體的表面。在某些實(shí)施方案中，所述組分可以直接地或間接地附著(例如，通過(guò)覆蓋表面的插入層附著)于所述載體表面。所述附著可以是化學(xué)的(例如，離子或共價(jià)附著)或物理的或其某些組合。例如，可以將化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)涂層在載體表面上，并且可以用能量受體染料涂層得到的構(gòu)建物?？蛇x地，可以將能量受體染料涂層在載體表面上，并且可以接著用化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)涂層得到的構(gòu)建物。在某些實(shí)施方案中，組分可以非常接近地保留在表面上(這是物理保持的一個(gè)實(shí)例)。例如，可以將組分包埋在薄的聚合物網(wǎng)絡(luò)中，使得它們與其它化合物反應(yīng)，但是不能自由地脫選出本體溶液(參見美國(guó)專利No.5，071，909)。如上所述，本發(fā)明提供靈敏的載體上的均相生物測(cè)定，其中定位酶翻轉(zhuǎn)產(chǎn)生受體的定位化學(xué)激發(fā)，其可能與分析物俘獲有關(guān)(即，確定分析物的存在和/或定量)。得到增強(qiáng)、波長(zhǎng)-移位的發(fā)光信號(hào)容易與本體溶液中非特異性、未增強(qiáng)的、未移位的信號(hào)區(qū)別。本文描述的測(cè)定提供了更一般化的和簡(jiǎn)單化的測(cè)定平臺(tái)。載體與其中出現(xiàn)分析物俘獲的表面的尺寸的結(jié)合目的是提供一個(gè)微環(huán)境，該環(huán)境提供與本體溶液中非特異性發(fā)光信號(hào)不同的發(fā)光檢測(cè)信號(hào)。具有受體染料的載體、發(fā)光增強(qiáng)劑和分析物俘獲劑的組合能夠產(chǎn)生發(fā)光檢測(cè)信號(hào)，其可能與分析物俘獲相關(guān)(用于鑒定和/或定量)，并且與非特異性發(fā)光是可區(qū)別的。該測(cè)定是靈敏的，因?yàn)榭梢允褂妹笜?biāo)記來(lái)提供信號(hào)放大。當(dāng)標(biāo)記的分析物俘獲在表面上(以與酶標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)的形式，或者以與酶標(biāo)記的檢測(cè)劑夾心的形式)時(shí)，接近所述載體表面的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)的酶活化引發(fā)能量轉(zhuǎn)移(ET)信號(hào)產(chǎn)生，其與分析物俘獲有關(guān)。接近進(jìn)入本體溶液俘獲事件的酶活化化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)的任何損失都會(huì)引起與ET信號(hào)不同的非特異性信號(hào)。因?yàn)閬?lái)自與包含測(cè)定組件的載體上俘獲事件相關(guān)的酶標(biāo)記出現(xiàn)的發(fā)射，與來(lái)自本體溶液中未結(jié)合的、非特異性酶活性出現(xiàn)的發(fā)射之間的量子產(chǎn)量不同，因而不需要從載體中分離或洗滌過(guò)量的、非復(fù)合的酶標(biāo)記的試劑。為了進(jìn)一步減少非特異性光發(fā)射，可以在本體溶液中或固體載體上使用分子過(guò)濾器比如血紅蛋白或淬滅染料。所述波長(zhǎng)-移位的、增強(qiáng)的信號(hào)可能與分析物俘獲事件成比例。用更復(fù)雜的儀器設(shè)計(jì)(例如，內(nèi)含波長(zhǎng)特異性過(guò)濾器)完全消除可能出現(xiàn)的非復(fù)合酶活性的高能信號(hào)是可能的。然而，實(shí)際上，這通常將是非必需的。載體上的受體染色層、化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑層和俘獲劑的組合不僅促進(jìn)產(chǎn)生均相形式的微分信號(hào)，而且能夠?qū)崿F(xiàn)多路復(fù)用均相測(cè)定設(shè)計(jì)。例如，在均相形式中，所述測(cè)定可以包括1)載體A，涂層有受體染料A、化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑和俘獲試劑A;2)載體B，涂層有受體染料B、化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑和俘獲劑B;和3)載體C，涂層有受體染料C、化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑和俘獲劑C，等。一種多路復(fù)用、均相測(cè)定法描述在圖7中。在多路復(fù)用、均相測(cè)定形式中，每種化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑和/或化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)可以相同或不同，取決于最佳的酶_基質(zhì)_增強(qiáng)劑組合。受體染料A的發(fā)光將與受體染料B的發(fā)光是可區(qū)別的，兩者都與受體染料C的是可區(qū)別的，依次類推。因?yàn)閬?lái)自受體染料的信號(hào)是可測(cè)量的，在所述多路復(fù)用測(cè)定中使用的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑和/或化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)是否相同或不同沒(méi)有關(guān)系。在某些實(shí)施方案中，在載體上實(shí)施的均相測(cè)定可以包括J-聚集的花青染料、聚合的鎗化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑、水解酶標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光的二氧雜環(huán)丁烷基質(zhì)的受體染色層。在載體上俘獲的酶標(biāo)記的分析物引起J-聚集的染色層的定位化學(xué)激發(fā)。該化學(xué)發(fā)光的均相測(cè)定具有一些優(yōu)點(diǎn)。例如，化學(xué)激發(fā)引發(fā)的J-聚集的染料發(fā)光降低了噪音，不需要外部激發(fā)光源，并且可以提供超出任何二氧雜環(huán)丁烷分解引起的顯著地紅移的信號(hào)和典型的與生物學(xué)和細(xì)胞物質(zhì)有關(guān)的自身熒光頻寬。使用J-聚集的染料作為能量轉(zhuǎn)移(ET)受體提供了顯著地紅移檢測(cè)信號(hào)。因此，電流比率計(jì)數(shù)據(jù)收集不是必需的。另外，與溶液中可能出現(xiàn)的未增強(qiáng)的、非特異性二氧雜環(huán)丁烷分解相比，在分析物俘獲的位點(diǎn)，載體上ET信號(hào)的優(yōu)先增強(qiáng)進(jìn)一步減少了電流比率計(jì)測(cè)量的需要。為了進(jìn)一步減少非特異性光發(fā)射，可以在本體溶液中或固體載體上使用分子過(guò)濾器比如血紅蛋白或淬滅染料。作為基于市售光度計(jì)的所有光測(cè)量的信號(hào)檢測(cè)測(cè)定避免了在早期ET-基生物測(cè)定中描述的基于常規(guī)雙重光倍增管(PMT)光度計(jì)的繁瑣電流比率計(jì)測(cè)量。{參見，例如，Patel等人，"ChemiluminescenceEnergyTransfer:ANewTechniqueApplicabletotheStudyofLigand-LigandInteractionsinLivingSystems",Analyt.Biochem.129:162-169(1983);patel等人，"HomogeneousImmunoassayBased0nChemiluminescenceEnergyTransfer",Clin.Chem.29/9，1604-1608(1983);Williams等人，"AHomogeneousAssayForBiotinBasedOnChemiluminescenceEnergyTransfer",Analyt.Biochem.，155:249-255(1986)}。也可以使用酶標(biāo)記代替定向化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)標(biāo)記來(lái)擴(kuò)增檢測(cè)信號(hào)，以增加檢測(cè)靈敏度范圍。本文中描述的測(cè)定，例如可以證實(shí)3個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍，并且最佳化測(cè)定可以進(jìn)一步增加一般ET均相測(cè)定設(shè)計(jì)中的分析物檢測(cè)敏感度(參見，圖4和實(shí)施例B)。本文描述的測(cè)定系統(tǒng)能夠通過(guò)將活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)(即，化學(xué)激發(fā)態(tài)供體)能量轉(zhuǎn)移(ET)到染料受體(例如，熒光受體染料和/或J-聚集的染料)來(lái)檢測(cè)載體表面上存在的(例如俘獲的)分析物。染料受體的波長(zhǎng)-移位發(fā)射特性使設(shè)計(jì)的生物測(cè)定系統(tǒng)提供來(lái)自典型生物分子的或細(xì)胞的背景熒光紅移的非連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。一個(gè)具體實(shí)例是使用J-聚集的染料，其提供快速的、窄的、非連續(xù)的、顯著地從自身熒光紅移的檢測(cè)信號(hào)。—般的測(cè)定法設(shè)計(jì)可以提供任一種化學(xué)發(fā)光的酶底物(例如，二氧雜環(huán)丁烷、吖14啶鎗酯(acridiniumester)、吖啶鎗磺酰亞胺(acridiniumsulfonimide)、9，10-二氫化吖啶、9，10-二氫吖啶烯醇磷酸酯、熒光素或魯米諾)和化學(xué)發(fā)光的表面信號(hào)增強(qiáng)劑，該酶底物和表面信號(hào)增強(qiáng)劑能適應(yīng)載體表面的帶電環(huán)境，以使分析物信號(hào)的產(chǎn)生和鑒別最佳化。例如，所述測(cè)定系統(tǒng)可以包括用化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)聚合物和染料涂層的載體，其中所述載體包括一種或多種適于俘獲分析物的表面結(jié)合生物分子探針。當(dāng)俘獲分析物時(shí)，可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光的信號(hào)，例如來(lái)自由酶標(biāo)記或酶分析物引起化學(xué)激發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷片段來(lái)檢測(cè)該事件。俘獲的分析物引起的化學(xué)發(fā)光信號(hào)容易與非特異性信號(hào)區(qū)別，因此，期望的信號(hào)是波長(zhǎng)_移位的和增強(qiáng)的，以及由所述載體"表面上"的受體染料發(fā)射的。這與由本體溶液發(fā)射的非波長(zhǎng)移位的和未增強(qiáng)的非特異性信號(hào)形成比較。該測(cè)定可用于鑒定和/或定量俘獲的分析物。該生物測(cè)定系統(tǒng)可以使用波長(zhǎng)為約460nm至590nm的化學(xué)激發(fā)，其以能量轉(zhuǎn)移的模式引起受體染料的發(fā)射紅移。波長(zhǎng)為約460nm的化學(xué)激發(fā)引起J_聚集的染料以約610nm的波長(zhǎng)發(fā)射的一個(gè)實(shí)例引起約150nm的Stokes移位。該大的Stokes移位能夠簡(jiǎn)化信號(hào)檢測(cè)和定量，其中信號(hào)定量可以作為基于市售可獲得的光度計(jì)的所有光測(cè)量，而不需要基于常規(guī)光度計(jì)的對(duì)偶濾波器讀數(shù)或雙重光倍增管(PMT)讀數(shù)，并且不需要轉(zhuǎn)化為電流比率計(jì)數(shù)據(jù)。通過(guò)優(yōu)先增強(qiáng)對(duì)應(yīng)于表面_結(jié)合(即俘獲的)分析物的信號(hào)，可進(jìn)一步有助于作為所有光閱讀的簡(jiǎn)化的數(shù)據(jù)收集。所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)可以是水相容性合成的或天然存在的物質(zhì)，對(duì)于由酶活化極性介質(zhì)(即，由作為溶劑的水或水及其它大量或全部極性物質(zhì)組成的介質(zhì)，所述極性物質(zhì)比如甲醇、乙腈、二甲亞砜、二甲基甲酰胺等)中化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)引起的發(fā)光片段，該物質(zhì)可以提供降低質(zhì)子性(protonicity)的疏水性微環(huán)境。根據(jù)微環(huán)境的精確性質(zhì)，在所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)的存在下，化學(xué)發(fā)光的信號(hào)和/或化學(xué)發(fā)光的信號(hào)噪音比可以較高，因?yàn)樗龌瘜W(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)可以防止環(huán)境淬滅來(lái)自發(fā)光片段的化學(xué)發(fā)光發(fā)射。另外，所述信號(hào)可以比單獨(dú)的基本水性環(huán)境中更容易空間分解的(spatiallyresolved)，因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)的存在可以最小化發(fā)光片段的擴(kuò)散，該擴(kuò)散由酶活化來(lái)自所述位點(diǎn)的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)引起，酶反應(yīng)存在于所述位點(diǎn)。所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)可以是具有疏水性區(qū)域的高分子球狀蛋白質(zhì)。所述球狀蛋白質(zhì)可以具有約1，000至約800，000道爾頓，優(yōu)選40，000至約100，000道爾頓的分子量，根據(jù)十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳測(cè)定。示例性的球狀蛋白質(zhì)包括，但不限于哺乳動(dòng)物血清白蛋白，比如牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HAS)，以及哺乳動(dòng)物免疫球蛋白(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)、A蛋白和抗生物素蛋白。所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)可以是合成大分子物質(zhì)(例如，寡聚或聚合的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì))。示例性的合成高分子化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)包括水溶性的或水相容的、溶劑可溶性聚合鎗鹽。在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)使用多種這類聚合物作為擴(kuò)散轉(zhuǎn)移照相系統(tǒng)中的媒染劑(mordents)或圖像-接受層。所述鎗功能基可以位于聚合物(紫羅烯)的主鏈中，或主鏈側(cè)接的基團(tuán)上。帶正電荷的鎗功能基通常是基于氮、磷或硫；然而，可以使用任一種帶正電荷的基團(tuán)?？梢允褂萌我环N這些聚合物作為高分子化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)物質(zhì)。該大類物質(zhì)的示例為具有下式的聚(乙烯基芐基季銨鹽)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>在該式中，每個(gè)基團(tuán)R1、R2和R3各自獨(dú)立地代表具有1至20個(gè)(包括端點(diǎn)值)碳原子的直鏈或支鏈未取代的烷基或鏈烯基(例如，甲基、乙基、正丁基、叔丁基、鯨蠟基等)；具有1至20個(gè)(包括端點(diǎn)值)碳原子的直鏈或支鏈烷基，其被一個(gè)或多個(gè)下述基團(tuán)取代羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、芐氧基或聚乙烯氧基)、芳氧基(例如苯氧基)、氨基或取代的氨基(例如乙酰氨基或膽甾醇基氧基羰基酰氨基)或鹵素或氟代烷或氟代芳基(例如七氟丁基)；具有3至12個(gè)環(huán)碳原子(包括端值)的未取代的單環(huán)烷基(例如環(huán)己基或環(huán)辛基)；具有3至12個(gè)環(huán)碳原子(包括端值)的取代的單環(huán)烷基，其被一個(gè)或多個(gè)下述基團(tuán)取代烷基、烷氧基、鹵烷基或稠合的苯并基團(tuán)(例如二甲基環(huán)己基或四氫萘基)；具有兩個(gè)或多個(gè)稠環(huán)的多環(huán)烷基，每個(gè)環(huán)具有5至12個(gè)碳原子(包括端值)，其是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)烷基、烷氧基或芳基取代的(例如1-金剛烷基或3-苯基-1-金剛烷基)；具有至少一個(gè)環(huán)和總共6至20個(gè)碳原子的芳基、烷芳基或芳烷基，其是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)下述基團(tuán)取代烷基、芳基、鹵素、氟代烷基或氟代芳基(例如苯基、萘基、五氟苯基、乙基苯基、節(jié)基、氯-或氟節(jié)基或苯基節(jié)基)；至少兩個(gè)上述R基團(tuán)(即1^、12或13基團(tuán))與它們鍵合的四價(jià)原子一起形成具有3至5個(gè)碳原子(包括端值)和1至3個(gè)雜原子(包括端值)的飽和的或不飽和的、未取代的或取代的含氮、氮和含氧、或氮和含硫環(huán)，其可以是苯并環(huán)的，例如l-吡啶鎗、l-(3-烷基或芳烷基)咪唑鎗、嗎啉鎗、烷基或丙烯基哌啶鎗、苯并噁唑鎗、苯并噻唑鎗、或苯并咪唑鎗所述符號(hào)X—代表陰離子平衡離子，其可以包括單獨(dú)的或組合的部分比如鹵酸根(例如，氯酸根或溴酸根)、硫酸根、烷基磺酸根(例如甲磺酸根)、三氟甲磺酸根、芳基磺酸根(例如對(duì)-甲苯磺酸根)、高氯酸根、烷羧酸根(例如乙酸根)、芳基羧酸根、或熒光平衡離子(例如熒光素或熒光素衍生物)、9，10-二苯基蒽硫酸根、或羅丹明磺酸根(sulforhod咖ine)衍生物。所述符號(hào)n可以代表使聚(乙烯基節(jié)基)季銨鹽的分子量為約8，000至1，000，000或以上的數(shù)字，所述分子量根據(jù)低角度激光散射(LALLS)技術(shù)測(cè)定?？捎米骰瘜W(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)的其它示例性的聚合鎗鹽包括下式中描述的磷鎗或16<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在上式中，M可以是氮或磷。各個(gè)R、f和lf基團(tuán)或各個(gè)X-為如上定義的。在式IV中，在一個(gè)側(cè)鏈鎗部分中的一個(gè)或多個(gè)M、R、R2或R3取代基與在其它側(cè)鏈鎗部分中的相應(yīng)取代基不同。所述符號(hào)x和y代表所述共聚物包括的獨(dú)立單體的摩爾分?jǐn)?shù)。因此，所述符號(hào)x和y可以各自不同，為0.01至0.99，x和y的總和等于1。其中一個(gè)單體為烯類不飽和鎗單體而其它(或其它的)為電荷-中性的共聚物或嵌段共聚物也可以用作化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)。這些及能夠提供增強(qiáng)來(lái)自化學(xué)發(fā)光的種類比如酶_活化的1，2-二氧雜環(huán)丁烷的光發(fā)射的其它高分子可以在美國(guó)專利Nos.5，145，772和5，827，650中找到。將這兩篇專利的全部?jī)?nèi)容都引入本文作為參考。也可以使用二陽(yáng)離子表面活性劑作為化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)。這些二陽(yáng)離子表面活性劑可以是下式代表的X-(R4)3A+CH2_[LINK]_CH2A+(R5)3X—其中各個(gè)A獨(dú)立地選自磷和氮原子；X—為陰離子平衡離子；各個(gè)R4和R5獨(dú)立地選自未取代的和取代的包含1至20個(gè)碳原子的烷基和芳烷基，因此R4和R5可以相同或不同；禾口[LINK]為選自下述的碳鏈包含4至20個(gè)碳原子的二亞烷基芳基、芳基、亞烷基、亞烯基和亞炔基?？梢杂米骰瘜W(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑的二陽(yáng)離子表面活性劑描述在美國(guó)專利No.5，451，347中，將其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。除了前述聚合物之外或代替其，可以用作增強(qiáng)劑物質(zhì)的其它水溶性的寡聚、均聚和共聚物質(zhì)包括聚-N-乙烯基噁唑烷酮；聚乙烯氨基甲酸酯(例如聚乙烯丙烯基氨基甲酸酯)；聚羥基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯[例如，聚(e-羥乙基)甲基丙烯酸酯和聚乙二醇單甲基丙烯酸酯];用烷基化或芳基烷基化試劑季銨化的含胺低聚物(例如Jeffamines);合成多肽(例如聚賴氨酸或苯丙氨酸)；[O107]聚乙烯烷基醚(例如聚乙烯甲醚)；多元酸及其鹽[例如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯基苯甲酸、聚乙烯基磺酸、聚丙烯酸氨基甲基丙烷磺酸、聚馬來(lái)酸和聚(N-乙烯基琥珀酰胺酸)];來(lái)源于氨或環(huán)狀和非環(huán)狀伯胺或仲胺的聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺；聚乙烯醇和聚乙烯醇與乙酸乙烯酯、乙烯等的共聚物；聚2_、3-或4-乙烯基吡啶鎗鹽，其中雜環(huán)氮原子鍵合如對(duì)于上述式I中的R1、R2和R3定義的基團(tuán)；聚乙烯烷基吡咯烷酮(例如聚乙烯甲基吡咯烷酮)；聚乙烯烷基噁唑烷酮(例如聚乙烯甲基噁唑烷酮)；支鏈聚乙烯亞胺、?；闹ф溇垡蚁﹣啺坊蜻M(jìn)一步用烷基或芳烷基季銨化的?；闹ф溇垡蚁﹣啺?；來(lái)源于氨或環(huán)狀和非環(huán)狀伯胺或仲胺的聚N-乙烯胺、及其季銨鹽；聚乙烯哌啶；或聚丙烯?；?、聚甲基丙烯?；?-乙烯基苯甲酰基胺化酰亞胺或聚乙烯芐基胺化酰亞胺，其中帶正電荷氮原子上的其它取代基可以是上式I中定義的R1、12和W基團(tuán)中的一個(gè)。上述寡聚或聚合化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)可以具有上述對(duì)于式I的聚(乙烯基芐基季銨鹽)給出的范圍內(nèi)的分子量。帶正電荷水溶性或水相容性溶劑可溶性小分子鎗鹽也可以用作化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)，以增強(qiáng)載體上的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。所述小分子鎗鹽可以具有在氮、磷或硫上帶正電荷的鎗基，或者包括結(jié)構(gòu)中任何其它帶正電荷基團(tuán)。所述平衡離子可以包括單獨(dú)或組合的部分，比如鹵酸根(例如，氯酸根或溴酸根)、硫酸根、烷基磺酸根(例如甲磺酸根)、三氟甲磺酸根、芳基磺酸根(例如對(duì)_甲苯磺酸根)、高氯酸根、烷羧酸根(例如乙酸根)、芳基羧酸根或熒光平衡離子?？梢酝ㄟ^(guò)使用如在美國(guó)專利No.5，547，836中描述的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)添加劑調(diào)節(jié)如上所述聚合物的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)作用?？梢栽趯⑺龌瘜W(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)應(yīng)用于表面之前或之后，將所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)添加劑應(yīng)用于載體表面?？蛇x地，可以將所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)添加劑與化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)混合，并將得到的混合物應(yīng)用于載體表面。所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)添加劑可以改善化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)形成疏水性區(qū)域的能力，在疏水性區(qū)域中，在不存在水下，可以分離二氧雜環(huán)丁烷氧離子和得到的放射體，使其分解和化學(xué)發(fā)光，因而減少了其引起的光淬滅反應(yīng)。所述增強(qiáng)添加劑可以從多種化合物中任一種得到。示例性的增強(qiáng)添加劑包括表面活性劑(例如洗滌劑)、帶負(fù)電的鹽和溶劑。表面活性劑可以改善化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)形成相對(duì)穩(wěn)定的疏水性區(qū)域的能力。表面活性劑可以是陽(yáng)離子的、陰離子的、兩性離子的或中性的。當(dāng)加入到溶液中時(shí)，其似乎改善增強(qiáng)物質(zhì)分離活性二氧雜環(huán)丁烷種類，和在任何情況下引起化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)的另一類型的增強(qiáng)添加劑包括帶負(fù)電的鹽。在極低濃度下也有活性的第三類型的增強(qiáng)添加劑為疏水性溶劑，包括，但不限于醇類。第四個(gè)有效類型的增強(qiáng)添加劑為非四價(jià)水溶性聚合物，比如聚(2-乙基-Z-噁唑啉(PolyOx)。雖然這些聚合物自身可以引起化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有限增強(qiáng)，而沒(méi)有增加背景噪聲，但是使用非_四價(jià)水溶性聚合物與聚合四價(jià)鎗鹽的組合可以改善載體比如微點(diǎn)陣上的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。可以通過(guò)獨(dú)立地混合一種或多種增強(qiáng)物質(zhì)(例如球狀蛋白質(zhì)、合成鎗或非鎗聚合物或共聚物)和一種或多種增強(qiáng)添加劑獲得化學(xué)發(fā)光信號(hào)和信號(hào)噪聲比(S/N)的進(jìn)一步完善。所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)聚合物可以是TPQ聚合物，其具有如下列出的結(jié)構(gòu)。CH廣CH、<'N(正戊基)3;+其它示例性化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)聚合物包括，但不限于聚(乙烯基節(jié)基二甲基節(jié)基氯化銨)(B匿Q)，聚(乙烯基節(jié)基三甲基氯化銨)(TMQ)，聚(乙烯基節(jié)基三丁基氯化銨)(TBQ)，19聚(乙烯基節(jié)基三丁基氯化磷鎗)(TB)，聚(乙烯基節(jié)基三辛基氯化磷鎗)(TO)及其共聚物。所述受體染料可以選自具有其單峰激發(fā)態(tài)比化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)的激發(fā)態(tài)更低能量的任一種熒光化合物。從化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)至受體染料的能量共振轉(zhuǎn)移引起紅移發(fā)射。受體染料的實(shí)例包括，但不限于熒光染料、芳香化合物包括萘類、蒽類、芘類、聯(lián)苯類；吖啶；香豆素類；咕噸類；酞菁類；l，2-二苯乙烯類；呋喃類、噁唑類、噁二唑類；和苯并噻唑類?？梢杂米髂芰渴荏w染料的示例性的染料也公開在U.S.專利Nos.6，028，190;6，335，440B1;6，849，745B2;和7，169，939B2中。所述染料可以選自能夠在載體表面上形成J-聚集體的染料(例如花青類)。所述染料在載體表面上形成J-聚集體的能力使其可用于均相化學(xué)發(fā)光的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。J-聚集的染料顯示出非常特征性窄帶(例如15-20nmfwhm)，和來(lái)自單體染料發(fā)射(例如約530nm)、二氧雜環(huán)丁烷發(fā)射(例如約460nm至590nm)和生物分子或細(xì)胞的背景發(fā)光(例如約350nm)的顯著地發(fā)射紅移(例如約80-250nm)。所述花青染料可以是陰離子花青染料。所述陰離子花青染料可以具有如下列出的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>所述載體可以具有用陽(yáng)離子化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)(例如具有帶正電荷的鎗基的陽(yáng)離子均聚物或共聚物)涂層的帶負(fù)電的表面。如果所述載體具有帶負(fù)電的表面，則可以用陽(yáng)離子化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)涂層該帶負(fù)電的表面。然后，可以用陰離子受體染料涂層得到的構(gòu)建物?？蛇x地，如果所述載體具有帶正電荷的表面，則可以用陰離子受體染料涂層該表面，接著用陽(yáng)離子化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)涂層。為了獲得載體表面上染料和增強(qiáng)劑的有效多層涂層，在載體上涂層染料和增強(qiáng)劑層的順序，和染料和增強(qiáng)劑的物理性質(zhì)(即帶電荷和/或疏水性)可以變化。在某些實(shí)施方案中，可以將受體染料和化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑混合在單層中，或者將其與載體結(jié)合成一體。包括化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑和染料的示例性制劑公開在美國(guó)專利No.5，145，772中。在某些實(shí)施方案中，所述受體染料和/或化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑可以被俘獲聚合物網(wǎng)絡(luò)中。當(dāng)所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑為聚合物時(shí)，可以配制所述增強(qiáng)劑形成表面上的薄涂層，并且包埋所述受體染料或改良形式的受體染料。例如，可以將受體染料標(biāo)記的肽包埋在包括聚合化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑的層中。包埋肽的方法公開在美國(guó)專利No.5，071，909中。例如，染料可以連接多肽，可以使用在美國(guó)專利No.5，071，909中公開的方法包埋得到的構(gòu)建物。所述分子過(guò)濾器可以是屏蔽或淬滅干擾要檢測(cè)的信號(hào)的光發(fā)射的任何分子。分子過(guò)濾器的實(shí)例包括，但不限于血紅蛋白和淬滅染料，比如dabcyl、DPX(Invitrogen#X1525)和DNPC2胺(AnaSpeC#81821)?？梢允褂闷帘位虼銣绺蓴_要檢測(cè)的信號(hào)的光發(fā)射的任何分子。所述生物分子探針可以是或者可以包括包括抗體、多核苷酸、寡核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)、受體、凝集素和/或適體。在某些實(shí)施方案中，所述生物分子探針包括一種探針，其中該探針為抗體、多核苷酸、寡核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)、受體、凝集素和/或適體。所述酶分析物或酶標(biāo)記可以是能夠活化化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)的任何酶。實(shí)例為氧化酶，比如辣根過(guò)氧化酶，和水解酶，包括但不限于堿性磷酸酶、P_半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶。在免疫測(cè)定的情況下，當(dāng)俘獲分析物時(shí)，可以用以?shī)A心測(cè)定形式附著于檢測(cè)器抗體或附著于俘獲分析物的水解酶標(biāo)記來(lái)檢測(cè)該俘獲事件。當(dāng)使用二氧雜環(huán)丁烷作為化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)時(shí)，裂解可能是由水解酶活化引發(fā)。利用該事件，所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)的勢(shì)能(例如，二氧雜環(huán)丁烷基質(zhì)的四元過(guò)氧化物環(huán)的勢(shì)能)被釋放，以激發(fā)芳基酯片段至單峰激發(fā)態(tài)。該單峰激發(fā)態(tài)片段弛豫至基態(tài)轉(zhuǎn)移能量至載體表面上的近側(cè)受體染料(例如J-聚集的染料)，然后，其可發(fā)光。如果所述能量受體為J-聚集體，則發(fā)射縮窄并紅移。如上所述，所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)可以為1，2-二氧雜環(huán)丁烷基質(zhì)。例如，l，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)可以為CDP-Star,可從AppliedBiosystems獲得。CDP-Star⑧具有化學(xué)名稱2-氯-5-(4-甲氧基螺環(huán)(l，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2'-(5'-氯代)_三環(huán)[3.3.1.I3'7]癸烷}-4-基)-1-苯基磷酸二鈉，其結(jié)構(gòu)如下1，2_二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)可以是080@,其也可以從AppliedBiosystems獲得。CSPD具有化學(xué)名稱3_(4-甲氧基螺環(huán){1，2_二氧雜環(huán)丁烷_3，2'_(5'-氯代)_三環(huán)[3.3.1.13'7]癸烷}-4-基)-1-苯基磷酸二鈉，其結(jié)構(gòu)如下Cl1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)可以為TFE-CDP-Star,其也可以從Applied21Biosystems獲得，其具有如下所述化學(xué)結(jié)構(gòu)前述的1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)僅僅為示例性的，可以使用其它1，2-二氧雜環(huán)丁烷基質(zhì)。測(cè)定中的分析物可以是任何感興趣的分析物，所述測(cè)定中存在已知所述分析物特異性結(jié)合的化合物(即探針或生物分子探針)。例如，所述分析物可以是酶?？蛇x地，所述分析物可以是酶標(biāo)記的化合物，或者當(dāng)分析物結(jié)合載體上的探針時(shí)，其結(jié)合分析物的酶標(biāo)記的生物分子。在某些實(shí)施方案中，所述分析物可以是未標(biāo)記的，并且可以與已經(jīng)加入到樣品中的酶標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合載體表面上的生物分子探針。所述酶標(biāo)記可以是堿性磷酸酶。所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)可以是030@或cdp-Star,所述酶標(biāo)記可以是堿性磷酸酶。還提供一種用于檢測(cè)樣品中多種分析物的方法。所述方法包括用第一制品接觸樣品，所述制品包括具有表面的載體；所述載體表面上的第一化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第一能量受體染料；包括能夠結(jié)合第一分析物的第一探針的載體_結(jié)合的第一生物分子探針。根據(jù)該方法，當(dāng)存在于樣品中時(shí)，第一探針結(jié)合第一分析物。所述方法還包括用第二制品接觸樣品，所述制品包括具有表面的載體；所述載體表面上的第二化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第二能量受體染料；包括能夠結(jié)合第二分析物的第二探針的載體_結(jié)合的第二生物分子探針。根據(jù)該方法，當(dāng)存在于樣品中時(shí)，第二探針結(jié)合第二分析物。然后，樣品中的第一和第二分析物分別結(jié)合第一和第二探針。對(duì)于使用酶擴(kuò)增的測(cè)定，可以應(yīng)用下述條件之一(a)第一分析物為第一酶，(b)用第一酶標(biāo)記第一分析物，(c)用第一酶標(biāo)記的生物分子(并且當(dāng)?shù)谝环治鑫锝Y(jié)合在載體表面上的第一探針時(shí)，其能夠結(jié)合第一分析物)接觸第一制品的載體表面；或(d)第一分析物為未標(biāo)記，和將第一酶標(biāo)記的第一分析物加入到樣品中，以使樣品中的酶-標(biāo)記的第一分析物與未標(biāo)記的第一分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合第一制品的第一探針。對(duì)于第二分析物、第二酶、第二探針和第二制品，可以應(yīng)用相應(yīng)的條件。在樣品中的第一和第二分析物分別結(jié)合第一和第二探針之后，用第一酶活化的第一化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸第一制品?；罨牡谝换瘜W(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第一能量受體染料，引起其發(fā)射。類似地，用第二酶活化的第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸第二制品。活化的第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第二能量受體染料，引起從其中發(fā)射。然后，檢測(cè)來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射和來(lái)自第二能量受體染料的發(fā)射。來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射可以與來(lái)自第二能量受體染料的發(fā)射區(qū)別。在所述多路復(fù)用測(cè)定中，第一和第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)可以相同或不同。第一和第二化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)也可以相同或不同。另外，可以同時(shí)或順次用樣品接觸所述第一和第二制品。也可以同時(shí)或順次用第一和第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸所述第一和第二制品。也可以同時(shí)或順次檢測(cè)來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射和來(lái)自第二能量受體染料的發(fā)射。雖然如上描述了酶擴(kuò)增，但是也可以使用化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記。特別地，可以用化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記分析物?？蛇x地，可以用化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記的生物分子接觸載體表面，當(dāng)分析物結(jié)合載體上的探針時(shí)，所述生物分子結(jié)合所述分析物。作為進(jìn)一步的選擇，分析物可以是未標(biāo)記的，并且可以將用化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記的分析物加入到樣品中，之后使樣品中的分析物結(jié)合探針，從而與未標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述探針。然后，可以活化化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記。來(lái)自活化化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記的能量轉(zhuǎn)移至載體上的能量受體染料引起發(fā)光，該發(fā)光可以被檢測(cè)，并且可以使用其測(cè)定樣品中分析物的存在和/或含量。實(shí)施例根據(jù)下述實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明教導(dǎo)的方面，其不應(yīng)被理解為以任何方式限制本發(fā)明教導(dǎo)的范圍。A.IgG-AP測(cè)定因?yàn)橐恍┰颍褂肞OROS⑧-A作為載體，用于模型生物測(cè)定研究。A蛋白-涂層的POROS⑧顯示出整體弱的負(fù)表面電荷，其使得用陽(yáng)離子聚合化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑比如TPQ涂層，接著用陰離子花青染料涂層(例如，形成？01108@/^9/花青染料構(gòu)建物，比如圖i中圖解的一種)?；谌菀自赑OROS⑧-hs上引起j-聚集，其也具有整體負(fù)電荷，預(yù)期在POROS.-A上涂層的陰離子花青染料也在載體表面上形成J-聚集體。可以通過(guò)簡(jiǎn)單地一起培養(yǎng)A蛋白和IgG，形成非常緊密地復(fù)合物(Ka=109M)來(lái)進(jìn)行A蛋白禾卩IgG抗體結(jié)合(Akerstrom等人，"APhysicochemicalStudyofProteinG，aMoleculewithUniquelmmunoglobulinG_BindingProperties,〃J.Biol.Chem.，1986，261:10240-10247)。如果將用堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG抗體引入包含P0R0S⑧-A/TPQ/J-聚集體構(gòu)建物的溶液中，則分析物(堿性磷酸酶)將被俘獲在用J-聚集的花青和TPQ增強(qiáng)劑涂層的？01103@表面上。然后，基于在J-聚集的染料表面附近或之上出現(xiàn)的信號(hào)產(chǎn)生(例如，化學(xué)激發(fā)由激發(fā)態(tài)二氧雜環(huán)丁烷片段涂層的J-聚集的染料)的接近程度，進(jìn)行分析物檢測(cè)。為了獲得有效地能量轉(zhuǎn)移至J-聚集的花青涂層，所述化學(xué)激發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷片段可以是從J-聚集的組裝距離0至100埃(即，0-10nm)范圍內(nèi)(Lakowicz，〃PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy〃，第二片反，KluwerAcademic/PlenumPress,第388頁(yè))。如圖i所示，由表面-俘獲的堿性磷酸酶引起的二氧雜環(huán)丁烷cdp-star⑧的藍(lán)色460nm能態(tài)經(jīng)受表面TPQ增強(qiáng)和能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生在約600nm具有窄發(fā)射帶寬的J_聚集體發(fā)射。盡管可以觀察到集中在460nm的某些藍(lán)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，但這被最小化，因?yàn)樵谒嘀腥鄙倬酆显鰪?qiáng)。對(duì)于均相測(cè)定，對(duì)于分析物檢測(cè)和定量，僅僅可以測(cè)定紅色熒光信號(hào)(590-620nm)。該信號(hào)可能與在？01103*_A表面上發(fā)生的事件有關(guān)。在堿性磷酸酶作為分析物的均相測(cè)定中，使用POROS⑧-A/TPQ/J-聚集的構(gòu)建物。在將用堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG抗體引入包含P0R0S⑧-A/TPQ/J-聚集體的構(gòu)建物的溶液中時(shí)，用J-聚集的花青和TPQ增強(qiáng)劑涂層的？01103@表面上的A蛋白俘獲分析物(堿性磷酸酶)?；谠贘-聚集體的涂層表面附近或之上出現(xiàn)的信號(hào)產(chǎn)生(例如，化學(xué)激發(fā)由激發(fā)態(tài)二氧雜環(huán)丁烷片段涂層的J-聚集體)的接近程度，檢測(cè)分析物。由表面-俘獲的堿性磷酸酶引起的藍(lán)色460nm二氧雜環(huán)丁烷CDP-Star⑧激發(fā)經(jīng)受表面TPQ增強(qiáng)和能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生在約600nm具有窄發(fā)射帶寬的J-聚集體發(fā)射。從低效率能量轉(zhuǎn)移引起的任何藍(lán)色化學(xué)發(fā)光信號(hào)(最大460nm)被最小化，因?yàn)樵谒嘀腥鄙倬酆显鰪?qiáng)。對(duì)于均相測(cè)定，僅僅可以測(cè)定紅色熒光信號(hào)(590-620nm)用于分析物檢測(cè)和定量的測(cè)量。J_聚集的染料在POROS⑧_A表面上產(chǎn)生的信號(hào)與POROS⑧_表面上發(fā)生的事件有關(guān)。在CareyEclipse熒光計(jì)上，從96-微量滴定板測(cè)量從CDP-Star⑧到俘獲在POROS-20A表面上的花青J-聚集體的能量轉(zhuǎn)移效率，作為紅色/藍(lán)色信號(hào)強(qiáng)度的比率。每個(gè)孔包含10ii1的一系列POROS②_20A/IgG-AP/TPQ染料構(gòu)建物在BSA/PBS中的1:2稀釋液和90iil在pH9.5的AMP緩沖液中的0.4mMCDP-Star⑧的混合物。光譜和數(shù)據(jù)概括在下表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>強(qiáng)度比為來(lái)自POROS20A/IgG-AP/TPQ/染料稀釋液和CDP-Star⑧的。如在597-615nm存在主要的J-聚集體發(fā)射所顯示的，能量轉(zhuǎn)移效率良好。僅僅在較低稀釋試驗(yàn)中在442-447納米處檢測(cè)到殘留二氧雜環(huán)丁烷發(fā)射，但是強(qiáng)度比仍然很高(甚至在受體的1/64稀釋液中，紅色/藍(lán)色強(qiáng)度比=12)。也進(jìn)行了一系列試驗(yàn)，來(lái)確定在？01103@-2(^構(gòu)建物表面上分析物俘獲(IgG-AlkPhos)的相對(duì)檢測(cè)曲線。通過(guò)用在BSA/PBS中的P0R0S⑧20A/TPQ/陰離子花青染料組裝和在pH9.5的AMP-CI緩沖液中的0.4mMCDP-Stai^的標(biāo)準(zhǔn)混合物培養(yǎng)在AMP緩沖液中的一系列兔子抗小鼠IgG-AP稀釋液來(lái)測(cè)定堿性磷酸酶的檢出限。在有和沒(méi)有600nm寬帶濾波器的Turner光度計(jì)上，由所有化學(xué)發(fā)光信號(hào)生成檢測(cè)曲線。IgG-AP檢測(cè)測(cè)定的試驗(yàn)設(shè)計(jì)戶6^^^構(gòu)建物的制備1.移液0.15ml(25mg)的POROS⑧'-20A漿液，將其懸浮在0.85ml的H20中。2.離心并棄去上清液。3.在lml的H20中洗滌珠粒3次。4.將珠粒懸浮在1ml的TPQ儲(chǔ)備溶液(2mg/mlH20)中。5.在板式攪拌器上培養(yǎng)60分鐘。6.棄去上清液，并連續(xù)在1ml的水中洗滌珠粒兩次，再在1ml的40%MeOH/H20中洗滌1次。7.將珠粒懸浮在40%的MeOH/H20中，并加入20y1的染料儲(chǔ)備溶液(100mg/2mlMeOH)。8.包裝在鋁箔中，并在板攪拌器上培養(yǎng)60分鐘。9.棄去橙色上清液，其在水溶液中形成粉紅色乳劑。10.連續(xù)在1ml的水中和在1ml的BSA/PBS中洗滌粉紅色珠粒3次。11.將最終珠粒懸浮在1ml的BSA/PBS中，并儲(chǔ)存在冰箱中暗處。IgG-AP結(jié)合測(cè)定1.制備一系列1:10的IgG-AP稀釋液。2.將10ill的POROS⑧構(gòu)建物放置在試管中。3.將10ill的IgG-AP稀釋液加至試管中。4.在室溫下，培養(yǎng)該混合物10分鐘。5.加入80ill的0.4mMCDP-Star。6.在室溫下，輕輕地振搖該混合物30或60分鐘。7.將試管放置在37t:的Turner光度計(jì)中，立即收集信號(hào)10分鐘。檢出限l:IOO百萬(wàn)稀釋的IgG-AP得到S/n〉2(60分鐘的0.4mMCDP-Star培養(yǎng)；沒(méi)有過(guò)濾器讀數(shù)(nofItersforreadout))當(dāng)CDP-star⑧的兩次培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到60分鐘時(shí)，檢出限(s/n>2)改善了10倍，從igG-AP的i:10百萬(wàn)稀釋達(dá)到了1:ioo百萬(wàn)稀釋。B.競(jìng)爭(zhēng)性cAMP測(cè)定使用J-聚集體載體構(gòu)建物提供用于cAMP的競(jìng)爭(zhēng)性均相測(cè)定的載體。將cAMP抗體層壓在POROS⑧-A/TPQ/J-聚集體構(gòu)建物上，如圖2所示。用TPQ增強(qiáng)劑和J-聚集的花青染料涂層所述？01103@4表面。cAMP抗體競(jìng)爭(zhēng)俘獲加入到樣品中的分析物(cAMP)和cAMP-堿性磷酸酶結(jié)合物，如圖3所示?；谠贘-聚集體涂層表面附近或之上出現(xiàn)的信號(hào)產(chǎn)生(例如，化學(xué)激發(fā)由激發(fā)態(tài)二氧雜環(huán)丁烷片段涂層的J-聚集體)的接近程度，檢測(cè)與cAMP分析物競(jìng)爭(zhēng)的cAMP-堿性磷酸酶。如從圖3中可以看出，由表面俘獲的堿性磷酸酶引起的藍(lán)色460nm二氧雜環(huán)丁烷。0-31&1@激發(fā)經(jīng)受表面19增強(qiáng)和能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生在約60011111具有窄發(fā)射帶寬的-聚集體發(fā)射。從低效率能量轉(zhuǎn)移引起的任何藍(lán)色化學(xué)發(fā)光信號(hào)(最大460nm)被最小化，因?yàn)樵谒嘀腥鄙倬酆显鰪?qiáng)。如圖4所示，經(jīng)過(guò)從0.1-100皮摩爾/孔的3個(gè)數(shù)量級(jí)檢測(cè)cAMP分析物，所述圖4為顯示使用40ii1在？01103@構(gòu)建物上的cAMP抗體和1:50稀釋的cAMP-堿性磷酸酶結(jié)合物的均相cAMP測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5為使用圖2的構(gòu)建物進(jìn)行均相cAMP-AP測(cè)定的能量轉(zhuǎn)移(ET)光譜。將所述POROS-A/cAMP抗體/TPQ/J-聚集體構(gòu)建物懸浮在240yl包含0.1%BSA的PBS緩沖液中，在室溫下，用10iil的cAMP-AP結(jié)合物(過(guò)量)培養(yǎng)60分鐘。將20iil得到的槳液放25置在96-孔微量培養(yǎng)板中，并用80ill在pH9.5的AMP緩沖液中的0.4mMCDP-S1汪『@溶液處理。在37。C培養(yǎng)30分鐘之后，用SpectraMaxM2(MolecularDevicesCorp.)測(cè)量光譜。如可以從圖5可見，發(fā)射峰高度的比率(紅色在600nm:藍(lán)色在460nm)大于56:1。細(xì)cAMP靜性測(cè)隨i揚(yáng)殳i十A.cAMP構(gòu)建物的制備1.移液0.3ml(50mg)的POROS⑧_20A漿液，將其懸浮在0.7ml的PBS中。2.離心并棄去上清液。3.在1ml的PBS中洗滌珠粒4次。4.將珠粒懸浮在1ml的PBS中，并加入40ii1的兔子cAMP抗體。5.在板式攪拌器上培養(yǎng)60分鐘。6.棄去上清液，并連續(xù)在1ml的PBS中洗滌5次，再在1ml的H20中洗滌1次。7.將珠粒懸浮在1ml的TPQ儲(chǔ)備溶液(2mg/mlH20)中。8.在板式攪拌器上培養(yǎng)60分鐘。9.棄去上清液，并連續(xù)在每次1ml的水和在20%的MeOH/H20中洗滌珠粒。10.將珠粒懸浮在20%的MeOH/H20中，并加入30ii1的染料儲(chǔ)備溶液(100mg/2mlMeOH)。11.包裝在鋁箔中，并在板式攪拌器上培養(yǎng)60分鐘。12.棄去橙色上清液，其在水溶液中形成粉紅色乳劑。13.連續(xù)在1ml的H20中洗滌粉紅色珠粒、在1ml的BSA/PBS中洗滌3次和在1ml的Tris緩沖液(pH=7.0)中洗滌兩次。14.將最終珠粒懸浮在1ml的Tris緩沖液中，并儲(chǔ)存在冰箱中暗處。B.cAMP競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定1.將50iU/孔的一系列cAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液的1:10稀釋液和25iU/孔的稀釋cAMP-AP結(jié)合物加入到96-微量滴定板的孔中，并在板式攪拌器上混合10分鐘。攪拌器2.加入5ii1/JLWPOROScAMP構(gòu)建物。3.在板式攪拌器上培養(yǎng)60分鐘。4.加入60ill的0.4mMCDP-.Star,并在板式攪拌器上混合10分鐘。5.將板放置在29t:的光度計(jì)TR717中，在20和50分鐘之后測(cè)量信號(hào)。圖6為圖解使用載體的夾心測(cè)定的示意圖，所述載體包括表面、化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑(即TPQ)、陰離子花青染料(例如J-聚集體染料)、用于俘獲樣品中分析物的生物分子探針(即俘獲抗體)和能夠結(jié)合所述載體結(jié)合分析物的酶標(biāo)記的抗體。如圖6圖解的，二氧雜環(huán)丁烷基質(zhì)的酶的翻轉(zhuǎn)產(chǎn)生活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)，其分解產(chǎn)生光，該光通過(guò)能量轉(zhuǎn)移(ET)，使花青染料產(chǎn)生熒光。圖7為描述一種多路復(fù)用、均相夾心測(cè)定的示意圖。如圖7所示，經(jīng)由俘獲的第一分析物(分析物1)結(jié)合第一載體的第一酶(酶1)活化化學(xué)發(fā)光的供體產(chǎn)生化學(xué)激發(fā)的供體，其通過(guò)能量轉(zhuǎn)移使第一載體表面上的第一染料(染料1)產(chǎn)生熒光。還如圖7所示，經(jīng)由俘獲的第二分析物(分析物2)結(jié)合第二載體的第二酶(酶2)活化化學(xué)發(fā)光的供體產(chǎn)生化學(xué)激發(fā)的供體，其通過(guò)能量轉(zhuǎn)移使第二載體表面上的第二染料(染料2)產(chǎn)生熒光。來(lái)自第二染料的熒光發(fā)射可以與來(lái)自第一染料的發(fā)射不同。因此，可以同時(shí)或順次檢測(cè)樣品中的多種分析物。雖然前述說(shuō)明書教導(dǎo)了本發(fā)明的原理，以及提供了用于說(shuō)明目的的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，通過(guò)閱讀本發(fā)明公開的內(nèi)容，在沒(méi)有背離本發(fā)明的真實(shí)范圍之內(nèi)，可以進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)的各種改變。權(quán)利要求一種制品，其包括包括表面的載體；所述載體表面上的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的能量受體染料；和所述載體表面上的一種或多種生物分子探針。2.權(quán)利要求l的制品，其中所述能量受體染料為J-聚集的染料。3.權(quán)利要求1的制品，其中所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)是包括帶正電荷的鎗基的陽(yáng)離子均聚物或共聚物。4.權(quán)利要求3的制品，其中所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)包括聚(乙烯基芐基二甲基芐基氯化銨)(B匿Q)、聚(乙烯基節(jié)基三甲基氯化銨)(TMQ)、聚(乙烯基節(jié)基三丁基氯化銨)(TBQ)、聚(乙烯基節(jié)基三(正戊基)氯化銨)(TPQ)、聚(乙烯基節(jié)基三丁基氯化轔)(TB)、聚(乙烯基芐基三辛基氯化轔)(TO)、兩種或多種任意的前述物質(zhì)或包括一種或多種前述物質(zhì)的共聚物。5.權(quán)利要求1的制品，其中所述載體為顆粒。6.權(quán)利要求1的制品，其中所述載體包括膠乳、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯酰胺或聚(苯乙烯二乙烯基苯)珠粒。7.權(quán)利要求2的制品，其中所述J-聚集的染料為花青染料。8.權(quán)利要求1的制品，其中所述一種或多種生物分子探針包括抗體、多核苷酸、寡核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)、受體、凝集素或適體。9.權(quán)利要求2的制品，其中所述載體具有陰離子表面，所述化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)為在所述載體表面上的陽(yáng)離子均聚物或共聚物，且所述J-聚集的染料為在所述陽(yáng)離子均聚物或共聚物上的陰離子染料。10.權(quán)利要求9的制品，其中所述陰離子染料為具有如下給出的結(jié)構(gòu)的陰離子花青染料<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>11.一種用于檢測(cè)樣品中分析物的試劑盒，其包括權(quán)利要求1的制品，其中所述一種或多種表面_結(jié)合生物分子探針包括能夠結(jié)合分析物的探針，或者當(dāng)存在分析物時(shí)，結(jié)合分析物的探針；化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)；禾口任選地，酶標(biāo)記的生物分子或酶標(biāo)記的分析物。12.權(quán)利要求ll的試劑盒，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)為二氧雜環(huán)丁烷、吖啶鎗酯、吖啶鎗磺酰亞胺、9，10-二氫化吖啶、9，10-二氫化吖啶烯醇磷酸酯、熒光素或魯米諾。13.權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)為1，2-二氧雜環(huán)丁烷基質(zhì)。14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)具有如下給出的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>15.權(quán)利要求ll的試劑盒，其中所述酶標(biāo)記是水解酶。16.權(quán)利要求ll的試劑盒，其中所述酶標(biāo)記選自堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶和神經(jīng)氨酸苷酶。17.權(quán)利要求ll的試劑盒，其中所述表面-結(jié)合生物分子探針為抗體，所述分析物為抗體的抗原，并且其中所述試劑盒包括當(dāng)所述分析物結(jié)合所述表面_結(jié)合生物分子探針時(shí)其能夠結(jié)合分析物的酶_標(biāo)記的抗體。18.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述試劑盒包括酶-標(biāo)記的生物分子或酶-標(biāo)記的分析物，并且其中所述酶標(biāo)記為堿性磷酸酶。19.一種用于檢測(cè)樣品中分析物的試劑盒，其包括權(quán)利要求9的制品，其中所述一種或多種表面_結(jié)合生物分子探針包括能夠結(jié)合分析物的探針，或者當(dāng)存在分析物時(shí)，結(jié)合分析物的探針；化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)，其中所述活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)能量受體染料引起從其中發(fā)射；和任選地，酶標(biāo)記的生物分子或酶標(biāo)記的分析物。20.權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述陰離子花青染料具有如下列出的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>21.—種用于檢測(cè)樣品中分析物的方法，其包括用權(quán)利要求1的制品接觸所述樣品，其中所述一種或多種生物分子探針包括結(jié)合分析物的探針；使樣品中的分析物結(jié)合表面結(jié)合探針；其中(a)所述分析物為酶；(b)用酶標(biāo)記所述分析物；(c)用酶標(biāo)記的生物分子接觸所述載體表面，所述生物分子結(jié)合所述分析物；或(d)所述分析物為未標(biāo)記，和將酶標(biāo)記的分析物加入到樣品中以使樣品中的酶-標(biāo)記的分析物與未標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述表面結(jié)合探針；用酶活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸所述載體表面，其中所述活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)能量受體染料，引起從其中發(fā)射；禾口檢測(cè)來(lái)自能量受體染料的發(fā)射。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述能量受體染料為J-聚集的染料。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述酶或酶標(biāo)記是水解酶。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述酶或酶標(biāo)記選自堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶和神經(jīng)氨酸苷酶。25.權(quán)利要求21的方法，其中所述酶或酶標(biāo)記是氧化酶。26.權(quán)利要求21的方法，其中所述表面-結(jié)合探針為抗體和所述分析物為抗體的抗原，或者所述表面結(jié)合探針為抗體的抗原和所述分析物為抗原的抗體。27.權(quán)利要求26的方法，其中在使樣品中的分析物結(jié)合載體結(jié)合探針之后，用酶標(biāo)記的生物分子接觸所述載體表面，其中當(dāng)所述分析物結(jié)合所述載體_結(jié)合探針時(shí)，所述酶標(biāo)記的生物分子為結(jié)合分析物的抗體。28.權(quán)利要求21的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)為二氧雜環(huán)丁烷、吖啶鎗酯、吖啶鎗磺酰亞胺、9，10-二氫化吖啶、9，10-二氫化吖啶烯醇磷酸酯、熒光素或魯米諾。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)為1，2-氧雜環(huán)丁烷。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)具有如下列出的結(jié)構(gòu)31.權(quán)利要求30的方法，其中所述酶或酶標(biāo)記是堿性磷酸酶。32.—種用于檢測(cè)樣品中分析物的方法，其包括用權(quán)利要求9的制品接觸樣品，其中所述一種或多種生物分子探針包括結(jié)合分析物的探針；使樣品中的分析物結(jié)合表面結(jié)合探針；其中(a)所述分析物為酶；(b)用酶標(biāo)記所述分析物；(c)用酶標(biāo)記的生物分子接觸所述載體表面，所述生物分子結(jié)合所述分析物；或(d)所述分析物為未標(biāo)記，和將酶標(biāo)記的分析物加入到樣品中以使樣品中的酶-標(biāo)記的分析物與未標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述表面結(jié)合探針；用酶活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸所述支持表面，其中所述活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)能量受體染料，引起從其中發(fā)射；禾口檢測(cè)來(lái)自能量受體染料的發(fā)射。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述酶或酶標(biāo)記是水解酶。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述酶或酶標(biāo)記選自堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶和神經(jīng)氨酸苷酶。35.權(quán)利要求32的方法，其中所述表面-結(jié)合探針為抗體和所述分析物為抗體的抗原，或者所述表面結(jié)合探針為抗體的抗原和所述分析物為抗原的抗體。36.權(quán)利要求35的方法，其中在使樣品中的分析物結(jié)合表面結(jié)合探針之后，用酶標(biāo)記的生物分子接觸所述載體表面，其中當(dāng)所述分析物結(jié)合所述載體_結(jié)合探針時(shí)，所述酶標(biāo)記的生物分子為結(jié)合分析物的抗體。37.權(quán)利要求32的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)為二氧雜環(huán)丁烷、吖啶鎗酯、吖啶鎗磺酰亞胺、9，10-二氫化吖啶、9，10-二氫化吖啶烯醇磷酸酯、熒光素或魯米諾。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)為1，2-二氧雜環(huán)丁烷。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)具有如下列出的結(jié)構(gòu)40.權(quán)利要求35的方法，其中所述酶或酶標(biāo)記是堿性磷酸酶。41.一種用于檢測(cè)樣品中分析物的試劑盒，其包括制品，其包括具有表面的載體，所述載體表面上的能量受體染料，和所述載體表面上的一種或多種生物分子探針，其中所述一種或多種生物分子探針能夠結(jié)合分析物，或者當(dāng)存在分析物時(shí)，其結(jié)合分析物；化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)；禾口任選地，酶標(biāo)記的生物分子或酶標(biāo)記的分析物。42.權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述能量受體染料為J-聚集的染料。43.權(quán)利要求41的試劑盒，其進(jìn)一步包括所述載體表面上的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)。44.權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)為二氧雜環(huán)丁烷、吖啶鎗酯、吖啶鎗磺酰亞胺、9，10-二氫化吖啶、9，10-二氫化吖啶烯醇磷酸酯、熒光素或魯米諾。45.權(quán)利要求44的試劑盒，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)為1，2-二氧雜環(huán)丁烷基質(zhì)。46.權(quán)利要求45的試劑盒，其中所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)具有如下列出的結(jié)構(gòu)47.權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述試劑盒包括酶標(biāo)記的生物分子或酶標(biāo)記的分析物。48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述酶標(biāo)記是水解酶。49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中所述酶標(biāo)記選自堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶和神經(jīng)氨酸苷酶。50.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述表面_結(jié)合探針為抗體和所述分析物為抗體的抗原，或者所述表面結(jié)合探針為抗體的抗原和所述分析物為抗原的抗體。51.權(quán)利要求46的試劑盒，其中所述試劑盒包括當(dāng)分析物結(jié)合所述載體表面上的探針時(shí)其結(jié)合所述分析物的酶標(biāo)記的生物分子，或者與樣品中未標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述載體結(jié)合探針的酶標(biāo)記的分析物，并且其中所述酶標(biāo)記為堿性磷酸酶標(biāo)記。52.—種用于檢測(cè)樣品中多種分析物的方法，其包括用第一制品接觸樣品，所述制品包括具有表面的載體；所述載體表面上的第一化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第一能量受體染料；和所述載體表面上的第一生物分子探針，其中所述第一生物分子探針能夠結(jié)合第一分析物；用第二制品接觸樣品，所述制品包括具有表面的載體；所述載體表面上的第二化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第二能量受體染料；和所述載體表面上的第二生物分子探針，其中所述第二生物分子探針能夠結(jié)合第二分析物；使樣品中的第一分析物結(jié)合第一探針，其中(a)第一分析物為第一酶，(b)用第一酶標(biāo)記第一分析物，(c)用第一酶標(biāo)記的和結(jié)合所述載體表面上的第一分析物的生物分子接觸第一制品的載體表面；或(d)第一分析物為未標(biāo)記，和將第一酶標(biāo)記的第一分析物加入到樣品中以使樣品中的酶-標(biāo)記的第一分析物與未標(biāo)記的第一分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合第一制品的第一生物分子探針；使樣品中的第二分析物結(jié)合第二探針，其中(a)第二分析物為第二酶，(b)用第二酶標(biāo)記第二分析物，(c)用第二酶標(biāo)記的和結(jié)合載體表面上的第二分析物的生物分子接觸第二制品的第二載體表面；或(d)第二分析物為未標(biāo)記，和將第二酶標(biāo)記的第二分析物加入到樣品中以使樣品中的酶_標(biāo)記的第二分析物與未標(biāo)記的第二分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合第二制品的第二生物分子探針；用第一酶活化的第一化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸第一制品，其中所述活化的第一化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第一能量受體染料，引起從其中發(fā)射，和用第二酶活化的第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸第二制品，其中所述活化的第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第二能量受體染料，引起從發(fā)射；和檢測(cè)來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射和檢測(cè)來(lái)自第二能量受體染料的發(fā)射，其中來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射與來(lái)自第二能量受體染料的發(fā)射是可區(qū)別的。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述第一和第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)相同或不同。54.權(quán)利要求52的方法，其中所述第一和第二化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)相同或不同。55.權(quán)利要求52的方法，其中同時(shí)或順次用樣品接觸所述第一和第二制品。56.權(quán)利要求52的方法，其中同時(shí)或順次用第一和第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)接觸所述第一禾P第一制品。57.權(quán)利要求52的方法，其中同時(shí)或順次檢測(cè)來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射和檢測(cè)來(lái)自第二能量受體染料的發(fā)射。58.—種用于檢測(cè)樣品中多種分析物的試劑盒，其包括第一制品，其包括具有表面的第一載體；所述載體表面上的第一化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第一能量受體染料；和所述載體表面上的第一生物分子探針，其中所述第一生物分子探針包括能夠結(jié)合第一分析物的第一探針，或者當(dāng)存在第一分析物時(shí)，其結(jié)合第一分析物的第一探針；第二制品，其包括具有表面的載體；所述載體表面上的第二化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)；所述載體表面上的第二能量受體染料；和所述載體表面上的第二生物分子探針，其中所述第二生物分子探針包括能夠結(jié)合第二分析物的第一探針，或者當(dāng)存在第二分析物時(shí)，其結(jié)合第二分析物的第一探針；第一化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)，其中所述活化的第一化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第一能量受體染料，引起從其中發(fā)射；第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)，其中所述活化的第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)第二能量受體染料，引起從其中發(fā)射，其中來(lái)自第一能量受體染料的發(fā)射與來(lái)自第二能量受體染料的發(fā)射是可區(qū)別的；任選地，第一酶_標(biāo)記的生物分子或被第一酶標(biāo)記的第一分析物；任選地，第二酶_標(biāo)記的生物分子或被第二酶標(biāo)記的第二分析物。59.權(quán)利要求58的試劑盒，其中所述第一和第二化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)相同或不同。60.權(quán)利要求58的試劑盒，其中所述第一和第二化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)物質(zhì)相同或不同。61.權(quán)利要求1的制品，其中所述能量受體染料為熒光染料。62.權(quán)利要求l的制品，其中所述能量受體染料為選自下述的芳族化合物萘類、蒽類、芘類、聯(lián)苯類、吖啶、香豆素類、咕噸類、酞菁類、l，2-二苯乙烯類、呋喃類、噁唑類、噁二唑類和苯并噻唑類。63.權(quán)利要求1的制品，其進(jìn)一步包括所述載體表面上的分子過(guò)濾器，其中所述分子過(guò)濾器屏蔽或淬滅了干擾檢測(cè)來(lái)自能量受體染料的發(fā)光發(fā)射的光發(fā)射。64.權(quán)利要求63的制品，其中所述分子過(guò)濾器為血紅蛋白或淬滅染料。65.權(quán)利要求11的試劑盒，其進(jìn)一步包括分子過(guò)濾器，其中所述分子過(guò)濾器屏蔽或淬滅了干擾檢測(cè)來(lái)自能量受體染料的發(fā)光發(fā)射的光發(fā)射。66.權(quán)利要求65的試劑盒，其中當(dāng)活化時(shí)，所述化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)激發(fā)所述能量受體染料，引起從其中發(fā)光發(fā)射，并且其中所述分子過(guò)濾器屏蔽或淬滅了干擾檢測(cè)來(lái)自能量受體染料的發(fā)光發(fā)射的發(fā)光發(fā)射。67.權(quán)利要求21的方法，其中在檢測(cè)來(lái)自所述能量受體染料的發(fā)射時(shí)，分子過(guò)濾器在所述載體表面上，其中所述分子過(guò)濾器屏蔽或淬滅了干擾檢測(cè)來(lái)自能量受體染料的發(fā)光發(fā)射的光發(fā)射。全文摘要本發(fā)明描述了通過(guò)從活化的化學(xué)發(fā)光的基質(zhì)將能量轉(zhuǎn)移至能量受體染料比如J-聚集的染料來(lái)檢測(cè)生物分子的試劑、試劑盒和方法。文檔編號(hào)G01N33/543GK101784897SQ200880019672公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2008年5月23日優(yōu)先權(quán)日2007年5月23日發(fā)明者B·愛德華茲,J·C·沃伊塔,R-R·卓申請(qǐng)人:應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司