專利名稱：：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異性自身抗體的抗原決定簇及其用途的制作方法類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異性自身抗體的抗原決定簇及其用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及來源于自身抗原的抗原決定簇的成分和序列及其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的診斷、預(yù)防和治療中的應(yīng)用，所述自身抗原由患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的自身抗體識另'J。
背景技術(shù)：
：RA是病因不明的慢性炎癥性自身免疫疾病。盡管已有幾種治療RA的治療方法，但是目前沒有治愈的病例。RA影響全世界約1%的人群，影響2°/。的年齡為65歲或更老的成人。RA可以發(fā)生在任何年齡，并且在女性中的流行比在男性中更常見，女性比男性約高3倍。RA是表現(xiàn)出長期預(yù)后不良的疾病。統(tǒng)計數(shù)字表明，80%的患者20年后身體是殘疾的，并且預(yù)期壽命平均減少了3至18年。RA是殘疚、發(fā)病和死亡的主要原因。RA的特征為，致軟骨和骨的累進(jìn)性缺損的滑膜關(guān)節(jié)的對稱性炎癥。該過程通過沿著所謂的血管翳攻擊軟骨并通過募集破骨細(xì)胞侵蝕下面的骨。另外還侵襲腱和其它身體部分。由于受損的關(guān)節(jié)通常是不可修復(fù)的，這經(jīng)常導(dǎo)致永久性失能(incapacitation)。對于大部分未治療的RA患者，在2年內(nèi)發(fā)生不可逆的關(guān)節(jié)損傷。就個人、社會和經(jīng)濟(jì)成本而言，RA的影響巨大。最近的研究表明每一患者的平均年醫(yī)療費用在美國為S6300USD，在加拿大為$6800CND，在德國為€4700以及在英國為￡2700。目前RA護(hù)理的全年總費用在加拿大為約20億美元，在美國約為180億美元；該數(shù)字預(yù)期在老年群體中明顯增加。亟需開發(fā)特異性治療RA并具有最少的不良事件和成本的藥物的新思路。對于RA發(fā)病機(jī)理，傳統(tǒng)模式(paradigm)認(rèn)為CD4+T細(xì)胞既直接地又通過驅(qū)動非T效應(yīng)器細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)關(guān)節(jié)損傷。緩解疾病的抗風(fēng)濕藥物(DMARD)是治療RA的主要藥物，然而，它們面臨療效有限、毒性問題或這兩者。諸如TNFa拮抗劑的基于生物制嚴(yán)重的風(fēng)險。這樣治療的RA患者僅有約60-70%表現(xiàn)出ACR20應(yīng)答(定義為RA患者對藥物應(yīng)答時所實現(xiàn)的最低限度的可接受應(yīng)答)。生物制劑的成本是DMARD成本的約2至7倍，然而，這些治療都不能有效地阻斷疾病進(jìn)展。作為治療的"金標(biāo)準(zhǔn)"，金類藥物用于治療RA以延緩并有時緩解該疾病已經(jīng)超過78年。金抗關(guān)節(jié)炎活性的機(jī)制基于T細(xì)胞和半胱氨酸(Cys)蛋白酶尤其是組織蛋白酶的活性位點的靶向失活，其通過在金與受影響的抗原肽和組織蛋白酶的Cys巰基之間形成螯合物實現(xiàn)。在RA的滑膜和滑液中都檢測到了直接促進(jìn)炎癥以及軟骨和骨的降解的高表達(dá)的組織蛋白酶。組織蛋白酶的活性與諸如白細(xì)胞介素-1]3(IL-l/3)和TNFa的炎癥細(xì)胞因子的濃度顯著相關(guān)。組織蛋白酶抑制劑的早期臨床數(shù)據(jù)顯示其對RA護(hù)理可能是有效的。通過修飾巰基部分選擇性抑制組織蛋白酶有可能導(dǎo)致開發(fā)治療RA的新化學(xué)療法。通過諸如Apotex、AstraZeneca、Aventis、Bayer、BochringesIngelheim、CeleraGenomics、GlaxoSmithKline、Merck和Novartis的制藥公司的巨大關(guān)注，已經(jīng)推進(jìn)了組織蛋白酶抑制劑設(shè)計和合成的進(jìn)程。RA發(fā)病機(jī)理的新才莫式集中在B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞之間的相互作用?；诳笴D20利妥昔單抗(rituximab)的B-淋巴細(xì)胞消減(BLyD)治療具有對RA患者的治療潛力。BlyD使得B細(xì)胞在幾天內(nèi)消失，但是臨床改善和自身抗體下降可以持續(xù)長達(dá)9個月。根據(jù)病例報告、開放式初步研究以及隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照試驗中的報道，依照ACR50-70標(biāo)準(zhǔn)(定義為RA患者對藥物應(yīng)答時所實現(xiàn)的良好和極佳的應(yīng)答)，觀察到了長達(dá)1年的具有顯著改善的持續(xù)臨床應(yīng)答。與DMARD曱氨喋呤或環(huán)磷酰胺聯(lián)用的Blyd看起來是頑固性RA的合理治療選擇。這些陽性應(yīng)答與C反應(yīng)蛋白及包括所有類型的類風(fēng)濕因子(RF)和第二代抗環(huán)瓜氨酸肽(抗CCP2)在內(nèi)的自身抗體水平的大幅度減少有關(guān)。來自RA患者的記憶B細(xì)胞比來自正常對照的記憶細(xì)胞對利妥昔單抗更敏感。從RA患者中觀察到了可能促進(jìn)自身免疫發(fā)展的缺陷的B細(xì)胞耐受核查點。RA的臨床病變可能是抗體介導(dǎo)的，并且BlyD阻止從B纟田月包的補(bǔ)充。RA病理學(xué)中的B細(xì)胞定型的定性或定量差別可能在觀察到的不同應(yīng)答中起作用。BlyD的效應(yīng)有助于增加對下述觀點的支持RA中的炎癥效應(yīng)器機(jī)制和基本的免疫調(diào)節(jié)失調(diào)都由自身抗體而不是T細(xì)胞驅(qū)動。這種認(rèn)識代表了理解RA的發(fā)病機(jī)理的明顯進(jìn)步。稀少的致病B細(xì)胞亞型的產(chǎn)生可能是RA發(fā)病機(jī)理的限速步驟。盡管BlyD顯示出良好的前景并且揭示了疾病的機(jī)制，但仍缺少常規(guī)4吏用的長期策略。因為BlyD治療可以誘發(fā)低丙種球蛋白血癥和嚴(yán)重的感染，所以即便在具有持續(xù)益處的情況下，利用經(jīng)常重復(fù)的BlyD維持長期消減不大可能是可行的選擇。鑒定驅(qū)動RA的發(fā)病機(jī)制的相關(guān)抗原對于形成基于抗原的免疫-介入(immunointervention)，例如耐受化疫苗(tolerizingvaccine)是很關(guān)鍵的。優(yōu)選通過抗體誘導(dǎo)自身免疫B細(xì)胞的死亡，并且完全確定施用所述抗體不會誘導(dǎo)或召回(recall)致病應(yīng)答。特異性阻止疾病中的自身反應(yīng)B細(xì)胞存活的小分子應(yīng)該提供有效和低成本的RA治療。作為巰基阻斷劑的硫代蘋果酸金鹽(goldthiomalate)是用于RA的理想藥物，因為它能誘導(dǎo)完全和永久的緩解，但問題是它很少實現(xiàn)這一效果并且更經(jīng)常產(chǎn)生毒性有理由認(rèn)為，如果我們了解如同金類的藥物是如何真正地發(fā)揮作用的，應(yīng)該不可能將其毒性與療效分開。希望靶向致病B細(xì)胞克隆的策略的進(jìn)一步開發(fā)將這種情況擴(kuò)展至RA真正的長期緩解的最初目標(biāo)是合理的。已經(jīng)提出在疾病癥狀出現(xiàn)的前3個月內(nèi)存在"治療時機(jī)窗"。適時地介入對于預(yù)防不可逆的關(guān)節(jié)損傷是關(guān)鍵的，并且在RA的最早期的積極治療能明顯地改善其醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)結(jié)果。利用患有確定的RA(平均疾病持續(xù)時間接近8年)的患者建立了美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)的1987年RA分類標(biāo)準(zhǔn)，其靈敏度為91%，特異性為89%。在臨床實踐中通常通過存在7個標(biāo)準(zhǔn)中的至少4個來確定RA,其中臨床標(biāo)準(zhǔn)1至4必須存在超過6周。這些ACR標(biāo)準(zhǔn)在早期RA中通常不明顯。RF是僅有的包括于ACR標(biāo)準(zhǔn)的血清標(biāo)志物。RF可以在50-80%的RA血清中檢測到，但是它經(jīng)常存在于健康個體(特別是老年個體)和患有感染和其它自身免疫疾病的患者中。利用RF測試診斷RA不是最理想的。風(fēng)濕病學(xué)家利用ACR標(biāo)準(zhǔn)來確定RA已經(jīng)數(shù)十年了，但是由于ACR標(biāo)準(zhǔn)在早期RA中的有限效果，其仍然是不適當(dāng)?shù)?。亟需新?biāo)準(zhǔn)^v對確定的RA進(jìn)行分類轉(zhuǎn)變到對預(yù)計變成持久性和侵蝕性疾病的早期RA進(jìn)行分類。新標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)包括在早期階段高度特異和靈敏地4企測RA的可靠血清標(biāo)志物。新測量將明確診斷早期RA，并能增強(qiáng)對疾病結(jié)果的預(yù)后。最近發(fā)現(xiàn)結(jié)合瓜氨酸化蛋白/肽(CP)的自身抗體為RA的高特異性診斷標(biāo)志物，這使RA患者的早期血清診斷評價發(fā)生了變革，并且代表了實現(xiàn)該目標(biāo)的第一個可商購的檢測。涉及瓜氨酸化的自身蛋白翻譯后修飾被認(rèn)為是生成對產(chǎn)生的RA特異性抗體進(jìn)行應(yīng)答的新表位的關(guān)鍵步驟。內(nèi)源肽基精氨酸脫亞胺酶(PAD)酶催化肽基精氨酸轉(zhuǎn)變成肽基瓜氨酸。非編碼氨基酸瓜氨酸(Cit)被認(rèn)為是蛋白質(zhì)通過脫亞胺獲得抗原性的新表位。隨著對蛋白質(zhì)瓜氨酸化的免疫學(xué)發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)報道PADI4與RA之間的遺傳關(guān)系在日本和韓國人群中有聯(lián)系。但是，該聯(lián)系在白種人、西班牙和英國人群中沒有再現(xiàn)u在白種法國人群中的基于家族的研究也沒有表現(xiàn)出PADI4與RA之間的聯(lián)系。沒有發(fā)現(xiàn)PADT4基因與嚴(yán)重度之間的聯(lián)系的證據(jù)，所述嚴(yán)重度是通過侵蝕性結(jié)果或炎性多關(guān)節(jié)炎患者中存在抗瓜氨酸化抗原的抗體來評估的。CP的抗體在發(fā)炎的滑膜局部產(chǎn)生，PADI2和PADI4也位于滑膜組織內(nèi)。這些發(fā)現(xiàn)表明關(guān)節(jié)內(nèi)和關(guān)節(jié)外蛋白質(zhì)的局部瓜氨酸化可能是導(dǎo)致RA中產(chǎn)生自身抗體的初始事件。源自下述的CP被認(rèn)為是候選自身抗原滑膜組織或關(guān)節(jié)中的a-烯醇化酶(o!-erolase)、纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白和波形蛋白，上皮組織中的角蛋白、核周因子和絲聚蛋白，軟骨特異性胞外基質(zhì)中的I型和II型膠原蛋白(CI、CII)以及EBV感染的B淋巴細(xì)胞和口咽部上皮細(xì)胞的病毒肽。除了這些，瓜氨酸化的無孢蛋白、組織蛋白酶D、)S-肌動蛋白、CapZa-l、白蛋白、真核翻譯起始因子4、組胺受體、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)ER60前10體、線粒體乙醛脫氫酶(ALDH2)以及Spa(CD5抗原類蛋白)受體一皮鑒定為RA中候選瓜氨酸化自身抗原。RA患者可視化的990種滑膜蛋白中，用蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定的51種(5.2%)是瓜氨酸化的。990個蛋白點中的94個(9.5%)與RA血清反應(yīng)。有趣地是，這94個RA血清反應(yīng)點中的30個(31.9%)是CP，并且上述51個CP中的30個(58.8%)是RA血清反應(yīng)的。但是，研究者到目前為止未能證明CP作為驅(qū)動抗原誘導(dǎo)試驗小鼠關(guān)節(jié)炎模型的致關(guān)節(jié)炎性(arthritogenicity)和自身免疫性。在存在佐劑的條件下，用CP免疫小鼠時，觀察到升高的免疫原性和致關(guān)節(jié)炎性，并且研究的小鼠中沒有一個發(fā)展為關(guān)節(jié)炎。然而，在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中，線性瓜氨酸化肽(LCP)耐受小鼠顯示了與對照相比明顯降低的疾病嚴(yán)重性和發(fā)病率。從RA患者和對照患者的滑膜組織的任何滑膜炎中都觀察到了瓜氨酸化的纖維蛋白。HL-60粒細(xì)胞中有組蛋白和核仁磷酸蛋白(nucleophosmin)/B23的瓜氨酸化，并且表皮和血漿中有角蛋白和抗凝血酶的瓜氨酸化。在患有RA相關(guān)的IP的患者、患有IP的患者和對照患者的肺樣本中檢測到了瓜氨酸化。在患有阿爾茨海默氏病(Alzheimersdisease)患者的海馬提取物中檢測到了異常的聚集的CP。在試驗型自身免疫腦脊髓炎的發(fā)展期間觀察到了髓鞘堿性蛋白的瓜氨酸化。瓜氨酸化的腦蛋白與腦多發(fā)性硬化的病理生理學(xué)有關(guān)。在波曼氏嚢(Browmanscapsule)和梗阻性腎病中也發(fā)現(xiàn)了CP。因此，瓜氨酸化是自身蛋白翻譯后修飾的普遍現(xiàn)象。瓜氨酸化對于誘導(dǎo)產(chǎn)生RA特異性抗體的自身免疫應(yīng)答是關(guān)鍵的但不是必需的。瓜氨酸化不能誘導(dǎo)產(chǎn)生RA無關(guān)抗體的自身免疫應(yīng)答。對瓜氨酸化在自身抗原的免疫原性中的特征了解甚少。涉及誘導(dǎo)RA特異性抗體的含有Cit的自身抗原的來源仍然是不清楚的?；谟糜跈z測RA特異性抗體的捕獲抗原，已將RA特異性抗體分為抗CP(抗來自a-烯醇化酶、CI、CII、纖維蛋白、絲聚蛋白、角蛋白、核周因子或波形蛋白的CP的抗體)、抗LCP(抗來自絲聚蛋白原、絲聚蛋白、CI、CII或EBV核抗原的LCP的抗體)、抗CCP1(抗來自絲聚蛋白的單一CCP的抗體)以及抗CCP2(抗來自肽庫的與已知蛋白質(zhì)非同源的人工CCP的抗體)?？笴P測試顯示了低靈敏度(46%)下的高特異性(約100%)(n=894i)(Palosuo等人，1998;Hayem等人，1999;Vmcent等人，1999;Forslin等人，2000;Goldbach-Mansky等人，2000;Menard等人，2000;Nogueira等人，2001;Bas等人，2002;Vincent等人，2002;Meyer等人，2003;Saraux等人，2003;Suzuki等人，2003;Suzuki等人，2003;Vencovsky等人，2003;Dubucquoi等人，2004;Grootenboer-Mignot等人，2004;Vittecoq等人，2004;Auger等人，2005;Boire等人，2005;Greiner等人，2005;Kinloch等人，2005;Nielen等人，2005;Suzuki等人，2005;Chen等人，2006;Dejaco等人，2006;Hill等人，2006;Lopez-Longo等人，2006;Matsuo等人，2006;Rodriguez-Mahou等人，2006;Tian等人，2006;VanderCmyssen等人，2006;Yoshida等人，2006;Agrawal等人，2007;Coenen等人，2007)。當(dāng)使用天然來源或化學(xué)合成的LCP作為捕獲抗原時，才企測到了類似的特異性(約100%)和靈敏度(48%)(n=3668)(Schellekens等人，1998;Girbal-Neuhauser等人，1999;Schellekens等人，2000;Union等人，2002;DeRycke等人，2004;Dubucquoi等人，2004;Hoffman等人，2004;Low等人，2004;Burhardt等人，2005;Koivula等人，2005;Merlini等人，2005;Anzilotti等人，2006;Koivula等人，2006;Pratesi等人，2006;VanderCmyssen等人，2006;VanderCmyssen等人，2007)。與其LCP對應(yīng)物相比，利用CCP明顯地增加靈壽1度而不犧牲特異性，抗CCP1在特異性約為100%時，靈敏度為53%(n=2948)(Goldbach-Mansky等人，2000;Kroot等人，2000;Schellekens等人，2000;Bizzaro等人，2001;Bas等人，2002;Jansen等人，2002;Vincent等人，2002;Bas等人，2003;Jansen等人，2003;Meyer等人，2003;Saroux等人，2003;Vencovsky等人，2003;Zeng等人，2003;Feng等人，2004;窗Gaalen等人，2005;VanderCruyssen等人，2006)，并且抗CCP2在特異性約為100%時，靈敏度為66%(n=19385)(Lee等人，2003;Pinheiro等人，2003;Suzuki等人，2003;Alessandri等人，2004;Berglin等人，2004;Bobbio-Pallavicini等人，2004;Bombardien等人，2004;Bongi等人，2004;Correa等人，2004;DeRycke等人，2004;Dubucquoi等人，2004;Forslind等人，2004;Girelli等人，2004;Grootenboer-Mignot等人，2004;Hitchon等人，2004;Kasapcopur等人，2004;Kastbom等人，2004;Lopez-Hoyos等人，2004;Low等人，2004;Mikuls等人，2004;Soderlm等人，2004;Solanki等人，2004;Vallbracht等人，2004;vanGaalen等人，2004;Vittecoq等人，2004;Aotsuka等人，2005;Boire等人，2005;Burkhardt等人，2005;Caramaschi等人，2005;Choi等人，2005;Dubrous等人，2005;Fernandez-Suarez等人，2005;Gao等人，2005;Garcia-Berrocal等人，2005;Greiner等人，2005;Hiura等人，2005;Huizinga等人，2005;Irigoyen等人，2005;Kamali等人，2005;Koivula等人，2005;Kwok等人，2005;Limaye等人，2005;Lindqvist等人，2005;Mu等人，2005;Nakamura等人，2005;Nell等人，2005;Nielen等人，2005;Quinn等人，2005;Raza等人，2005;Ro畫lid等人，2005;Samanci等人，2005;Sauerland等人，2005;Shovman等人，2005;Sih雨en等人，2005;Spadaro等人，2005;Tampoia等人，2005;Tobon等人，2005;vanderHelm-vanMil等人，2005;vanGaalen等人，2005;Verpoort等人，2005;Alenius等人，2006;Ates等人，2006;Atzeni等人，2006;B固cci等人，2006;Berglin等人，2006;Braun陽Moscovici等人，2006;Caspi等人，2006;Ceccato等人，2006;Chen等人，2006;Dejaco等人，2006;delValdelAmo等人，2006;Hill等人，2006;Inane等人，2006;Johansson等人，2006;Koivula等人，2006;Korkmaz等人，2006;Linn-Rasker等人，2006;Lopez-Longo等人，2006;Matsui等人，2006;Mewar等人，2006;Meyer等人，2006;Mikuls等人，2006;Panchagnula等人，2006;Pedersen等人，2006;Pierer等人，2006;Redaitene等人，2006;Rodriguez陽Mahou等人，2006;Russell等人，2006;Shankar等人，2006;Spadaro等人，2006;Tamai等人，2006;vanderCruyssen等人,2006;vanderHelm-vanMil等人,2006;Agrawal等人，2007;Coenen等人，2007;Forslind等人，2007;Inane等人，2007;Kaltenhauser等人，2007;Kudo-Tanaka等人，2007;Ligeiro等人，2007;Rantapaa-Dahlqvist等人，2007;Turesson等人，2007;vanderHelm-vanMil等人，2007)。RA患者可以具有抗CP陽性或抗CP陰性、抗LCP陽性或抗LCP陰性、抗CCP1陽性或抗CCP1陰性以及抗CCP2陽性或抗CCP2陰性的表型。在具有至少一種抗瓜氨酸化抗原的RA患者中，78%的患者具有抗CP和抗CCP2的抗體，30%的患者具有抗LCP和抗CCP2的抗體，73%的患者具有抗CCP1和抗CCP2的抗體；并且12-32%的患者只有抗LCP的抗體，3%的患者只有抗LCP的抗體，4-19%的患者只有抗CCP1的抗體，21-29%的患者只有抗CCP2的抗體?；加蠷A的患者含有三種抗CP,即AFA、AKA和APA中的至少一種，59%的患者共同地含有所有三種抗體，25%的患者同時含有兩種抗體，18%的患者只有一種抗體。在RA患者中，約5%的抗CCP2狀態(tài)在3年的抗風(fēng)濕治療中發(fā)生了變化2%從陰性變成陽性，3%從陽性變成陰性。RA群體中瓜氨酸化CapZa-l的抗體的頻數(shù)為53.3%,在抗原沒有瓜氨酸化的RA群體中，抗體頻lt為36.7%。130個RA患者的血清樣品的78.5%中檢測到瓜氨酸化CII的抗體。14.6%的血清樣品中檢測到天然未瓜氨酸化CII的抗體，所有這些樣品都是抗瓜氨酸化CII陽性的。RA患者的抗瓜氨酸化纖維蛋白原的抗體的IgG亞類譜是對IgGl為61%,對IgGl+IgG2、IgGl+IgG3或IgGl+IgG4為34.8%，并且對IgGl+IgG2+IgG3、IgGl+IgG2+IgG4或IgGl+IgG3+IgG4為4.2%。盡管瓜氨酸化抗原的抗體更特異性地與RA相關(guān)，但它們在對不同的含Cit抗原的反應(yīng)模式中，確實具有明顯的變異性?？构习彼峄乖目贵w不等同于RA患者的診斷標(biāo)志物。14年就能夠明確地診斷RA。這些抗體看起來在健康個體和患有未分化的關(guān)節(jié)炎的患者中對RA的未來發(fā)展都有高度預(yù)測性。瓜氨酸化抗原的抗體的活性與促炎細(xì)胞因子的上調(diào)有關(guān)。具有或不具有這些抗體的RA患者的表型在疾病活動的血清學(xué)參lt(CRP、ESR和WBC)和臨床表現(xiàn)方面是類似的，但是在疾病進(jìn)程方面是不同的。具有這些抗體中的至少一種的患者對持續(xù)性RA的發(fā)展、加重的臨床疾病、更腫脹的關(guān)節(jié)、高ii射級凄t(greatradiologicalprogression)和關(guān)節(jié)石皮壞、嚴(yán)重骨損傷、死亡風(fēng)險具有高預(yù)測值，并且要求更有效的抗風(fēng)濕治療?？?4CCP2測試比抗LCP和抗CCP1測試鑒定更多的關(guān)節(jié)損傷進(jìn)展患者?？笴P,而不是抗CCP2最好地預(yù)測了患有初發(fā)或早期多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的患者的嚴(yán)重性?？构习彼峄乖贵w不等同于RA患者的預(yù)后標(biāo)志物。許多研究已經(jīng)檢測了積極的RA治療對瓜氨酸化抗原的抗體的血清水平的影響。發(fā)現(xiàn)抗體的量是穩(wěn)定的表型，其在診斷后、DMARD、生物制劑或生物制劑結(jié)合DMARD的治療開始后以及臨床和緩解進(jìn)程后保持基本不變。RF，而不是抗體，與臨床療效有關(guān)，這表明在RA中有兩套獨立的自身抗體系統(tǒng)。這些結(jié)果與發(fā)現(xiàn)積極治療引起反映抗CCP2的水平明顯降低的臨床改善的結(jié)果形成對照，所述積極治療是通過包括英夫利昔單抗(infliximab)、阿達(dá)木單抗(adalimumab)和依那西普(etanercept)在內(nèi)的生物TNFo;阻斷劑或通過這些阻斷劑聯(lián)合DMARD甲氨喋呤進(jìn)行的。BlyD治療在應(yīng)答患者中引起臨床應(yīng)答，并且與抗CCP2水平的明顯下降有關(guān)。無應(yīng)答患者沒有表現(xiàn)出抗CCP2水平的任何明顯變化。瓜氨酸化抗原的抗體一皮認(rèn)為在RA發(fā)病機(jī)理中起重要作用。DRB1SE等位基因被認(rèn)為與CCP2的抗體有關(guān)，并且在RA中預(yù)測嚴(yán)重度。瓜氨酸化肽的特征是與HLA-DRB1等位基因具有高親和力肽相互作用?？笴CP2陽性RA僅與HLA-DRB1有關(guān)，并且抗CCP2陰性RA僅與HLA-DR3有關(guān)?？笴CP抗體的高效價與HLA-DRB104/10的存在顯著有關(guān)。然而，來自大量天然和瓜氨酸化形式的纖維蛋白原肽的數(shù)據(jù)表明瓜氨酸化不是肽與HLA-DR相關(guān)的等位基因結(jié)合的先決條件，并且瓜氨酸化纖維蛋白原肽并沒有比其天然形式更有效地刺激T細(xì)胞增殖。HLA-DRB1等位基因最有可能與抗CP的產(chǎn)生有關(guān)，因為這些等位基因混雜地結(jié)合纖維蛋白原肽。來自SE陰性RA患者的血清中有55%對抗瓜氨酸化纖維蛋白原是陽性的。HLA-DRB1的表達(dá)不是RA患者產(chǎn)生瓜氨酸化纖維蛋白原的抗體所必需的。如果自身蛋白的瓜氨酸化是破壞免疫耐受的關(guān)鍵步驟，CP上產(chǎn)生的新表位應(yīng)當(dāng)比LCP、CCP1和CCP2模擬的表位令人信服地更為天然和有決定性。然而，不是所有含有Arg殘基的蛋白質(zhì)在體外有效地被瓜氨酸化后都能與抗CP反應(yīng)。在71個15-聚體(mer)瓜氨酸化纖維蛋白衍生肽中，只有19個#皮抗CP特異地識別。免疫反應(yīng)性CP中沒有一個具有被抗CP、抗LCP、抗CCP1和抗CCP2靶向的所有表位。用抗CP檢測RA的靈敏度明顯地低于用抗LCP、抗CCP1和抗CCP2檢測的靈敏度(46%比48%、53%和66%)，4旦是它們都是極其特異的(約100%),這表明，抗原中存在的瓜氨酸化部分是關(guān)鍵的但不是足夠的?？笴CP2陽性患者具有瓜氨酸化表位，其特征為預(yù)示發(fā)生了嚴(yán)重RA，相比之下，抗CCP2陰性患者具有天然表位，其特征為預(yù)示較不嚴(yán)重的RA。AFA與作為抗原的未瓜氨酸化的絲聚蛋白反應(yīng)，并且其效價與RA患者的臨床參數(shù)有關(guān)。這些研究表明并非所有的CP/LCP/CCP1/CCP2或未瓜氨酸化的蛋白/肽同等地與瓜氨酸化抗原的抗體反應(yīng)。RA特異性抗體是抗半抗原抗體，并且半抗原由線性而不是構(gòu)象基礎(chǔ)上的Cit和非Cit殘基組成。Cit與非Cit殘基之間的相互關(guān)系以及周圍的其它AA殘基可以決定抗原上的Cit殘基、非Cit殘基或Cit和非Cit殘基這兩者的可纟見性，這導(dǎo)致了RA患者的可變的抗瓜氨酸化抗原陽性或抗瓜氨酸化抗原陰性表型。有限質(zhì)量的化學(xué)成分(通常MW小于IOOO)被定義為半抗原，當(dāng)其被導(dǎo)入宿主動物時，不引發(fā)抗體的形成。但是，當(dāng)其與高分子量載體共價偶聯(lián)時，生成的半抗原-載體共軛物(conjugate)能在宿主動物中引發(fā)識別該半抗原的抗體的形成。翻譯后修飾能通過增加自身表位使蛋白質(zhì)獲得自身免疫性，并引發(fā)抗生成的新表位的抗體。如果自身表位是像Cit殘基(MW157.20)—樣小的半抗原，其不大可能完全地占據(jù)抗體的全部抗原結(jié)合位點。除了半抗原，蛋白質(zhì)用于連接半抗原的橋接基(bridgegroup)可以成為額外的抗原性部分以形成新表位并且結(jié)合抗體。如果該新表位被錯誤的橋接基污染(contaminate),該干擾能導(dǎo)致低估或高估抗體。橋接基識別是抗半抗原抗體的一般屬性，其對利用半抗原-載體作為抗原的檢測的靈敏度和特異性具有很大的影響。編碼被RA特異性抗體識別的線性表位將決定Cit、非CitAA、Cit殘基、非CitAA殘基、橋接基或其某些組合是否有助于表位的整體結(jié)合需求。在RA的診斷和治療中仍然存在很大的挑戰(zhàn)。關(guān)鍵問題包括1)CP缺乏對免疫系統(tǒng)的免疫原性。CP的抗體在RA患者中具有顯著的接近100%的特異性并且不到1%的群體產(chǎn)生了CP的抗體，與CP的抗體相反，CP的存在對RA不是特異性的，而是所有人出現(xiàn)炎癥的結(jié)果。針對CP的免疫并不在實驗動物模型中導(dǎo)致RA。這表明存在涉及自身免疫的引發(fā)或持續(xù)的包括瓜氨酸化的過程，還是僅僅反映了尚未被發(fā)現(xiàn)的發(fā)生的炎癥？這意味著存在未被發(fā)現(xiàn)的含有Cit的自身抗原嗎？2)瓜氨酸化抗原與已有的抗體的抗原性的不足。在46-66。/。的RA患者中檢測到抗體對瓜氨酸化抗原的敏感性。這意味著相當(dāng)一部分RA患者不產(chǎn)生抗瓜氨酸化抗原的抗體，還是由于不完全的抗原性，現(xiàn)有的捕獲抗原不能識別它們？3)瓜氨酸化抗原的抗體的診斷準(zhǔn)確度不足。針對瓜氨酸化抗原的RA特異性抗體對是高度特異的，但不夠靈敏。這表明Cit殘基是負(fù)責(zé)才全測瓜氨酸化抗原陽性RA的抗體的表位決定性組分嗎？如果是這樣，那負(fù)責(zé)檢測瓜氨酸化抗原陰性RA的抗體的表位決定性組分是什么？4)考慮到一部分RA患者不含有抗瓜氨酸化抗原的抗體，這表明抗體的存在對于RA的發(fā)生不是必需的，還是抗瓜氨酸化抗原陽性RA和抗瓜氨酸化抗原陰性RA的基本發(fā)病機(jī)理是不同的？5)考慮到CCP2是中度靈敏的并且檢測與CCP1、LCP和CP不同的亞型抗體，這表明橋接基識別的存在能導(dǎo)致瓜氨酸化抗原對于已有特異性抗體"可見"或"不可見"嗎？這意味著至少部分的抗瓜氨酸化抗原陽性是不明確的抗瓜氨酸化抗原陰性，并且抗瓜氨酸化抗原陽性和陰性不屬于兩個獨立的形成過程嗎？6)負(fù)責(zé)產(chǎn)生針對瓜氨酸化抗原免疫應(yīng)答的抗原是什么？對RA特異性抗體靶向的表位進(jìn)行作圖是重要的并且能夠闡明相應(yīng)的抗原疑或7)特異性抗體的產(chǎn)生和疾病的嚴(yán)重結(jié)果或治療應(yīng)答之間的聯(lián)系。8)如何、何時、何處及為什么產(chǎn)生了在免疫耐受中作為原因的(responsible)中斷？免疫是否在動物中導(dǎo)致了關(guān)節(jié)炎？9)昂貴的新生物制劑治療的安全性和功效。10)BLyD是否是治療RA的方法？選擇性地消減與RA有關(guān)的B細(xì)胞可以是有益的，因為這會防止產(chǎn)生RA特異性抗體。11)如果RA特異性抗體與RA的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，這是否意味著抗原特異性介入能預(yù)防慢性關(guān)節(jié)炎和長期關(guān)節(jié)損傷，并且沒有與目前的治療方案有關(guān)的副作用？12)巰基依賴型組織蛋白酶是RA治療開發(fā)的潛在靶標(biāo)。負(fù)責(zé)RA發(fā)生或治療的巰基部分是什么？酸化表位成分的后續(xù)研究，該自身抗體是RA血清中的新型類風(fēng)濕因子。如果基于自身抗體的早期RA分類代表了反映位于抗原性基質(zhì)的不完全表位的RA亞型，其抗原性分子基礎(chǔ)的分析能最終導(dǎo)致鑒定何種抗原性成分參與了不清楚的表位。如果這些成員屬于關(guān)鍵的突變新表位，其能成為用于產(chǎn)生絕對靈敏和特異的RA測試平臺。如果能證實表位4企測的抗體與疾病的發(fā)生有關(guān)，將在臨床實踐中實現(xiàn)有助于RA診斷和治療策略的深刻理解?，F(xiàn)有技術(shù)描述第7,022,485號美國專利涉及用于診斷或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的來自纖維蛋白的瓜氨酸多肽第5,888,833號美國專利涉及提取自哺乳動物馬爾皮基氏(malpighian)上皮的抗原，其被存在于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中的自身抗體特異性識別，對于與絲聚蛋白和人絲聚蛋白原共有的抗原決定簇，所述抗原包括抗原性蛋白及其肽片段。第6,858,438號美國專利涉及來自包含被自身抗體識別的絲聚蛋白或絲聚蛋白原片段的抗原的肽，該肽與患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的自身免疫抗體反應(yīng)。上文引用的參考文獻(xiàn)沒有教導(dǎo)或提出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異性自身抗體的抗原決定簇，所述決定簇的特征為存在半抗原Cit與Cys殘基之間形成的酰胺4建形成的二肽表位。發(fā)明概述本發(fā)明涉及被存在于患有RA的患者血清中的自身抗體特異性識別的抗原決定簇，其特征為存在由半抗原Cit與Cys殘基之間形成的酰胺鍵形成的二肽表位。本發(fā)明所述的抗原決定簇的特征為存在至少一個這種二肽表位，有利地含有多二肽(polydipeptide)表位，并且AA殘基的分子比為至少一個Cit對一個Cys。參見通式I-III。因此，本發(fā)明的主要目的是提供開發(fā)基于AA的圖譜庫的方法，所述圖譜庫能覆蓋并闡明RA特異性抗體確定的線性表位。圖譜庫特別用于在單個AA殘基的水平上掃描這些表位并且準(zhǔn)確地區(qū)分何種AA殘基參與了表位與其對應(yīng)抗體的相互作用。表位、編碼該表位的組分以及該表位推導(dǎo)的AA序列已^皮確定，并顯示與RA特異性抗體有關(guān)。本發(fā)明另一目的是提供具有能識別并檢測RA特異性抗體的特別顯著的特征的抗原決定簇。在具體的實施方案中，表位檢測的抗體檢測患有RA疾病或面臨發(fā)展RA疾病的風(fēng)險的個體。本發(fā)明的另一目的是為本領(lǐng)域提供免疫測定及其使用方法，從而能準(zhǔn)確、廉價和簡單地檢測諸如血清或滑液的體液中的RA特異性抗體。在具體的實施方案中，捕獲試劑是與固相支持物表面共價連接、能檢測存在的RA特異性抗體的抗原決定蔟。然后，利用與標(biāo)記結(jié)合的抗人IgG評估該;險測的抗體。本發(fā)明的另一目的是提供與RA的發(fā)生有關(guān)的二肽表位的免疫反應(yīng)形式。靶向表位的抗體用于引起RA患者的臨床和治療應(yīng)答的方法。攜帶該表位的治療組合物或含有該表位的分子可以用于藥物學(xué)中以治療或預(yù)防RA患者或有發(fā)生RA的風(fēng)險的前RA患者的疾病。通過下文的描述并結(jié)合所有附圖，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)勢將變得顯而易見，其中通過示例和實施例說明了本發(fā)明的某些實施方案。本文包含的任何附圖組成本說明書的一部分并包括本發(fā)明的示例性實施方案以及示例了不同的目的及其特征。為了本發(fā)明的目的，"二肽表位"理解為表示通過偶聯(lián)含有活性Cit的肽或非肽分子被免疫原性地半抗原化的單價半抗原自身表位，其序列是任何內(nèi)源活性Cys酶或具有至少一個活性位點Cys的其它活性Cys-蛋白/肽種類的天然化學(xué)連接作用形成的序列。為了本發(fā)明的目的，"天然化學(xué)連接"理解為表示特定的瓜氨酸化，其是通過在天然、重組或合成酶、蛋白質(zhì)、肽或非肽分子的活性位點Cys上結(jié)合含有活性Cit的肽或非肽分子的定點半抗原化突變。本發(fā)明所用的術(shù)語"活性Cys或活性位點Cys"表示天然、重組或合成酶、蛋白質(zhì)、肽或非肽分子的親核位點Cys。本發(fā)明所用的術(shù)語"活性Cit"表示含有親電子Cit的肽或非肽分子。為了本發(fā)明的目的，例如，可以通過天然、重組或合成酶、蛋白質(zhì)、肽或非肽分子的天然化學(xué)連接或通過直接將一種或多種二肽表位并入合成抗原的化學(xué)合成，在不存在或存在不同量的中性結(jié)合AA殘基或中性結(jié)合AA殘基模擬物(mimic)的條件下，制備"抗原"。附圖概述圖1顯示被RA特異性抗體識別的抗原決定簇的表位作圖，說明了天然存在的20個編碼的AA和1個非編碼的Cit中的每一個與^v患有RA的患者獲得的血清的反應(yīng)性；圖2顯示被RA特異性抗體識別的抗原決定簇的表位作圖，說明了乙?；?0個編碼的AA和1個非編碼的Cit中的每一個與乂人患有RA的患者獲得的血清的反應(yīng)性；圖3顯示^皮RA特異性抗體識別的抗原決定簇的表位作圖，說明了烷基化的20個編碼的AA和1個非編碼的Cit中的每一個與乂人患有RA的患者獲得的血清的反應(yīng)性；圖4顯示被RA特異性抗體識別的抗原決定簇的表位作圖，說明了烷基化和乙酰^f匕的20個編碼的AA和1個非編碼的Cit中的每一個與從患有RA的患者獲得的血清的反應(yīng)性；圖5是通過天然化學(xué)連接對蛋白進(jìn)行瓜氨酸化的圖示；圖6是通式表。20發(fā)明詳述定義"翻譯后修飾"是蛋白質(zhì)在其翻譯后的修飾。這是許多蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)生物合成中的一個后期步驟。本文所用的"翻譯后修飾，，指的是將其他化學(xué)基團(tuán)導(dǎo)入自身蛋白的抗原決定簇的組成中。術(shù)語"自身免疫"指的是自身抗體或淋巴細(xì)胞錯誤地攻擊產(chǎn)生它們的生物體的分子、細(xì)胞或組織的情況；這可以產(chǎn)生導(dǎo)致自身免疫疾病的病理結(jié)果。例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡和I型糖尿病。本文所用的術(shù)語"抗體"指的是"自身抗體'，，其是形成的抗產(chǎn)生它的個體的正常身體物質(zhì)的血清免疫球蛋白；一般通過抗體對物質(zhì)的特異性結(jié)合來定義抗體。術(shù)語"抗原"指的是能在哺乳動物中誘尋免疫應(yīng)答，并能被特異性抗體或特異性淋巴細(xì)胞特異結(jié)合的任何外源物質(zhì)。抗原如果能引發(fā)免疫應(yīng)答，還可以是免疫原，如果不能引發(fā)免疫應(yīng)答，則是半抗原。的靶標(biāo)的抗原，盡管該抗原是正常組織的成分。術(shù)語"人工抗原"指的是在自然界中不存在的人工制備的抗原。術(shù)語"半抗原"指的是具有抗原性特征但不具有免疫原性特征的物質(zhì)。半抗原是單獨給藥時不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，但是與諸如蛋白質(zhì)的大載體偶聯(lián)時能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的小分子，所述載體自身也不能引發(fā)免疫應(yīng)答?？梢杂米杂砂肟乖?、修飾的半抗原或與相鄰殘基結(jié)合的半抗原檢測針對半抗原-載體形成的抗體。本文所用的"單價半抗原"指的是僅具有一個連接位點的半抗原。本文所用的"捕獲抗原"指的是作為抗原基質(zhì)共價結(jié)合至固相支持物的單價半抗原的組合。本文所用的術(shù)語"表位"指的是諸如一級結(jié)構(gòu)和電荷的分子的集合特征，其依賴抗體的抗原結(jié)合位點(稱為對位)，在抗原上共同形成抗體結(jié)合的區(qū)域。表位可以被定義為在蛋白質(zhì)一級序列中靠在一起的一組氨基酸殘基，或在一級序列中完全分開，但作為蛋白質(zhì)自然折疊成其天然、全功能形態(tài)的結(jié)果而靠在一起的氨基酸。由在一級序列中靠在一起的殘基組成的表位被稱為鄰近的、連續(xù)的、順序的或線性表構(gòu)象的或"裝配的"表位。表位是天然存在的，并且可以被作圖、分離、純化或者另外被人制備沐t生。例如，可以通過從天然來源分離來制備表位，或根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法合成表位。這些方法中的一種是使用蛋白質(zhì)抗原的合成片段(肽)，其能與完整抗原的同源部分足夠相似從而允許抗體的結(jié)合。抗體對表位的親和力必須使得抗體/肽復(fù)合物在免疫檢測的條件下不明顯分離。該情況存在于線性表位，從而允許使用肽定義那些表位以及使用氨基酸和氨基酸模擬物定義單獨的表位。衍生/制備的表位可以是天然表位的類似物。在本發(fā)明公開的全文中，術(shù)語表位和半抗原經(jīng)常交換使用。術(shù)語"自身表位"指的是自身抗原的一部分，其是自身免疫應(yīng)答的特異性靶標(biāo)。"表位"指的是長度為約4個至約8個氨基酸的設(shè)計的肽的氨基酸序列中的殘基模式?？贵w的結(jié)合位點將容納約4-8個殘基的抗原決定簇。每一個氨基酸具有共同結(jié)構(gòu)，其中中心碳原子與氨基(NH。、羧基(COOH)、氫和可變的側(cè)鏈"R"共價連接。術(shù)語"殘基"指的是當(dāng)形成肽鍵或肽鍵模擬物時失去一分子水(來自含氮側(cè)的H+和來自羧基側(cè)的OH-)，從氨基酸形成的氨基酸殘基(-NHCHRCO-)。"負(fù)性結(jié)合殘基"或"有害殘基"是氨基酸殘基或氨基酸殘基模擬物，，如果其存在于表位的某些位置，會降低表位對相應(yīng)抗體的結(jié)合親和力。"中性結(jié)合殘基"是氨基酸殘基或氨基酸殘基模擬物，如果其存在于表位的某些位置，不會改變表位對相應(yīng)抗體的結(jié)合親和力。"正性結(jié)合殘基"是氨基酸殘基或氨基酸殘基模擬物，如果其存在于表位的某些位置，會增加表位對相應(yīng)抗體的結(jié)合親和力。"假正性結(jié)合殘基"是氨基酸殘基或氨基酸殘基模擬物，如果其存在于表位的某些位置，會增加表位對相應(yīng)抗體的結(jié)合親和力，而實際上其不被碎見為來自表位的成分。術(shù)語"間隔子(spacer)"理解為表示間隔子或連接子分子，其存在于分開的正性結(jié)合殘基之間，以使這些殘基共價連接至抗原決定簇。間隔子分子優(yōu)選為中性結(jié)合殘基。例如，間隔子分子可以是氨基酸殘基、氨基酸殘基模擬物及其組合。間隔子可以是如Cit或Cys的相同分子類型。間隔子分子可以通過，例如，酰胺鍵或可選擇地通過酯鍵、亞胺鍵或其組合與正性結(jié)合殘基連接。"基本錨定殘基"是位于沿著肽序列的特定位置的必需正性結(jié)合殘基，其被認(rèn)為提供了免疫原性肽和抗體之間的接觸點，一般地，確定長度的肽內(nèi)的一個、兩個或三個正性結(jié)合殘基限定了免疫原性肽的"表位"。這些殘基被認(rèn)為適合與抗體的抗原結(jié)合位點緊密接觸，并且其側(cè)鏈掩藏于結(jié)合位點自身的特異性口袋(pocket)中。"天然"序列指自然界中發(fā)現(xiàn)的序列。術(shù)語"分析物"指待測定或測量的化學(xué)組分。術(shù)語"交叉反應(yīng)性"指對一種抗原特異的抗體與第二種抗原反應(yīng)的能力；基于IC50值(移置50%的結(jié)合的抗體的分析物的摩爾數(shù))測量兩種不同抗原性物質(zhì)之間的關(guān)^:性(％)。測試的術(shù)語"靈敏度"指所有陽性中，測試檢測到的真陽性的比例。因此，靈敏度是測試鑒定陽性的準(zhǔn)確度的標(biāo)準(zhǔn)。所有的陽性是(檢測到的)真陽性(TP)與(未檢測到的)假陰性(FN)之和。因此，靈敏度為TP/(TP+FN)x100%。測試的術(shù)語"特異性"指所有陰性中，測試檢測到的真陰性的比例。因此，特異性是測試鑒定陰性的準(zhǔn)確度的標(biāo)準(zhǔn)。所有的陰性是(檢測到的)真陰性與(誤診的)假陽性(FP)之和。因此，特異性為TN/(TN+FP)x100%。術(shù)語"檢測(detecting)"或"檢測(detection)"指定性或定量地測定研究的生物分子的存在。氨基酸的全部集合指20個編碼的天然存在的氨基酸和1個非編碼的天然存在的Cit。用于描述表位化合物的命名遵循慣例，其中氨基位于每一氨基酸殘基的左側(cè)(N-末端)，羧基位于每一氨基酸殘基的右側(cè)(C-末端)。氨基23酸殘基的a-形式表示為單個大寫字母或第一個字母大寫的三字母符號。瓜氨酸目前沒有字母符號，簡單地用"Z"或"Clt"表示。a氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)符號/命名如下所述單字母三字母符號氨基酸AAla丙氨酸；CCys半胱氨酸；DAsp天冬氨酸；EGlu谷氨酸；FPhe苯丙氨酸；GGly甘氨酸；HHis組氨酸；Ilie異亮氨酸；KLys賴氨酸；LLeu亮氨酸；MMet甲硫氨酸；NAsn天冬酰胺；PPro月t氨酸；QGln谷氨酰胺；RArg精氨酸；SSer絲氨酸；TThr蘇氨酸；VVal纈氨酸；WTrp色氨酸；YTyr酪氨酸；ZCit瓜氨酸。本文所用的縮寫如下所述AA:氨基酸；ACR:美國風(fēng)濕病學(xué)會；AFA:抗絲聚蛋白抗體；AKA:抗角蛋白抗體APA:抗核周因子；Be:丁酯；BlyD:B淋巴細(xì)月包消減；BSA:牛血清白蛋白；CP:瓜氨酸化內(nèi)源蛋白/肽；CCP:單環(huán)瓜氨酸化肽；CCP1:在第一代RA測試中形成的來自絲聚蛋白序列的CCP;CCP2:在第二代RA測試中形成的與絲聚蛋白或其它已知蛋白沒有同源性的人工CCP;CRP:C-反應(yīng)性蛋白；CT:C-末端；DMARD:緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物；EBV:愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-barrvirus);Ee:乙酯；ELISA:酶聯(lián)免疫p及附測定；ESR:紅細(xì)胞沉降率；IP:間質(zhì)性肺炎；LCP:短直鏈瓜氨酸化肽；McAb:單克隆抗體；Me:曱酯；MHC:主要組織相容性復(fù)合物；MW:分子量；NO:—氧化氮；NOS:—氧化氮合成酶；NT:N-末端；PAD:肽基精氨酸脫亞胺酶；PADI2:PAD的同型2;PADI4:PAD的同型4;PBST:磷酸鹽緩沖液-吐溫20:PcAb:多克隆抗體；Pe:丙酯；RA:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；RF:類風(fēng)濕因子；SE共同表佐TMS3,3，,5,5，-四曱基耳關(guān)苯胺；TNFce:腫瘤壞死因子a;WBC:白細(xì)胞數(shù)。目前缺乏關(guān)于研究中的表位的天然序列的知識。這不利于解釋為什么瓜氨酸化抗原的抗體在高特異性下具有低靈敏度以及用作RA診斷和預(yù)后標(biāo)志物時，與藥物治療相矛盾的臨床和試驗室應(yīng)答。Cit是化學(xué)結(jié)構(gòu)與Arg非常類似的非編碼氨基酸，唯一的不同是中性脲基代替了正電荷胍基。據(jù)報道，Cit為被RA特異性抗體識別的表位的必需組分。發(fā)明人未發(fā)表的表位作圖研究發(fā)現(xiàn)Clt不結(jié)合任何RA特異性抗體，但是Cit殘基可以。含有結(jié)合的氨基和羧基這兩者的衍生Cit的反應(yīng)性高于僅含有結(jié)合的氨基或羧基的衍生Cit的反應(yīng)性。存在于RA患者中的瓜氨酸化抗原的抗體以及作為抗體識別的表位的部分的Cit殘基是有望準(zhǔn)確編碼到目前為止未很好了解的表位的兩個主要條件。通過測定與包括20種編碼的氨基酸和1種非編碼的Cit在內(nèi)的21種ce-氨基酸以及其書f生物的每一種的交叉反應(yīng)性，對RA特異性抗體靶向的表位作圖(mapping)進(jìn)行了研究，所述衍生物代表可能存在于表位中的對應(yīng)殘基變體。通過3點藥效團(tuán)模型來描述這些分析物以表示對抗體結(jié)合具重要性的結(jié)構(gòu)特征。點1是與ce-碳相連的氨基(-NH2)官能團(tuán)或位于a-NH2的其類似物。點2是與ce-碳相連的羧酸(-COOH)或位于a-COOH的其類似物。點3是與a-碳相連的不同側(cè)鏈R。分析物交叉反應(yīng)性的三點分析可以提供更為靈敏和特異的方法以確定哪些氨基酸殘基參與表位形成以及哪些氨基酸序列存在于該表位中。本發(fā)明涉及RA的抗原決定簇，其特征為與至少一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)特異性自身抗體反應(yīng)，其包括如通式III的二肽序列，包括至少一個o;-Cit殘基和至少一個ce-Cys殘基；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中，所述a-Cit殘基是具有如下通式I的半抗原部分其中，A為NH2;B為-0-;D為-NH-;F為-NHCO-或-NR-,其中R為氫或酰基；G為-CONH-或-COOR，其中R為烷基；并且E為(CH2)n，，其中n，為1至6的整數(shù)；其中，所述ce-Cys殘基是具有如下通式II的半抗原部分，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>其中S為-SH，或者當(dāng)a-Cys的自由巰基(SH)通過二硫鍵與另一o;-Cys交聯(lián)時，S為SS;F為-NHCO-或-NR-,其中R為氫或?；?；G為-CONH-或-COOR-，其中R為烷基；并且E為(CH2)n,，其中n，為1至6的整數(shù)；由此提供了作為RA的抗原決定簇起作用的人工抗原成分。本發(fā)明還涉及制備RA的抗原決定簇的方法，所述抗原決定簇的特征為與至少一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)特異性自身抗體反應(yīng)，該方法包括通過以C-末端Cit硫酯作為親電子試劑并且以N-末端-Cys作為親核試劑的巰基-硫酯交換，通過;^酯捕獲進(jìn)行半胱氨酸連接，該連接導(dǎo)致在兩個肽片段之間形成具有如下通式III的瓜氨酸化的含半胱氨酸的肽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>其中，所述a-Cit殘基是具有如下通式I的半抗原部々<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>其中，A為NH2;B為-O-;D為-NH-;F為-NHCO-或-NR-，其中R為氫或酰基；G為-CONH-或-COOR,其中R為烷基；并且E為(CH2)n，，其中n，為1至6的整數(shù)；以及其中，所述a-Cys殘基是具有如下通式II的半抗原部分其中S為-SH,或者當(dāng)o;-Cys的自由巰基(SH)通過二硫鍵與另一a-Cys交聯(lián)時，S為SS;F為-NHCO-或-NR-，其中R為氫或?；?；G為-CONH-或-COOR-,其中R為烷基；并且E為(CH2)n，，其中n，為1至6的整數(shù)。對于上文所述的抗原決定簇，可以認(rèn)為，自身抗體參與RA疾病的發(fā)病機(jī)理，且所述抗原/抗體復(fù)合物的形成表明存在RA特異性自身抗體并且作為RA的i貪斷。在具體的實施方案中，包含至少一個Cit殘基和一個Cys殘基的人工抗原通過間隔子Tn,連接，其中n，為l至6的整數(shù)，從而產(chǎn)生具有如下通式IV的抗原決定蔟FGF^G在另一實施方案中，人工抗原N-末端-Cys由一個或多個Cit連接,從而產(chǎn)生具有如下通式V的抗原決定簇GVIcIIEI.sOIDICIEIC,A、V27仍然在另一實施方菜中，人工抗原N-末端-Cys由一個或多個Cit通過間隔子Tn連接，從而產(chǎn)生具有如下通式VI的抗原決定簇在另一迭代中，人工抗原N-末端-Cys由一個或多個Cit通過間P鬲子7V連接，包舍至少一個Cys，從而所述抗原決定.蔬具有如下通式VII:根據(jù)本發(fā)明，可以認(rèn)為，抗原決定簇可以是與載體分子偶聯(lián)的人工抗原。而且，可以共價或非共i"介地將人工抗原固定于固相支持物。另外，可以標(biāo)記人工抗原。還可以考慮提供藥物組合物，其包含與藥物可接受的載體結(jié)合的本發(fā)明所述的肽序列。以適合口服或腸胃外給藥的藥物制劑、其鹽、稀釋劑或賦形劑的形式提供藥物可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明，還可以考慮提供單克隆抗體或多克隆抗血清，其包含特異性結(jié)合至少一種如本文所示的二肽序列呈現(xiàn)的半抗原部分；還提供了進(jìn)行RA測試的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒以測定RA特異性自身抗體的存在，所述試劑盒包含a)具有選自通式III-VII的通式、作為捕獲抗原固定于固相支持物的至少一種抗原，由此將生物樣品中的所述自身抗體與所述捕獲抗原接觸，并將標(biāo)記的抗人IgG與由所述捕獲抗原連接的所述自身抗體進(jìn)行孵育，從而測定所述自身抗體的存在，其中確定了RA的診斷和嚴(yán)重性；以及提供了測定RA特異性自身抗體的存在的夾心ELISA試劑盒，其包含結(jié)合選自通式I-VII的至少一種抗原的單克隆或多克隆抗體，所述抗體作為捕獲抗體固定于固相支持物；由此將生物樣品中的所述自身抗體作為報道抗體與由捕獲抗體連接的所述抗原反應(yīng)，然后將標(biāo)記的抗人IgG與由所述報道抗體、所述抗原和所述捕獲抗體形成的所述夾心進(jìn)行孵育，/人而檢測RA并且所述報道抗體的劑量變化確定RA的嚴(yán)重度。現(xiàn)在將通過下文的實施例，更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。氨基酸衍生物的制備通過肽的一級氨基酸序列制備被B細(xì)胞和B細(xì)胞分泌的抗體識別的線性表位，該序列以第一個氨基酸的氨基起始，并連續(xù)至最后的AA的羧基末端，并且兩個AA殘基之間存在肽4建。為了保證在單個AA殘基的水平上研究線性表位，利用已知的方法(參見,例如，Herrera-Marschit&Leibach&Lubec,AminoAcids,ISSN:0939-4451,SpringerWien,2004)，通過在點l添加乙?；?，或在點2添加烷基或在點1和2添加乙酰基和烷基對氨基酸進(jìn)行衍生化?？梢詮闹T如Sigma化學(xué)制品公司(SiLouis,MO)的化學(xué)制劑供應(yīng)商處購買用于進(jìn)行AA乙酰化和烷基化的氨基酸和衍生化試劑。AA衍生物通過反相高效液相色i普法測定的純度至少為95%。通過氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)確定衍生的AA的成分。表位成分根據(jù)本發(fā)明，通過利用間接ELISA測定交叉反應(yīng)性檢測識別RA特異性抗體的線性表位成分，該間4妄ELISA以固定的CCP2作為捕獲抗原(ImmunoscanRA,CatRA-96,LotFS2900)并且以包括來自歐洲診斷7>司(Eurodiagnostic)(ImmunoscanRA,CatRA-96,LotFS3166)的1份血清和來自抗CCP2陽性RA患者的3份血清在內(nèi)的4份陽性血清作為檢測抗體。使用全部21種氨基酸及其衍生物作為分析物以測定是否任一分析物抑制檢測抗體結(jié)合捕獲抗原的作用。通過在一系列移動窗(movingwindow)中的單個AA水平觀察不同的衍生化進(jìn)行測定。只要可能的AA衍生物可以得到，則按照該程序確保不會錯過表位的抗原成分。在流動相中開始該分析，其中首先將檢測抗體與每一分析物孵育。于4。C孵育過夜后，向在表面固定了CCP2的96孔微板的每孔中添加100/xl預(yù)吸附了4企測抗體的分析物，并將其在室溫?fù)u動孵育1小時。然后倒空平板，將其用洗滌緩沖液洗滌5次，然后每孔添加100/xl結(jié)合了過氧化物酶的抗人IgG(ImmunoscanRA,CatRA-96，LotFS3165),即報道抗體，并在室溫?fù)u動孵育l小時。倒空并洗掉任何未結(jié)合的物質(zhì)后，向每孔中添加100/xl過氧化物酶底物TMB(ImmunoscanRA,CatRA-96,LotFS3156)并在室溫避光孵育30min。通過向每孔中添加100/xl0.5MH2S04終止反應(yīng)，并且在A450nm處評估結(jié)果。間接ELISA的思想基于未知量的分析物與已知量的固定抗原之間針對有限數(shù)目的檢測抗體結(jié)合位點的抑制實驗。如果檢測抗體和固定的抗原的含量保持不變，檢測抗體在固定的抗原結(jié)合的檢測抗體與分析物結(jié)合的檢測抗體之間的分布取決于樣品分析物的量。固定抗原結(jié)合的檢測抗體的量與分析物結(jié)合的檢測抗體的量成反比。當(dāng)分析物的存在導(dǎo)致抗體與CCP2的結(jié)合相互作用下降至少70%時，則認(rèn)為分析物是表位的成分。相反，不被視為來自表位的成分的殘基不能產(chǎn)生這種相互作用。因此，間接ELISA提供了關(guān)于被RA特異性抗體識別的線性表位的成分的準(zhǔn)確信息。如圖1的抗原決定簇的氨基酸譜所示，用來自歐洲診斷公司(Euro-diagnostica)(血清l)和來自三個RA患者(血清23和4)的血清，對在不同濃度的不同氨基酸的CCP2陽性進(jìn)行ELISA。每一豎條表示發(fā)現(xiàn)的50mM的AA抑制抗體結(jié)合固定的CCP2的能力。100%處的水平線表示CCP2與抗體的對照結(jié)合百分比。如圖2的抗原決定簇的乙?；被嶙V所示，用來自歐洲診斷公司(血清1)和來自三個RA患者(血清2、3和4)的血清，對在不同濃度的不同乙酰基氨基酸的CCP2陽性進(jìn)行ELISA。每一豎條表示發(fā)現(xiàn)的50mM乙?；鵄A抑制抗體結(jié)合固定的CCP2的能力。100%處的水平線表示CCP2與抗體的對照結(jié)合百分比。如圖3的抗原決定簇的烷基氨基酸譜所示，用來自歐洲診斷公司(血清l)和來自RA三個患者(血清2、3和4)的血清對在不同濃度的不同烷基氨基酸的CCP2陽性進(jìn)行ELISA。每一豎條表示發(fā)現(xiàn)的50mM烷基AA抑制抗體結(jié)合固定的CCP2的能力。100%處的水平線表示CCP2與抗體的對照結(jié)合百分比。如圖4的抗原決定簇的乙?；被釙貂プV所示，用來自歐洲診斷公司(血清l)和來自三個RA患者(血清2、3和4)的血清對在不同濃度的不同乙酰基氨基酸曱酯的CCP2陽性進(jìn)行ELISA。每一豎條表示發(fā)現(xiàn)的50mM的乙?；被釙貂ヒ种瓶贵w結(jié)合固定的CCP2的能力。100%處的水平線表示CCP2與抗體的對照結(jié)合百分比。參見圖5的通過天然化學(xué)連接對蛋白質(zhì)進(jìn)行瓜氨酸化的圖示，CT-Cit和NT-Cys石危酯表示一對親電子和親核片,爻。CT-Cit辟u酯經(jīng)歷了NT-Cys的巰基的親核攻擊。初始硫酯連接產(chǎn)物經(jīng)歷快速分子內(nèi)的石克酯至酰胺的重排以得到在連接位點具有天然酰胺4建的新表位Cit-Cys,其破壞自身蛋白的免疫耐受。第1部分為化學(xué)選擇性巰基酯交換(transthiolesterification);第2部分為分子內(nèi)自發(fā)地S至N?；D(zhuǎn)移。還如圖1所示，當(dāng)檢測中的分析物譜是a-氨基酸時，只有Cit和Cys表現(xiàn)出有限的抑制抗體結(jié)合固定的CCP2的能力。所有21種氨基酸都被排除為表位的部分。編碼或非編碼的氨基酸都沒在線性表位中表現(xiàn)出任何抗原性殘基譜。還如圖2所示，當(dāng)檢測中的分析物語是乙酰化a-氨基酸時，乙?；鵆it和乙?；鵆ys表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制，乙酰基Arg表現(xiàn)出有限的抑制，而其余的18種乙?；被釒缀鯖]有表現(xiàn)出對抗體結(jié)合CCP2的抑制。類似地，還如圖3所示，當(dāng)檢測中的分析物語是烷基化a-氨基酸時，記錄了免疫應(yīng)答的趨勢。還如圖4所示，當(dāng)檢測中的分析物譜是諸如乙?；被釙貂サ囊阴；痗e-烷基氨基酸時，肽中才莫擬氨基酸殘基揭示點1和點2之間的特征對于4種抗體對Cit和Cys的免疫識別是重要的。如表1所示，31抗體對乙?；?Cit、Cit-Me和乙?；?Cit-Me分別表現(xiàn)出74%、81%和100%的交叉反應(yīng)性；并且對乙?；?Cys、Cys-Me和乙?；?Cys-Me分別表現(xiàn)出50%、48%和57%的交叉反應(yīng)性。查看表1得到下面的解釋和觀察結(jié)果表1RA特異性抗體與a-氨基酸衍生物的交叉反應(yīng)性<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>除了胍基代替了側(cè)鏈中的脲基，Arg與Cit是相同的?？贵w與Arg和Cit的交叉反應(yīng)性為0。乙?；?Arg、Arg-Me和乙?；?Arg-Me具有與Arg相同的側(cè)鏈，但是O!位的羧基和氨基被乙?；蛲榛蛲瑫r乙?；屯榛？贵w與乙酰基-Arg、Arg-Me和乙酰基-Arg-Me的交叉反應(yīng)性分別為5%、6%和13%。Met和Cys是僅有的含硫氨基酸。Met與Cys的不同在于增加了亞曱基并且曱基取代了側(cè)鏈中巰基的氫。除了羥基的氧代替了側(cè)鏈中巰基的6乾，Ser與Cys是相同的?？贵w對Cys、Met、Ser、乙?；?Met、乙?；?Ser、Met-Me、Ser-Me、乙?；?Met-Me和乙?；?Ser-Me分別表現(xiàn)出的交叉反應(yīng)性為0。通過4種乙?；疌it衍生物分析了通過在cd立連接使得Cit具有抗原性的橋接基。這4種乙?；疌it衍生物與Cit的不同在于曱基、乙基、丙基或丁基取代了分子中羧基的氫。抗體對Cit-Me、Cit-Ee、Cit-Pe和Cit-Be表現(xiàn)出的交叉反應(yīng)性分別為81%、72%、115%和124%。a-碳連接的含脲基側(cè)鏈和與長度至少為3個碳原子的合適橋接基結(jié)合的氨基或羧基或這兩者，是這些抗體識別Cit嚴(yán)格必需的。乙?；?Cys或Cys-Me與乙酰基-Cys-Me之間交叉反應(yīng)性的微小差別表明Cys是橋接基，其保持它的羧基在自身蛋白中被結(jié)合，并使它含巰基的側(cè)鏈和氨基自由地與Cit的羧基連接以形成新表位。a-碳連接的含巰基側(cè)鏈以及至少一個被結(jié)合的氨基和羧基這兩者是這些抗體識別Cys嚴(yán)格必需的。Cit和Cys殘基是兩個正性結(jié)合殘基，并且是兩個基本錨定殘基。Arg殘基是假正性結(jié)合殘基。除了Cit、Cys和Arg外的AA殘基是負(fù)性或中性結(jié)合殘基。當(dāng)Cit與Cys殘基之間引入酰胺化時，形成了二肽新表位，這產(chǎn)生了具有抗原性的結(jié)構(gòu)和電荷特征、含脲基和含巰基的側(cè)鏈。Cit表現(xiàn)出a-氨基酸家族的共同反應(yīng)性。具體地，它能形成肽鍵；因此，它能存在于蛋白質(zhì)中。然而，沒有試驗證據(jù)顯示Cit能在翻譯期間同Cys摻入蛋白質(zhì)，因為沒有證據(jù)表明存在能轉(zhuǎn)運Cit同Cys的tRNA。存在于蛋白質(zhì)中的Clt一定是來自蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。PAD被認(rèn)為負(fù)責(zé)這種修飾，即將肽基Arg轉(zhuǎn)變成肽基Cit的瓜氨酸化。對肽的研究表明與Arg相鄰的AA殘基的類型影響它對通過PAD的瓜氨酸化的^:感性。例如，夾在兩個Pro殘基之間的單個Arg不能被瓜氨酸化；與通過二硫鍵與另一Cys交聯(lián)的Cys相鄰的Arg對瓜氨酸化表現(xiàn)出4艮高的抵抗性。在這種條件下，由于胱氨酸二硫鍵的還原，PDA不能使在Cys側(cè)面的Arg瓜氨酸化，并且4艮少發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面的Cys,這證明在二肽新表位的形成中，存在不同于PAD的過程?？紤]到NOS酶(催化形成NO和Cit)在炎癥部位的高活性，RA中依賴NO的組織損傷、鳥氨酸/瓜氨酸載體的依賴巰基的轉(zhuǎn)運活性、Cys蛋白酶組織蛋白酶在抗原呈遞中以及RA的關(guān)節(jié)炎癥和損傷中依賴巰基的催化活性，以及RA血漿中改變的巰基模式包括明顯低水平的蛋白質(zhì)疏基和半胱氨酰甘氨酸及明顯增加的胱氨酸、同型胱氨酸和與蛋白質(zhì)結(jié)合的Cys及同型半胱氨酸，人們可以推測瓜氨酸化抗原形成與這些相關(guān)酶或蛋白質(zhì)的依賴巰基的活性之間有某些聯(lián)系。通過Cys的親核巰基殘基形成這些酶的活性位點，其能容易地被親電子部分靶向，所述親電子部分位于被酶的底物結(jié)合區(qū)域識別的肽或其它結(jié)構(gòu)內(nèi)。親電子部分能作為可逆或不可逆的抑制劑滅活靶向的酶。設(shè)計新型治療劑的進(jìn)展主要集中于來自具有巰基誘捕藥效團(tuán)的低MW化合物的可逆性抑制劑，該藥效團(tuán)被認(rèn)為通過耙向滅活酶的活性位點具有抗關(guān)節(jié)炎活性。對不可逆性抑制劑的普遍顧慮在于盡管其有選擇性，但它們具有半抗原化的潛在缺點，當(dāng)隨時間與反應(yīng)性Cys酶和引起共價結(jié)合的天然肽連接的其它反應(yīng)性Cys-蛋白種類反應(yīng)時，它們能引起毒副作用或產(chǎn)生免疫原性半抗原。還如圖5所示，從而合理地假定，天然肽連接，而不是PAD,是參與產(chǎn)生新表位的唯一蛋白質(zhì)翻譯后修飾。該過程假定具有親電子官能的CT-Cit酯或硫酯片段能與NT-Cys-親核片段反應(yīng)，然后發(fā)生形成天然肽鍵的S—N酰基重排，從而使Cit和Cys并入線性二肽基新表位。對該表位區(qū)域的任何修飾，例如通過導(dǎo)入另外的取代基引起的電子離域或用任何其它氨基酸代替這些殘基中的任意一個，能導(dǎo)致抗體結(jié)合的喪失或?qū)е录訇栃钥贵w結(jié)合，這表明Cit和Cys都是基本錨定殘基，其連同肽連接形成RA特異性抗體的二肽表位成分的整體識別位點。線性二肽表位的制備以單獨合成或作為多表位肽合成。本發(fā)明所述的表位可以具有多種長度，并且可以是其中性(不帶電荷)形式或成鹽形式。本發(fā)明所述的表位可以含有諸如糖基化、側(cè)鏈氧化或烷基化的修飾，通常要滿足的條件是修飾不影響表位的免疫原性。能夠以多種方式制備本發(fā)明的肽表位。對于優(yōu)選的相對短的尺寸，可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)在溶液或在固相支持物上合成表位。多種自動合成儀可以商購并能根據(jù)已知的方法使用。另外，可以利用化學(xué)連接將單獨的肽表位接合以制備仍然在本發(fā)明范圍內(nèi)的更大的肽?？蛇x才奪地，可以應(yīng)用重組DNA技術(shù)，其中將編碼感興趣的免疫原性肽的核酸序列插入表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至合適的宿主細(xì)胞中，并在適合表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。因此，包含本發(fā)明的一個或多個表位的重組肽、肽中含有Arg殘基的表位能通過PAD進(jìn)行酶促脫亞胺。基于已知的二肽表位成分合成線性肽表位(表1)。形成在本文中稱為多瓜氨酸GtDl和瓜氨酸化半胱氨酸CitD2的兩種多表位肽，例如，每一種具有21個AA。通過固相策略合成CitDl和CitD2，CitDl對應(yīng)于二肽表位的N末端，Cit殘基Cit-Cit陽Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit陽Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit,CitD2對應(yīng)于從N末端的表位，Cit和Cys殘基Cit-Cys-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cys-Cys-Cit-Cit-Cit-Cit-Cys-Cit-Cit-Cys-Cit-Cys。通過高效液相色譜法測定的肽的純度至少為95%。通過氨基酸測序和質(zhì)譜法對肽的鑒定是一致的。所有的肽作為肽酖胺合成。RA特異性自身抗體的檢測本文提供的方法包括檢測能結(jié)合上文所述的抗原成分的RA特異性抗體的才支術(shù)。這些方法允許檢測二肽表位的循環(huán)抗體以表明RA患者中存在抗體，從而診斷RA或預(yù)測患有發(fā)展中的RA的個體的侵蝕性疾病或監(jiān)控治療該疾病的治療劑的進(jìn)展。本領(lǐng)域有許多已知技術(shù)用于檢測或測量抗體-抗原復(fù)合物，其在本文中又稱為結(jié)合的抗體或免疫復(fù)合物。傳統(tǒng)方法包括提供含有抗體的樣本和該抗體特異性的已知的固定的抗原，將結(jié)合的抗體與游離抗體分離，并測定結(jié)合的抗體的量。本文的抗抗體指的是第二抗體或用可;險測標(biāo)記標(biāo)記的寺艮道抗體，其用于輔助測定結(jié)合的抗體的量。標(biāo)記通常為酶或熒光或放射活性基團(tuán)。然后利用諸如分光光度測定法、閃爍計凄t或流式細(xì)月包術(shù)的本領(lǐng)i或:技術(shù)人員熟知的方法4全測標(biāo)記?？梢酝ㄟ^包被或?qū)⒖乖矁r偶聯(lián)至諸如96孔微板的孔或球或顆粒的固相來制備固定的抗原。在優(yōu)選的實施方案中，通過肽鍵將捕獲抗原共價偶聯(lián)至96孔免疫測定微板(Corning,Acton,MA)的孔中的N-氧代琥珀酰亞胺表面用于抗體的ELISA檢測。將抗原以10/xg/ml的濃度溶解于稀釋劑(50mmol/LNa3P04，1mmol/LEDTA,pH8.5)中，并每孔加入100于4。C進(jìn)行偶聯(lián)達(dá)16小時。用溶于稀釋劑的2%BSA在室溫封閉孔1小時。用含有溶于PBS(10mmolPB,300mmolNaCl)中的0.05%吐溫20、1%BSA和10%FBS的的稀釋緩沖液以1:200的比率稀釋用作檢測抗體的患者血清和正常血清。含有抗CCP2的陽性標(biāo)準(zhǔn)血清在此處被稱為RA，使用正常血清的陰性標(biāo)準(zhǔn)血清在此處被稱為健康對照。向每孔中添加IO(H鼓升稀釋的血清。在室溫?fù)u動孵育1小時后，用PBST洗滌孔三次。將結(jié)合辣才艮過氧化酶的山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA)以1:10000的比率牙希津奪于稀釋緩沖液中，并將其用作報道抗體，向每孔中添加100jul稀釋的36結(jié)合辣才艮過氧化酶的山羊抗人IgG并在室溫?fù)u動孵育1h。用PBST洗滌四次后，用酶底物TMB一企測結(jié)合的抗體。反應(yīng)在室溫下避光進(jìn)行30rmn，而后向每孔添加100yl2M碌iJ臾以終止反應(yīng)。在波長為450nm的吸光度(A450)處讀板。通過計算的指數(shù)表示抗體的效價，該指數(shù)通過下述方法計算([測量的樣品血清的A450-陰性標(biāo)準(zhǔn)的A450]/[陽性標(biāo)準(zhǔn)的A450-陰性標(biāo)準(zhǔn)的A450])xl00。測定內(nèi)和測定間的變異小于10%。從接收器工作特性(ROC)曲線確定ELISA的最佳界限(cut-off)值。結(jié)果從根據(jù)AC'R標(biāo)準(zhǔn)被診斷為RA的55名患者、從作為對照組的28名健康個體獲得血清樣品，并且將所有的樣品通過全面的醫(yī)學(xué)測試進(jìn)行篩選。結(jié)果列于表2中。表2捕獲抗原成分對通過ELISA進(jìn)行的RA測試的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>在55名RA患者中，37名是抗CCP2抗體陽性的，49名是抗CitDl陽性的，并且54名是抗CitD2陽性的。表示為真陽性百分比的診斷靈敏度對抗CCP2、抗CitDl和抗CitD2分別是67%、89%和98%。在與CCP2反應(yīng)的血清中，81。/。的血清被CitDl識別，并且所有的這些血清都被CitD2識別。在與CitDl反應(yīng)的血清中，59%的血清被CCP2識別，并且所有的這些血清都被CitD2識別。這些結(jié)果清楚地證明，非Cit和Cys的氨基酸殘基與靈敏度無關(guān)。利用線性二肽CitD2作為抗原底物獲得的98%的靈敏度表明了與RF測試或CCP2測試相比顯著和有效的改進(jìn)。Cys對靈敏度的貢獻(xiàn)通過作為基本錨定殘基參與表位形成而不是作為中性殘基在表位外限制有利于抗體結(jié)合的肽構(gòu)象來實現(xiàn)。在全部28個對照血清中，沒有一個對抗CCP2、抗和抗CitD2是陽性的。因此，表達(dá)為真陰性百分比的診斷特異性，對抗CCP2、抗CkDl和抗CitD2分別是100%。申請人認(rèn)為新表位，特別是從天然肽連接產(chǎn)生的那些新表位，在其它自身免疫疾病中也起到關(guān)鍵的作用，所述天然肽連接來自修飾的氨基酸或肽通過酰胺4建并入NT-Cys殘基。因此，本發(fā)明還涉及連接部位的表位，其包含Cys和》f飾的氨基酸或肽，與來自患有RA外的自身免疫疾病的患者的自身抗體反應(yīng)。通過天然肽連接形成的新表位可用于開發(fā)針對這些疾病的單克隆抗體和診斷各自的自身免疫疾病，特別用于檢測包括疑似患有自身免疫疾病的患者的血液、血漿和血清在內(nèi)的體液中的自身抗體。而且，表位和抗體為借助組合化學(xué)開發(fā)有機(jī)化合物提供了可能性，該化合物用于包括自身免疫疾病治療中的基于抗原的免疫介入在內(nèi)的新型診斷和治療，所述化合物包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本說明書提及的所有專利和出版物代表本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有專利和出版物都通過引用的方式并入本文，其引用的程度如同每一單獨的出版物被特別和單獨地指出通過引用的方式并入本文。應(yīng)當(dāng)理解，盡管示例了本發(fā)明的某些形式，但本發(fā)明并不局限于本文描述和顯示的具體形式或布局。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以做出各種變化，并且不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明局限于包括在本文中的說明書和任何附圖/圖形所顯示和描述的內(nèi)容。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明完全適于實現(xiàn)發(fā)明目的并獲4f所述的以及其中固有的那些目標(biāo)和優(yōu)勢。本文所述的實施方案、方法、程序和技術(shù)目前代表優(yōu)選的實施方案，其旨在示例而不是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以想到的本發(fā)明的變化和其它用途屬于本發(fā)明的范疇并被所附的權(quán)利要求書的范圍所限定。盡管結(jié)合具體的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)被不恰當(dāng)?shù)叵拗朴谶@些具體的實施方案。實際上，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所述實施本發(fā)明的方式的各種變化均在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。38權(quán)利要求1.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的抗原決定簇，其特征為與至少一種RA-特異性自身抗體反應(yīng)，所述抗原決定簇包括如通式III的二肽序列，其包括至少一個α-Cit殘基和至少一個α-Cys殘基；其中所述α-Cit殘基為具有如下通式I的半抗原部分，其中，A為NH2；B為-O-；D為-NH-；F為-NHCO-或-NR-，其中R為氫或酰基；G為-CONH-或-COOR，其中R為烷基；并且E為(CH2)n’，其中n’為1至6的整數(shù)；其中所述α-Cys殘基是具有如下通式II的半抗原部分，其中S為-SH，或者當(dāng)α-Cys的自由巰基(SH)通過二硫鍵與另一α-Cys交聯(lián)時，S為SS；F為-NHCO-或-NR-，其中R為氫或?；籊為-CONH-或-COOR-，其中R為烷基；并且E為(CH2)n’，其中n’為1至6的整數(shù)；由此提供了作為RA抗原決定簇起作用的人工抗原成分。2.制備特征為與至少一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)特異性自身抗體反應(yīng)的RA抗原決定簇的方法，其包括通過以C-末端-Cit碌iJ旨作為親電子試劑并且以N-末端-Cys作為親核試劑的巰基-硫酯交換，通過硫酯捕獲進(jìn)行半胱氨酸連接，該連接導(dǎo)致在兩個肽片段之間形成了具有如下通式III的瓜氨酸化的含半胱氨酸的肽A、czB，f/cy:、gs坦其中，所述a-Cit殘基是具有如下通式I的半抗原部分，9E1F人Gi其中，A為NH2;B為-O-;D為-NH-;F為-NHCO-或-NR-,其中R為氫或?；籊為-CONH-或-COOR,其中R為烷基；并且E為(CH2)n，，其中n，為1至6的整數(shù)；并且其中，所述a-Cys殘基是具有如下通式II的半抗原部分，f「j\f、gil其中S為-SH，或者當(dāng)a-Cys的自由巰基(SH)通過二硫鍵與另一a-Cys交聯(lián)時，S為SS;F為-NHCO-或-NR-,其中R為氫或酰基；G為-CONH-或-COOR-，其中R為烷基；并且E為(CH2)n,，其中n，為1至6的整數(shù)。3.如權(quán)利要求1所述的抗原決定簇，其中所述自身抗體與RA疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，且所述抗原/抗體復(fù)合物的形成表明存在RA特異性自身抗體并且作為RA的診斷。4.如權(quán)利要求1所述的抗原決定簇，其中包含至少一個Cit殘基和一個Cys殘基的所述人工抗原通過間隔子Tn，連接，其中n，為1至6的整數(shù)，從而產(chǎn)生具有如下通式IV的抗原決定簇<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>5.如權(quán)利要求1所述的抗原決定簇，其中所述人工抗原N-末端-Cys由一個多或多個Cit連接，從而產(chǎn)生具有如下通式V的抗原決定蔟二<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>6.如權(quán)利要求1所述的抗原決定簇，其中所述人工抗原N-末端-Cys由一個或多個Cit通過間隔子Tn連接，從而產(chǎn)生具有如下通式VI的抗原決定簇7.如權(quán)利要求1所述的抗原決定簇，其中所述人工抗原N-末端-Cys由一個或多個Cit通過間隔子Tn，連接，包括至少一個Cys,/人而所述抗原決定簇具有如下通式VII:9/9D,;fj):,Y、個G,VV、小Gf'、4，ssvii8.如權(quán)利要求1所述的抗原決定簇，其中所述人工抗原與載體分子偶聯(lián)。9.如權(quán)利要求1所述的抗原決定簇，其中所述人工抗原被共價或非共價地固定于固相支持物上。10.如權(quán)利要求1所述的抗原決定簇，其中所述人工抗原被標(biāo)記。11.藥物組合物，其包含藥物可接受的載體中的如權(quán)利要求1所述的肽序列。12.單克隆抗體或多克隆抗血清，其包含特異性結(jié)合權(quán)利要求1所述的二肽序列所呈現(xiàn)的至少一個半抗原部分的抗體。aiE—s\C1D—CICJI.C.AF、，13.用于進(jìn)行RA檢測以測定RA特異性自身抗體的存在的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，所述試劑盒包含a)至少一種具有選自通式III-VII的通式的抗原，其作為捕獲抗原固定于固相支持物；由此將生物樣品中的所述自身抗體與所述捕獲抗原接觸并將標(biāo)記的抗人IgG與由所述捕獲抗原連接的所述自身抗體進(jìn)行孵育，從而測定所述自身抗體的存在，其中確定了RA的診斷和嚴(yán)重性。14.用于測定RA特異性自身抗體的存在的夾心ELISA試劑盒，其包含a)結(jié)合至少一種選自通式I-VII的抗原的單克隆或多克隆抗體，其作為捕獲抗體固定于固相支持物；由此將生物樣品中的所述自身抗體作為報道抗體與由捕獲抗體連4妄的所述抗原反應(yīng)，然后將標(biāo)記的抗人IgG與由所述報道抗體、所述抗原和所述捕獲抗體形成的所述夾心進(jìn)行孵育，從而檢測RA并且所述報道抗體的劑量變化確定了RA的嚴(yán)重性。全文摘要本發(fā)明公開了具有通式(III)的二肽抗原決定簇，其中通過肽鍵連接半抗原Cit和Cys殘基；其中A為-NH₂，B為-O-，D為-NH-，F(xiàn)為-NHCO-或-NR-，其中R為氫或酰基，G為-CONH-或-COOR，其中R為烷基，E為(CH2)_n’，其中n’為1至6的整數(shù)，S為-SH或當(dāng)Cys的自由巰基(SH)通過二硫鍵與另一Cys交聯(lián)時，S為-SS-。所述抗原決定簇靈敏且特異地與存在于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者的血清中的自身抗體反應(yīng)，這可用于診斷或治療RA。文檔編號G01N33/564GK101687908SQ200880021552公開日2010年3月31日申請日期2008年6月23日優(yōu)先權(quán)日2007年6月25日發(fā)明者徐義俊申請人:徐義俊