專利名稱：：作為診斷標(biāo)記物的外來體相關(guān)微rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請公開的主題涉及對癌癥和不利妊娠結(jié)果診斷和預(yù)后的方法。具體而言，本申請公開的主題涉及這樣的診斷和預(yù)后方法，即這種方法是基于在來自一個受試者的生物樣品中確定與癌癥或不利妊娠結(jié)果相關(guān)的一種或多種源自外來體(exosome)的微RNA(microRNA)的量。
背景技術(shù)：
：對適合于癌癥的早期檢測和診斷的癌癥生物標(biāo)記物的鑒定為改善受試者的臨床結(jié)果提供了很大的希望。對于呈現(xiàn)模糊癥狀或無癥狀的受試者或者對于具有相對難以進(jìn)行物理檢查的腫瘤的受試者，這一點(diǎn)尤其重要。雖然有很多嘗試針對于早期檢測，但是仍幾乎沒有開發(fā)出能在早期階段診斷癌癥的可靠且低成本的篩查試驗(yàn)。例如，在全世界女性中，卵巢癌仍是第六大常見癌癥，每年造成大約125，000例死亡(Sankaranarayanan&Ferlay，2006)。大多數(shù)患卵巢癌的女性在晚期被診斷，有75%被診斷為卵巢外疾病(Bereketal.，2003)。與女性相關(guān)的其他癌癥相比，73%的子宮內(nèi)膜癌、55%的乳腺癌和50%的宮頸癌被診斷為I期疾病(Menon&Jacobs,2000)。雖然患I期卵巢癌的患者的5年存活率超過90%，但僅21%的晚期卵巢癌患者在初次診斷后存活5年(Bereketal.，2003)。由于在過去的幾十年中長期存活沒有顯著地變化，對于進(jìn)一步提高卵巢癌的存活率的最大希望在于早期診斷(Menon&Jacobs,2000)。現(xiàn)在經(jīng)核準(zhǔn)用于卵巢癌檢測的唯一生物標(biāo)記物是CA125,并且從1983年將它引入后，通過ELISA對它定量一直是卵巢癌檢測的"黃金標(biāo)準(zhǔn)"。CA125的評估通常被用于疾病管理中，用于疾病檢測以及監(jiān)測疾病的復(fù)發(fā)；然而，CA125的使用被局限于早期階段的癌癥檢測(敏感性為50-60%)。CA125定量僅被核準(zhǔn)用于并且一貫被證實(shí)用于減輕的監(jiān)測。CA125對于新生(denovo)卵巢癌檢測既不敏感也不特異，這是因?yàn)樗m在>50%的患I期疾病的女性中升高，但它在超過80%的患晚期卵巢癌的患者中升高。CA125的特異性很差，這表現(xiàn)為它的升高與良性和惡性的乳房和結(jié)腸疾病、腹膜剌激和良性婦產(chǎn)科疾病等有關(guān)。通過顯著簡化預(yù)分析樣品的分離并通過與質(zhì)譜(MS)偶聯(lián)而促進(jìn)蛋白組學(xué)分析的新策略已被引入用于生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)的研究。表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-T0F-MS)已受到很多關(guān)注，原因是它通過與生物化學(xué)不同的蛋白質(zhì)芯片陣列結(jié)合用于解析生物標(biāo)本中的蛋白質(zhì)。在一項(xiàng)技術(shù)中，通過ELISA檢查了4種血清蛋白質(zhì)，而另一項(xiàng)技術(shù)使用患者血清中的7種具體血清組分或總體肽模式的質(zhì)譜來確定癌癥的存在。SELDI-T0F-MS作譜已被成功地用于從對照區(qū)分卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌。在區(qū)分患卵巢癌的患者與患良性卵巢疾病的患者、健康對照方面，血清的SELDI-TOF-MS作譜已表現(xiàn)出顯著好于現(xiàn)用的標(biāo)準(zhǔn)血清標(biāo)記物CA125。研究已表明，對由SELDI-TOF-MS解析的多種蛋白質(zhì)的結(jié)合物進(jìn)行選擇有可能作為一種診斷方法。用于卵巢癌的有效篩選測試需要達(dá)到高敏感性和特異性，并且現(xiàn)行用于分辨峰的不同蛋白組學(xué)技術(shù)以及計(jì)算分析工具會生成不同的結(jié)果。這些對SELDI-TOF-MS作譜探索的初步研究是有希望的，并且該觀念在一系列不同背景中是可重復(fù)的；然而，將該方法轉(zhuǎn)變成為常規(guī)診斷試驗(yàn)仍很困難。據(jù)計(jì)算，要成為一個有效的篩選試驗(yàn)，一個測試需要達(dá)到最低99.6%的特異性。為了達(dá)到該特異性水平，需要將腫瘤性狀的多個組分整合至新的診斷試驗(yàn)中用于有效檢測，這是因?yàn)槁殉舶┮约捌渌┌Y的多因素特性。質(zhì)譜技術(shù)的一個缺點(diǎn)是，一些重要的樣品不但在譜測定的結(jié)果分析中而且在MS中被豐度更大的蛋白質(zhì)掩蓋。通過多種技術(shù)的預(yù)純化可除去具體的蛋白質(zhì)群，所述技術(shù)例如高效液相色譜以及通過親和結(jié)合的陽性選擇或陰性選擇。在大多數(shù)現(xiàn)行的質(zhì)譜方法中的最大困難是動態(tài)范圍，而不是敏感性。雖然除去高豐度的蛋白質(zhì)或肽可大大提高從具體樣品可獲得的信息含量，但是高豐度的蛋白質(zhì)例如白蛋白可作為診斷重要的蛋白質(zhì)亞類的載體。在考慮將該平臺應(yīng)用于篩選卵巢癌之前，需要另外的具有更大樣本量以及獨(dú)立、細(xì)致的盲法驗(yàn)證的研究，或者應(yīng)該考慮任何其他的指標(biāo)。因此，一直需要開發(fā)在幾乎所有癌癥和其他障礙(包括升高的不利妊娠結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn))中改良的生物標(biāo)記物。基于血液的測定仍然是一個有吸引力的目標(biāo)，這是由于樣品采集的可用性和便利。癌癥和不利妊娠結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)升高的早期確診將有利于對患者更及時和可能更有效的治療。由此，仍存在尚未滿足的對這樣的新生物標(biāo)記物的需求，即該生物標(biāo)記物單獨(dú)或與其他生物標(biāo)記物或診斷方式結(jié)合，可提供癌癥和不利妊娠結(jié)果的早期診斷和預(yù)后所需的敏感性和特異性。具體而言，需要在容易獲取的生物液體上進(jìn)行對癌癥生物標(biāo)記物和不利妊娠結(jié)果的簡單試驗(yàn)。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明內(nèi)容部分列出了本申請公開的主題的數(shù)個實(shí)施方案，并且在許多情況中列出了這些實(shí)施方案的調(diào)整方案及變化方案。該
發(fā)明內(nèi)容部分純粹是數(shù)目眾多不同實(shí)施方案的示例。提及一個給定實(shí)施方案的一個或多個代表性特征時同樣也是示例。這樣的實(shí)施方案一般可以以具有或不具有所提及的一種或多種特征而存在；同樣，這些特征可適用于本申請公開的主題的其他實(shí)施方案，而不管其是否在該
發(fā)明內(nèi)容部分中列出。為了避免過度重復(fù)，該
發(fā)明內(nèi)容部分不再列出或顯示這些特征的所有可能的組合。在本申請公開的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于在受試者中診斷癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來自一個受試者的一個生物樣品；從所述生物樣品分離源自癌癥且包含微RNA(miRNA)的外來體；確定一種或多種所述miRNA的量；以及將所述一種或多種miRNA的量與一種或多種miRNA對照的水平比較。如果所述源自癌癥的外來體的所述一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平相比有可測量的差異，那么所述受試者被診斷為患所述癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括基于所確定的所述一種或多種miRNA的量為所述癌癥選擇一種療法或改變一種療法。在本申請公開的主題的另一些實(shí)施方案中，提供了一種用于評估受試者中癌癥治療效果和/或癌癥進(jìn)展的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來自一個受試者在一段時間內(nèi)的一系列生物樣品；從所述系列生物樣品分離源自癌癥且包含miRNA的外來體；確定所述系列生物樣品的每一個生物樣品中一種或多種所述miRNA的量；以及確定所述系列生物樣品的每一個生物樣品中所述一種或多種miRNA的任何可測量的量變化，從而在評估受試者中癌癥治療效果和/或癌癥進(jìn)展。還在本申請公開的主題的另一些實(shí)施方案中，提供了一種用于在受試者中表征癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來自一個受試者的一個生物樣品；從所述生物樣品分離源自癌癥且包含miRNA的外來體；確定一種或多種所述miRNA的量；以及將所述一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平比較。然后，基于所述源自癌癥的外來體的一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平相比的可測量差異，表征所述癌癥。在一些實(shí)施方案中，表征所述癌癥包括確定所述癌癥的類型、等級和/或階段。而且，在一些實(shí)施方案中，確定所述一種或多種miRNA的量包括確定源自所述腫瘤的外來體中所述miRNA的總量。在這些方法的一些實(shí)施方案中，所述癌癥為一種選自卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤和胰腺癌的癌癥。而且，在這些方法的一些中，分離所述源自癌癥的外來體進(jìn)一步包括使用分子排阻色譜來分離所述源自癌癥的外來體。在一些實(shí)施方案中，分離所述源自癌癥的外來體包括離心包含所述源自癌癥的外來體的色譜流分。在一些實(shí)施方案中，所述色譜流分可為外水體積流分。而且，還在一些實(shí)施方案中，使用一種抗癌癥抗原的抗體(例如抗上皮細(xì)胞粘附分子(抗EpCAM)抗體)，通過免疫吸附捕獲使非源自癌癥的外來體與所述源自癌癥的外來體分離開。在這些方法的一些中，確定所述一種或多種miRNA的量包括標(biāo)記所述一種或多種miRNA，在一些實(shí)施方案中，然后以各自選擇性結(jié)合所述一種或多種miRNA的一種或多種多核苷酸探針捕獲所述一種或多種miRNA。在這些方法的其他實(shí)施方案中，確定所述一種或多種miRNA的量包括使用實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)，以定量測定所述一種或多種miRNA的量。而且，在這些方法的一些實(shí)施方案中，所述miRNA為表2中列出的一種或多種miRNA，包括例如一禾中或多禾中選自miR_21、miR_141、miR—200a、miR—200b、miR—200c、miR_203、miR_205禾口miR_214的miRNA。還在本申請公開的主題的另一些實(shí)施方案中，提供了一種用于在受試者中診斷不利妊娠結(jié)果的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來自一個受試者的一個生物樣品；從所述生物樣品分離包含miRNA的外來體；確定一種或多種所述miRNA的量；以及將所述一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平比較。如果來自所述外來體的一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平相比有可測量的差異，那么所述受試者被診斷具有所述不利妊娠結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，所述不利妊娠結(jié)果為一種選自胎膜早破、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失的障礙。在本文公開的一些實(shí)施方案中，所述受試者為人。而且，在本文公開的一些實(shí)施方案中，所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、囊內(nèi)液、胸膜液、腹膜液、腦脊液、淚液、尿液、唾液、痰液或它們的結(jié)合物。8因此，本申請公開的主題的一個目標(biāo)是利用外來體相關(guān)的miRNA作為診斷標(biāo)記物。通過本申請公開的主題完全地或部分地實(shí)現(xiàn)了該目標(biāo)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在研讀以下的對本申請公開的主題的說明、附圖和非限制性的實(shí)施例后，上文已述的本申請公開的主題的目標(biāo)(可通過本申請公開的主題完全地或部分地實(shí)現(xiàn))、其他目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)對于他們來說將是顯而易見的。圖1的示意圖顯示的示例性方法用于通過色譜分離源自癌癥的外來體及來自所述外來體的miRNA，通過微陣列確定所述miRNA的量，以及分析所述數(shù)據(jù)以確定所測受試者中是否存在癌癥。圖2的示意圖顯示的示例性方法用于分離源自癌癥的外來體及來自所述外來體的miRNA，通過實(shí)時PCR確定所述miRNA的量，以及分析所述數(shù)據(jù)以確定所測受試者中是否存在癌癥及癌癥的階段。圖3A的圖表顯示了循環(huán)系統(tǒng)中源自腫瘤的外來體的水平與卵巢癌的階段比較。外來體分離自從年齡匹配的女性對照(n=10)、年齡匹配的患良性卵巢疾病的女性(n=10)和被診斷為卵巢癌的女性(I-IV期各n二10)的血清。外來體的水平表示為蛋白質(zhì)濃度。圖3B是通過磁珠分離的循環(huán)系統(tǒng)外來體的電子顯微照片。切超薄切片(65nm)，并以乙酸雙氧鈾(uranylacetate)和Reynold檸檬酸鉛染色。用Jeol1210透射電子顯微鏡檢查所述切片。圖4A的圖表顯示與來自卵巢癌患者的循環(huán)系統(tǒng)EpCAM-陽性的外來體相關(guān)的小RNA的存在。顯示了使用Agilent2100Bioanalyzer對從腫瘤外來體分離的RNA的代表性分析。圖4B的照片為來自循環(huán)系統(tǒng)外來體和相應(yīng)腫瘤的總RNA的瓊脂糖凝膠(1%)分離。這種總RNA被用作miRNA作譜的起始材料。圖5的系列圖表顯示源自晚期卵巢腫瘤(□)或從同樣這些患者的血清分離的EpCAM-陽性的外來體(■)的具體miRNA的強(qiáng)度。已證明miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205和miR-214為上調(diào)的卵巢癌標(biāo)記物。每個棒代表雙份樣品的平均強(qiáng)度，顯示了4個代表性患者的結(jié)果。圖6的圖表顯示了源自從患良性卵巢疾病的患者和患卵巢癌的患者的外周血(2.5mL)分離的EpCAM-陽性的外來體的具體miRNA的強(qiáng)度?；悸殉舶┑幕颊弑粎^(qū)分為I期、11期和III期。棒代表每組患者(每組均n=10)的歸一化強(qiáng)度的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。圖7A和7B的圖表顯示了源自卵巢癌患者血清的具體外來體miRNA的比較，分別在取血后立即；在4t:下保存血清24、48和96小時后(圖7A);或者在-7(rC下保存7_28天后(圖7B)的比較。使用抗EpCAM通過MACS分離腫瘤外來體。圖8的示意圖顯示的示例性方法用于分離源自癌癥的外來體及來自所述外來體的miRNA，通過微陣列確定所述miRNA的量，以及分析所述數(shù)據(jù)以確定所測受試者中是否存在癌癥。圖9的系列圖表顯示源自晚期肺腫瘤(淺灰色)或從同樣這些患者的血清分離的EpCAM-陽性的外來體(深灰色)的具體miRNA的強(qiáng)度。每個棒代表雙份樣品的平均強(qiáng)度，顯示了4個代表性患者的結(jié)果。具體實(shí)施例方式在如下附隨的說明中將詳細(xì)地給出本申請公開的主題的一個或多個實(shí)施方案。通過該說明書、附圖和權(quán)利要求書，本申請公開的主題的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)都通過引用的方式全文納入本文。在出現(xiàn)沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有等同于本申請公開的主題所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。盡管任何類似于或等價于本文所述的方法、設(shè)備和材料均可用于實(shí)施或測試本申請公開的主題，但在此只描述代表性的方法、設(shè)備和材料。按照長期形成的專利法慣例，術(shù)語"一種"、"一個"和"該"在用于本申請(包括權(quán)利要求書)中時是指"一個或多個"。因此，例如提及"一個肽"包括多個這種肽，等等。除非另外指出，否則在本說明書和權(quán)利要求書中使用的表示成分量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字應(yīng)被理解為在所有情況下都被術(shù)語"約"修飾。因此，除非相反指出，否則在本說明書和附隨的權(quán)利要求書中列出的數(shù)值參數(shù)是可依賴于本申請公開的主題意欲獲得的所需性質(zhì)而變化的近似值。在提及質(zhì)量、重量、時間、體積、濃度或百分率的值或量的時候，本文使用的術(shù)語"約"的意思是涵蓋偏離所述指定量如下區(qū)間以內(nèi)的變化范圍，即在一些實(shí)施方案中為±20%，在一些實(shí)施方案中為±10%，在一些實(shí)施方案中為±5%，在一些實(shí)施方案中為±1%，在一些實(shí)施方案中為±0.5%，以及在一些實(shí)施方案中為±0.1%，只要這樣的變化適合于實(shí)施本申請公開的方法。經(jīng)過過去的5年，表達(dá)作譜技術(shù)已鑒定了新的具有診斷應(yīng)用的生物標(biāo)記物。一組這種生物標(biāo)記物為一類的小非編碼RNA，被稱作微RNA(miRNA)(Iorioetal.2007;DeCeccoetal.，2004;Calin&Croce，2006)。通過與耙mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，微RNA-小(長度22-25個核苷酸)非編碼RNA——可抑制它們的翻譯(Esquela-Kerscher&Slack，2006;Bartel，2004)。通過切割同源的mRNA或者通過特異性抑制蛋白質(zhì)合成，可發(fā)生miRNA對靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。通過miRNA作譜分析的所有腫瘤與來自相同組織的正常細(xì)胞相比都表現(xiàn)出了顯著不同的miRNA標(biāo)志(Iorioetal.2007;Calin&Croce，2006a;Calin&Croce，2006b)。Luetal.(2005)進(jìn)行了白血病和實(shí)體癌的分析，并且確定了miRNA表達(dá)譜可通過發(fā)展譜系和分化狀態(tài)對人癌癥分類。個體miRNA和特定miRNA標(biāo)志的表達(dá)已與許多的人癌癥的診斷和預(yù)后聯(lián)系起來。Iorioetal.(2007)使用組織標(biāo)本證明了，與正常卵巢相比，特定miRNA在卵巢癌中是異常表達(dá)的，最顯著地過量表達(dá)的有miR-141、miR-200a、miR-200b和miR-200c。他們進(jìn)一步證明了，在卵巢腫瘤中的低甲基化導(dǎo)致了與正常卵巢相比miR-21、miR-203和miR-205的上調(diào)。這些上調(diào)miRNA中的兩個——miR-200a和miR-200c——在所有這三種檢查的組織類型(漿液細(xì)胞、子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞和透明細(xì)胞)中都升高，而miR-200b和miR-141在子宮內(nèi)膜樣和漿液組織類型中都上調(diào)。通常，將卵巢癌的不同組織類型(漿液細(xì)胞、子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞、透明細(xì)胞和它們的混合物)與所述正常組織比較獲得的miRNA標(biāo)志在大多數(shù)情況下是重疊的。他們對卵巢腫瘤的分析還證明了不存在與腫瘤階段或等級相關(guān)的差異表達(dá)miRNA，這可能是由于他們的樣品集主要源自晚期腫瘤的原因。在最顯著上調(diào)的miRNA中，miR-200a和miR-141屬于相同的家族，miR-200b位于染色體lp36.33，與miR-200a在同一區(qū)域；miR-200c位于染色體12pl3.31，與miR-141在同一區(qū)域(Iorioetal.(2007))。這種關(guān)聯(lián)與Zhang等人(2006)的結(jié)果相符，后者提出特定miRNA的上調(diào)可能是所述miRNA基因的擴(kuò)增。使用基于高分辨率陣列的比較基因組雜交，異常高比例的包含miRNA基因的位點(diǎn)呈現(xiàn)DNA拷貝數(shù)的改變。在卵巢癌中，37.1%的包含miRNA基因的基因組位點(diǎn)與DNA拷貝數(shù)的改變有關(guān)(Zhangetal.，2006)。在乳腺癌和黑色素瘤中，甚至更大比例的這些位點(diǎn)呈現(xiàn)出改變的DNA拷貝數(shù)變化(分別72.8%和85.9%)(Zhangetal.，2006)。結(jié)果是，miRNA表達(dá)模式或標(biāo)志似乎比mRNA表達(dá)模式更能表征腫瘤的發(fā)生的源，并且可關(guān)聯(lián)于診斷、確定階段、進(jìn)展、預(yù)后和對療法的響應(yīng)。然而，在本申請公開的主題之前，對miRNA標(biāo)志的分析作為癌癥的診斷工具局限在活組織檢查。最近描述的癌細(xì)胞的特征是它們釋放或脫落質(zhì)膜的完整小胞部分(在本文中稱為"外來體"，并且在現(xiàn)有技術(shù)中也被稱作膜碎片、膜小泡或微泡)的能力。本文公開的數(shù)據(jù)首次意外地鑒定出了與起源自癌細(xì)胞的外來體(即"源自癌癥的外來體")相關(guān)的miRNA。本申請公開的主題進(jìn)一步首次公開了，從源自癌癥的外來體分離的miRNA在患有癌癥的受試者中呈現(xiàn)的表達(dá)水平不同于(例如升高或降低)在無癌癥的受試者中測量的miRNA表達(dá)水平(本文中被稱作"miRNA對照水平")。而且，本申請公開的主題提供了從容易獲得的測試受試者的生物液體對源自癌癥的外來體的分離。由此，本申請公開的主題第一次提供了這樣的癌癥診斷和預(yù)后的方法，即這種方法基于采集并測量來自容易獲取的生物樣品的且源自癌癥的外來體miRNA水平，無需直接對癌細(xì)胞取樣。"外來體"是從各種不同細(xì)胞包括從癌細(xì)胞分泌的微泡(即"源自癌癥的外來體")。這些小泡(直徑50-100nm)源自大的多泡內(nèi)體，并被分泌至細(xì)胞外環(huán)境中。外來體釋放/脫落的確切機(jī)制仍不清楚；然而，這種釋放是需要能量的現(xiàn)象，受細(xì)胞外信號的調(diào)節(jié)。它們的形成似乎是通過內(nèi)陷及從晚期內(nèi)體的限制膜芽出，形成包含胞質(zhì)溶膠并且在其表面暴露膜結(jié)合的細(xì)胞蛋白質(zhì)的細(xì)胞外域的小泡。使用電子顯微鏡的研究已顯示多泡內(nèi)體與質(zhì)膜的融合譜，引起內(nèi)部小泡向細(xì)胞外環(huán)境的分泌。外來體釋放的速率在大多數(shù)新生物細(xì)胞中顯著增大，并持續(xù)地發(fā)生。外來體釋放的增加和它們的聚積似乎在惡性轉(zhuǎn)化過程中是重要的。除了癌細(xì)胞之外，外來體的釋放也被證明與胚胎源(例如胎盤)的細(xì)胞和激活的淋巴樣細(xì)胞有關(guān)。雖然在特定生理?xiàng)l件下，外來體的細(xì)胞外脫落也出現(xiàn)于其他類型的細(xì)胞中，但來自非新生物細(xì)胞的外來體的聚積很少在體內(nèi)觀察到。相反，由腫瘤細(xì)胞釋放的外來體會在生物液體中聚積，所述生物液體包括血漿液、腹水和胸膜液。外來體的釋放及其聚積似乎是惡性轉(zhuǎn)化的重要特征。脫落的源自癌癥的外來體不反映原始腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜一般組成，而代表具有增強(qiáng)的腫瘤抗原表達(dá)的"微地圖"。外來體的釋放似乎是細(xì)胞通訊的一個重要特征。由于釋放的外來體表達(dá)具有生物活性的分子(例如Fas配體、PD-l、MICA/B、mdrl、匪P、CD44和自身反應(yīng)性抗原)，已在多個模型中分析了這些微泡調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞功能的能力。已建立了這樣的理論，即這些釋放的外來體通過模擬"激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡"(AICD)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能。淋巴樣細(xì)胞似乎在激活后分泌外來體，并且這些淋巴樣細(xì)胞似乎通過防止過度的免疫應(yīng)答和自身免疫的形成在免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用。已有這樣的假說，即腫瘤細(xì)胞的外來體釋放是胎細(xì)胞外來體的再表達(dá)并且二者組成通路，以繞過免疫監(jiān)視。微RNA是天然存在的小非編碼RNA，其生物活性形式的長度為約17-約25個核苷酸堿基(nt)。通過抑制靶mRNA翻譯，miRNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA被認(rèn)為作為負(fù)調(diào)節(jié)因子發(fā)揮功能，即更大量的特異性miRNA與較低水平的靶基因表達(dá)相關(guān)。體內(nèi)存在3種類型的miRNA:原始miRNA(pri-miRNA)、成熟前miRNA(pre-miRNA)和成熟miRNA。原始miRNA(pri-miRNA)被表達(dá)為約數(shù)百堿基至lkb以上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物。該轉(zhuǎn)錄物pri-miRNA在核內(nèi)被稱為Drosha的RNaseII內(nèi)切核酸酶切割，該酶切割在莖環(huán)基部附近的莖的兩條鏈。Drosha將RNA雙鏈體切割為交錯切口，余出一個5'磷酸和3'端的2nt突出。所述切割產(chǎn)物——成熟前miRNA(pre-miRNA)——長約60-約llOnt，具有一個以折回方式形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Pre-miRNA被Ran-GTP和Exportin_5從核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。Pre-miRNA在細(xì)胞質(zhì)中被另一種叫作Dicer的RNaseII內(nèi)切核酸酶進(jìn)一步加工。Dicer可識別5'磷酸和3'突出，并且在莖環(huán)交匯處將環(huán)切離，以形成miRNA雙鏈體。該miRNA雙鏈體與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)結(jié)合，在此反義鏈優(yōu)先被降解，并且有義鏈的成熟miRNA，將RISC指導(dǎo)至其靶點(diǎn)。成熟miRNA是miRNA的生物活性形式，長度約17-約25nt。微RNA通過與其耙基因信使(mRNA)的特異性序列進(jìn)行堿基配對(完全匹配或不完全匹配)發(fā)揮功能。該miRNA降解所述mRNA或抑制所述mRNA的翻譯，引起所述耙基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后的下調(diào)、抑制或沉默。在動物中，miRNA不必與它們的靶點(diǎn)完全同源，并且部分同源可導(dǎo)致翻譯的抑制，而在植物中的情況是miRNA傾向于表現(xiàn)出與靶點(diǎn)完全同源，降解信使(mRNA)的情況比較普遍。微RNA廣泛分布于基因組中，控制基因調(diào)節(jié)并積極地參與至多種生理或病理過程中。例如，某些miRNA的調(diào)節(jié)形式是控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡；并且異常miRNA譜與腫瘤發(fā)生有關(guān)。另外，已表明，病毒感染可引起靶向沉默"原始細(xì)胞(pro-cell)存活"基因的miRNA的升高以及抑制與凋亡(程序性細(xì)胞死亡)有關(guān)基因的miRNA的降低，從而使得向增大凋亡信號傳遞方向傾斜。數(shù)千種mRNA處于迄今為止鑒定的數(shù)百miRNA種類的這種選擇壓力下。這種選擇過程的作用是消弱例如可能不再被需要來使細(xì)胞將其生理程序?qū)蛐碌幕虮磉_(dá)通路的特定組的基因表達(dá)。對靶組的miRNA依賴性基因表達(dá)消弱是使細(xì)胞離開原來的程序并轉(zhuǎn)換成新的程序的一種強(qiáng)大且快速的調(diào)節(jié)。這一點(diǎn)的典型示例在胚胎發(fā)育過程中被證明，在該過程中一組具體的細(xì)胞被定向形成獨(dú)特的專門細(xì)胞類型，例如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、肌肉等。人們認(rèn)為大概有三分之一的人基因的表達(dá)水平受miRNA調(diào)節(jié)，并且獨(dú)特的基因表達(dá)的miRNA調(diào)節(jié)與每種具體細(xì)胞類型的特異性信號傳遞通路有聯(lián)系。例如，凋亡信號傳遞通路可受這樣的一組miRNA控制，即該組miRNA靶向以使促存活基因信使去穩(wěn)定，使得備用的促凋亡基因處于優(yōu)勢地位并因此激活死亡程序。另一個實(shí)例是對癌癥生長的控制；最近的發(fā)現(xiàn)已表明，miRNA在防止細(xì)胞變成新生物中也是必要的。例如，兩個癌基因——cMyc12和cRas——也被發(fā)現(xiàn)受一類miRNA的控制，該miRNA的表達(dá)在癌癥中是下調(diào)的。換言之，該miRNA的缺乏使得cMyc和cRas的表達(dá)不受控制，從而使這兩個基因變得在癌細(xì)胞中大量存在，使得癌細(xì)胞獲得不受控制的細(xì)胞增殖能力，并起始新生物生長的階段。另外，已報(bào)道，miRNA突變是起源于比利時的綿羊中的肌肉發(fā)達(dá)表型的原因，這表明與遺傳障礙相關(guān)的突變可出現(xiàn)于miRNA中，而在啟動子區(qū)、編碼區(qū)域和剪接位點(diǎn)中沒有出現(xiàn)突變跡象。多個通路的協(xié)調(diào)作用有可能用于控制具體的細(xì)胞狀態(tài)，其中可能涉及某些分子"核心"，它們通過分級的順序和眾多的分子控制發(fā)揮功能。事實(shí)上，數(shù)十種miRNA可通過只抑制它們自身或它們的功能相反物的表達(dá)起作用，以確保這些"核心"在細(xì)胞中可行使主要功能或次要功能。因此，一個基因產(chǎn)物在一個細(xì)胞類型中可作為一個信號傳遞通路的主要"核心"發(fā)揮作用，并且在另一個細(xì)胞類型中，它可以為次要"核心"或者可根本不被使用。然后，微RNA對"核心"基因表達(dá)的控制可為一種方便的機(jī)制以對多種分子提供這種多能性，以將所述多種分子用作不同類型的細(xì)胞作用形式的主要"核心"或次要"核心"或者根本不作為"核心"。鑒于miRNA在基因調(diào)節(jié)以及在許多生理和病理過程中的作用，需要獲得有關(guān)它們的相互作用模型和它們的表達(dá)模式的信息。定量和鑒定哪些組的推定miRNA在一種具體的細(xì)胞類型中起作用或者與目標(biāo)具體過程或病癥有關(guān)的系統(tǒng)或方法可提供這樣的信息，即這些信息可用于理解每種細(xì)胞狀態(tài)怎樣發(fā)展和維持，以及怎樣通過以下方式剌激功能障礙的維持不適宜地降低或增加獨(dú)特組的miRNA以調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的表達(dá)。這些理解在多種障礙(包括癌癥和不利妊娠結(jié)果)的診斷和表征中被證明是有用的。作為潛在的臨床診斷工具，已表明miRNA對許多但非全部癌癥是重要且精確的決定因素。越來越多的證據(jù)顯示miRNA基因的表達(dá)在人癌癥中是不受調(diào)控的。miRNA的表達(dá)是高度組織和發(fā)展階段特異的，并且最近已用于腫瘤的分子分類。迄今為止，所有通過miRNA作譜分析的腫瘤已顯示出與來自同一組織的正常細(xì)胞顯著不同的miRNA譜。流式細(xì)胞術(shù)miRNA作譜證明，miRNA表達(dá)譜可依照腫瘤的發(fā)育譜系和分化狀態(tài)將人癌癥分類。具體的過量表達(dá)和表達(dá)量過低已顯示與具體的腫瘤類型有關(guān)。微RNA過量表達(dá)可引起腫瘤抑制基因的下調(diào)，而它們的表達(dá)量過低可導(dǎo)致癌基因上調(diào)。使用大規(guī)模微陣列分析，癌細(xì)胞顯示了不同于正常細(xì)胞的miRNA譜，與正常細(xì)胞相比，在癌細(xì)胞中228種miRNA基因的36種過量表達(dá)，21種下調(diào)。層次聚類分析顯示，該miRNA標(biāo)志能夠使得腫瘤樣品以它們的組織來源為基礎(chǔ)分組。基因組水平的作譜研究已在多種癌癥類型上進(jìn)行，包括CLL、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和內(nèi)分泌胰腺腫瘤。在對104匹配對的原發(fā)癌和非癌卵巢組織的研究中，出現(xiàn)了43種差異表達(dá)的miRNA;在腫瘤中28種被下調(diào)，15種過量表達(dá)。以兩種不同方法獲得的微陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，來自6種實(shí)體瘤(卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌和內(nèi)分泌胰腺腫瘤)的微陣列的顯著性分析(SAM)和微陣列的預(yù)測分析(PAM)表明了一種這樣的共同標(biāo)志，即該標(biāo)志由在至少三個腫瘤類型中差異表達(dá)的21種miRNA組成。處于該列表頂部是miR-21以及miR-17-5p和miR-191，前一種在6種類型的癌細(xì)胞中過量表達(dá)，后兩種在5種中過量表達(dá)。由于所分析腫瘤的胚胎源是不同的，這些結(jié)果的重要意義可能在于這些共同miRNA參與在許多類型的腫瘤中改變的基本信號傳遞通路。以下的發(fā)現(xiàn)支持了這些基因在腫瘤發(fā)生中的功能，該發(fā)現(xiàn)即對所述差異表達(dá)的miRNA的推定靶顯著地集中在那些靶向已知的腫瘤抑制基因和癌基因的基因。再者，miR-21——在所有6種類型的癌癥中唯一過量表達(dá)的miRNA發(fā)現(xiàn)直接耙向腫瘤抑制基因PTEN，該基因編碼一種抑制生長和/或存活通路的磷酸酶。PTEN的功能在多種類型的晚期腫瘤(包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌)中有變化。在本申請公開的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于在受試者中診斷癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來自一個受試者的一個生物樣品；從所述生物樣品分離源自癌癥且包含miRNA的外來體；確定一種或多種所述miRNA的量；以及將所述一種或多種miRNA的量與一種或多種miRNA對照的水平比較。如果所述樣品中所述源自癌癥的外來體的一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平相比有可測量的差異，那么所述受試者被診斷為患所述癌癥?？蓽y量的示例性miRNA的非限制性列表在表l和2中提供。在一些實(shí)施方案中，所測量的miRNA選自表2中列出的miRNA，并且在一些具體的實(shí)施方案中，所測量的miRNA選自miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205和miR_214。本文使用的術(shù)語"癌癥"是指動物中出現(xiàn)的所有類型的癌癥、新生物或惡性腫瘤，包括白血病、癌(carcinoma)和肉瘤。癌癥的實(shí)例有腦癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌和子宮癌。"白血病"廣義上包括造血器官的進(jìn)行性惡性疾病，其特征通常在于血液和骨髓中的白細(xì)胞及其前體異常的增殖及發(fā)育。白血病包括，例如急性非淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、成人T細(xì)胞性白血病、非白血性白血病(aleukemicleukemia)、非白血球性白血病(aleukocythemicleukemia)、嗜堿性白血病(basophylicleukemia)、母細(xì)胞性白血病、牛白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、皮膚白血病、胚胎白血病(embryonalleukemia)、嗜酸性白血病(eosinophilicleukemia)、格羅斯白血病(Gross'leukemia)、毛細(xì)胞性白血病、成血性白血病(hemoblasticleukemia)、成血細(xì)胞性白血病(hemocytoblasticleukemia)、組織細(xì)胞性白血病、干細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、白細(xì)胞減少性白血病、淋巴白血病(lymphaticleukemia)、成淋巴細(xì)胞性白血病(lymphoblasticleukemia)、淋巴細(xì)胞性白血病、成淋巴性白血病(lymphogenousleukemia)、淋巴樣白血病(lymphoidleukemia)、淋巴肉瘤細(xì)胞性白血病、肥大細(xì)胞性白血病、巨核細(xì)胞性白血病、小成髓細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性白血病、成髓性白血病(myeloblastsleukemia)、髓細(xì)胞性白血病、髓樣粒細(xì)胞性白血病(myeloidgra皿locyticleukemia)、髓單核細(xì)胞性白血病(myelomonocyticleukemia)、Naegeli白血病、獎細(xì)胞性白血病(plasmacellleukemia)、漿細(xì)胞性白血病(plasmacyticleukemia)、早幼粒細(xì)胞性白血病、李德爾細(xì)胞性白血病(Riedercellleukemia)、希林氏白血病(Schilling'sleukemia)、干細(xì)胞性白血病、亞白血性白血病和未分化細(xì)胞性白血病。術(shù)語"癌"是指由傾向于浸潤周圍組織并發(fā)生轉(zhuǎn)移的上皮細(xì)胞組成的惡性新生物。示例性的癌包括，例如腺泡癌(acinarcarcinoma)、腺泡癌(acinouscarcinoma)、腺囊性癌(adenocysticcarcinoma)、腺樣囊性癌(adenoidcysticcarcinoma)、腺癌(carcinomaadenomatos咖)、腎上腺皮質(zhì)癌、肺泡癌、肺泡細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌14(basalcellcarcinoma)、基底細(xì)胞癌(carcinomabasocellulare)、基底細(xì)胞樣癌(basaloidcarcinoma)、基底麟狀細(xì)胞癌(basosquamouscellcarcinoma)、細(xì)支氣管月市泡癌(bronchioalveolarcarcinoma)、支氣管癌(bronchiolarcarcinoma)、支氣管源性癌(bronchogeniccarcinoma)、腦樣癌(cerebriformcarcinoma)、月干內(nèi)膽管細(xì)胞癌(cholangiocellularcarcinoma)、絨毛膜癌(chorioniccarcinoma)、膠樣癌(colloidcarcinoma)、粉朿[J癌(comedocarcinoma)、子宮體癌(corpuscarcinoma)、篩狀癌(cribriformcarcinoma)、胸廓癌(carcinomaencuirasse)、皮膚癌(carcinomacutaneum)、柱狀細(xì)胞癌(cylindricalcarcinoma)、柱狀細(xì)胞癌(cylindricalcellcarcinoma)、導(dǎo)管癌、硬癌(carcinomadurum)、胚月臺性癌(embryonalcarcinoma)、髓樣癌(encephaloidcarcinoma)、印ie皿oid癌(印ie皿oidcarcinoma)、腺樣上皮癌(carcinomaepithelialeadenoides)、夕卜植癌(exophyticcarcinoma)、饋嫁性癌(carcinomaexulcere)、硬癌(carcinomafibrosum)、膠狀癌(gelatiniformcarcinoma)、膠樣癌(gelatinouscarcinoma)、巨大細(xì)胞癌(giantcellcarcinoma)、巨細(xì)胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌(glandularcarcinoma)、顆粒細(xì)胞癌、毛母質(zhì)癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌(hematoidcarcinoma)、月干細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma)、大嗜酸細(xì)胞癌(Hurthlecellcarcinoma)、透明質(zhì)癌(hyalinecarcinoma)、hypemephroid癌(hypemephroidcarcinoma)、幼稚型胚月臺性癌(infantileembryonalcarcinoma)、原位癌、表皮內(nèi)癌(intraepidermalcarcinoma)、上皮內(nèi)癌(intraepithelialcarcinoma)、克龍派切爾癌(Krompecher'scarcinoma)、Kulchitzky細(xì)胞癌(Kulchitzky-cellcarcinoma)、大細(xì)胞癌(large-cellcarcinoma)、豆?fàn)畎?lenticularcarcinoma)、月旨瘤癌(lipomatouscarcinoma)、淋巴上皮癌(lymphoepithelialcarcinoma)、髓樣癌(carcinomamedullare)、髓樣癌(medullarycarcinoma)、黑色素癌(melanoticcarcinoma)、軟癌(carcinomamolle)、粘液癌(mucinouscarcinoma)、粘液癌(carcinomamuciparum)、粘液細(xì)胞癌(carcinomamucocellulare)、粘液表皮樣癌(mucoepidermoidcarcinoma)、粘液癌(carcinomamucosum)、粘液癌(mucouscarcinoma)、粘液瘤樣癌(carcinomamyxomatodes)、鼻口因癌(naspharyngealcarcinoma)、燕麥細(xì)胞癌(oatcellcarcinoma)、骨化性癌(carcinomaossificans)、類骨質(zhì)癌(osteoidcarcinoma)、乳頭狀癌(papillarycarcinoma)、門脈周癌(periportalcarcinoma)、原位癌(preinvasivecarcinoma)、棘細(xì)胞癌(pricklecellcarcinoma)、軟糊狀癌(pultaceouscarcinoma)、腎的腎細(xì)胞癌(renalcellcarcinomaofkidney)、儲備細(xì)胞癌(reservecellcarcinoma)、肉瘤樣癌(carcinomasarcomatodes)、施奈德癌(schneideriancarcinoma)、硬癌(scirrhouscarcinoma)、陰囊癌(carcinomascroti)、印戒細(xì)胞癌(signet-ringcellcarcinoma)、單純癌(carcinomasimplex)、小細(xì)胞癌(small-cellcarcinoma)、硬癌(solanoidcarcinoma)、球狀細(xì)胞癌(spheroidalcellcarcinoma)、梭形細(xì)胞癌(spindlecellcarcinoma)、髓樣癌(carcinomaspongiosum)、麟癌(squamouscarcinoma)、麟狀細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma)、繩捆癌(stringcarcinoma)、血管擴(kuò)張性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管擴(kuò)張性癌(carcinomatelangiectodes)、移行細(xì)胞癌(transitionalcellcarcinoma)、結(jié)節(jié)性皮癌(carcinomatuberosum)、結(jié)節(jié)性15皮癌(tuberouscarcinoma)、統(tǒng)狀癌(verrucouscarcinoma)禾口絨毛狀癌(carcinomavillosum)。術(shù)語"肉瘤"通常是指這樣的腫瘤，即這種腫瘤由胚胎結(jié)締組織之類的物質(zhì)構(gòu)成，并且通常由鑲嵌于纖維物質(zhì)或同質(zhì)物質(zhì)中緊密壓實(shí)的細(xì)胞組成。肉瘤包括，例如軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤(Abemethy'ssarcoma)、脂肪肉瘤(adiposesarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、腺泡狀軟組織肉瘤(alveolarsoftpartsarcoma)、成禾由細(xì)胞肉瘤、葡萄狀肉瘤(botryoidsarcoma)、綠色瘤肉瘤、續(xù)毛膜癌、胚胎性肉瘤(embryonalsarcoma)、Wilms月中瘤肉瘤(Wilms'tumorsarcoma)、子宮內(nèi)膜肉瘤(endometrialsarcoma)、間質(zhì)肉瘤(stromalsarcoma)、尤因肉瘤(Ewing'ssarcoma)、筋膜肉瘤(fascialsarcoma)、纖維母細(xì)胞肉瘤(fibroblasticsarcoma)、巨細(xì)胞肉瘤(giantcellsarcoma)、茅立細(xì)胞肉瘤(granulocyticsarcoma)、霍奇金肉瘤(Hodgkin'ssarcoma)、特發(fā)性多發(fā)性色素沉著出血性肉瘤(idiopathicmultipl印igmentedhemorrhagicsarcoma)、B細(xì)胞免疫母細(xì)胞肉瘤(imm皿oblasticsarcomaofBcells)、淋巴瘤、T細(xì)胞免疫母細(xì)胞肉瘤(i匪noblasticsarcomaofT-cells)、詹森肉瘤(Jensen'ssarcoma)、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、肝巨噬細(xì)胞肉瘤(Kupffercellsarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、白血病性肉瘤(leukosarcoma)、惡性間口十肉瘤(malignantmesenchymomasarcoma)、骨膜夕卜肉瘤(parostealsarcoma)、網(wǎng)織紅細(xì)胞肉瘤(reticulocyticsarcoma)、勞其j肉瘤(Roussarcoma)、槳液囊性肉瘤(serocysticsarcoma)、滑膜肉瘤和毛細(xì)血管擴(kuò)張性肉瘤(telangiectaticsarcoma)。術(shù)語"黑色素瘤"用以指一種起源于皮膚和其他器官的黑色素細(xì)胞體系的腫瘤。黑色素瘤包括，例如肢端雀斑樣痣黑色素瘤(acral-lentiginousmelanoma)、無黑色素性黑色素瘤(amelanoticmelanoma)、良性幼年黑色素瘤(benignjuvenilemelanoma)、克勞德曼黑色素瘤(Cloudman'smelanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding-Passeymelanoma)、幼年黑色素瘤(juvenilemelanoma)、惡性雀斑樣痣黑色素瘤(lentigomalignamelanoma)、惡性黑色素瘤(malignantmelanoma)、結(jié)節(jié)性黑色素瘤(nodularmelanoma)、甲下黑色素瘤(subungalmelanoma)和淺表擴(kuò)散性黑色素瘤(superficialspreadingmelanoma)。在一些具體實(shí)施方案中，所述癌癥選自卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤和胰腺癌。本文使用的術(shù)語"生物樣品"是指這樣的樣品，即該樣品包括生物分子并且/或者源自于一個受試者。代表性的生物分子包括但不限于總DNA、RNA、miRNA、mRNA和多肽。所述生物樣品可用于檢測與源自癌癥的外來體有關(guān)的目標(biāo)miRNA的存在及/或表達(dá)水平。任何細(xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞碎片或細(xì)胞產(chǎn)物均可與本申請要求的主題的方法一塊使用，但最適宜的是被預(yù)測包含與正常對照相比呈現(xiàn)miRNA差異表達(dá)的且源自癌癥的外來體的生物液體和器官。在一些實(shí)施方案中，所述生物樣品為相對容易獲得的生物樣品，例如血液或其組分。在一些實(shí)施方案中，所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、囊內(nèi)液、胸膜液、腹膜液、腦脊液、淚液、尿液、唾液、痰液或它們的結(jié)合物。在一些實(shí)施方案中，分子排阻色譜可用于分離所述源自癌癥的外來體。見例如圖l和2。分子排阻色譜技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中公知的。示例性的非限制性技術(shù)在本發(fā)明的實(shí)施例中提供。在一些實(shí)施方案中，分離了外水體積流分并且該流分包含目標(biāo)外來體。而且，在一些實(shí)施方案中，在通過(對一個或多個色譜流分的)離心技術(shù)的色譜分離后可進(jìn)一步分離所述源自癌癥的外來體，這是本領(lǐng)域中公知的。在一些實(shí)施方案中，例如，密度梯度離心可用于進(jìn)一步分離所述外來體。而且，在一些實(shí)施方案中，需要進(jìn)一步從其他來源的外來體進(jìn)一步分離所述源自癌癥的分離的外來體。例如，通過使用抗腫瘤抗原的抗體的免疫吸附捕獲，可使非源自癌癥的外來體與所述源自癌癥的外來體分離開。見，例如圖8。示例性抗癌癥抗原的抗體包括但不限于抗上皮細(xì)胞粘附分子(抗EpCAM)抗體，例如本發(fā)明的實(shí)施例中所列對這種抗體的利用。本文使用的術(shù)語"進(jìn)行診斷"和"診斷"是這樣的方法，即本領(lǐng)域技術(shù)人員通過這些方法可估計(jì)乃至確定一個受試者是否患有一種給定的疾病或病癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)常以一種或多種診斷指示物為基礎(chǔ)進(jìn)行診斷，所述指示物例如一種生物標(biāo)記物(例如一種miRNA的表達(dá)水平)，其量(包括存在或不存在)可指示所述病癥的存在、嚴(yán)重性或不存在。除了診斷，臨床癌癥的預(yù)后也是一個很受關(guān)注和注意的方面。為了設(shè)計(jì)最有效的治療，知曉癌細(xì)胞的侵襲力及腫瘤復(fù)發(fā)的可能性很重要。例如，一些癌癥可被多種候選策略處理。在一些情況下使用局部及全身放射療法，而在其他情況下應(yīng)用外科介入和/或化學(xué)療法。現(xiàn)行對個體癌癥受試者的療法決策可基于(1)疾病涉及的淋巴結(jié)的數(shù)目、(2)—種或多種癌癥標(biāo)記物的狀態(tài)、(3)原發(fā)腫瘤的大小和(4)被診斷疾病的階段。然而，即使有這些要素，對所有癌癥受試者的疾病過程的準(zhǔn)確預(yù)測仍是不可能的。如果可進(jìn)行更加準(zhǔn)確的預(yù)后，那么就可以為患者選擇合適的治療，以及在某些情況下更緩和的治療?？蓪⒈疚墓_的源自癌癥的外來體miRNA水平的測量基于以下目的使用，即依照癌癥的進(jìn)展將受益于具體療法的患者分類并將他們與可能更適合其他或另外療法的其他受試者相區(qū)分。由此，在本申請公開的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于在受試者中表征癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來自一個受試者的一個生物樣品；從所述生物樣品分離源自癌癥且包含微RNA(miRNA)的外來體；確定一種或多種所述miRNA的量；以及將所述一種或多種miRNA的量與一種或多種miRNA對照的水平比較。在這種實(shí)施方案中，基于所述源自癌癥的外來體的一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平相比的可測量差異，表征所述癌癥。在一些實(shí)施方案中，表征所述癌癥包括，確定所述癌癥的類型、等級和/或階段。本文使用的"進(jìn)行診斷"或"診斷"還包括，基于對源自癌癥的外來體的診斷性miRNA水平的測量確定預(yù)后(這可提供對進(jìn)行或未進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療的臨床結(jié)果的預(yù)測)、對合適療法的選擇(或療法是否有效)或者對現(xiàn)行療法的監(jiān)測及可能的療法改變。而且，在本申請公開的主題的一些實(shí)施方案中，可以隨時間多次測定一種或多種miRNA的量以有利于癌癥的診斷(包括預(yù)后)、治療效果評估和/或進(jìn)展。一種或多種源自癌癥的外來體的miRNA水平(即生物樣品中的miRNA量)的時間性變化可用于預(yù)測臨床結(jié)果、監(jiān)測癌癥的進(jìn)展和/或所提供的癌癥治療的效果。在一個這樣的實(shí)施方案中，例如，人們可能會觀察到生物樣品中具體miRNA的量在治療的過程中會隨時間減少，從而表明療法的有效性。在本申請公開的主題的另一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步提供了一種用于評估受試者中癌癥治療效果和/或癌癥進(jìn)展的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供來自一個受試者在一段時間內(nèi)的一系列生物樣品；從所述系列生物樣品分離源自癌癥且包含miRNA的外來體；確定所述系列生物樣品的每一個生物樣品中一種或多種所述miRNA的量；以及確定所述系列生物樣品的每一個生物樣品中所述一種或多種miRNA的任何可測量的量變化，從而評估所述受試者中癌癥治療效果和/或癌癥進(jìn)展。測量的miRNA在所述時間段上量的任何變化可用于預(yù)測臨床結(jié)果、確定是否起始或繼續(xù)對所述癌癥的療法及現(xiàn)行的療法是否能有效地治療所述癌癥。例如，可以在療法起始之前選擇一個第一時間點(diǎn)，并且在該療法起始后的某個時間點(diǎn)選擇一個第二時間點(diǎn)。可以測量取自不同時間點(diǎn)的每個樣品中的miRNA水平，并記錄定性和/或定量差異。來自所述第一份和第二份樣品的一種或多種所述測量的miRNA水平的量變化可與所述受試者中的預(yù)后、治療效果確定和/或疾病進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。本文使用的術(shù)語"相關(guān)的"和"相關(guān)聯(lián)"在言及癌癥相關(guān)的診斷性和預(yù)后性miRNA水平的用途時是指，將受試者中所述miRNA水平的存在或量與其在以下的受試者中的存在或量進(jìn)行對比已知患一種癌癥的受試者，或者已知未患所述癌癥的受試者即"正常受試者"或"對照受試者"。例如，可以將生物樣品中一種或多種miRNA水平與已被試驗(yàn)并確定與一種癌癥相關(guān)的每種具體miRNA的miRNA水平進(jìn)行對比。所述樣品的一種或多種miRNA水平被認(rèn)為已與一種診斷有關(guān)；即本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用所述一種或多種miRNA水平來確定所述受試者是否患有所述癌癥，并作出相應(yīng)處理。或者，可將所述樣品的一種或多種miRNA水平與已知與良好結(jié)果(如無癌癥)相關(guān)的一種或多種對照miRNA水平(例如正常受試群中存在的平均水平)進(jìn)行比較。在某些實(shí)施方案中，診斷性或預(yù)后性miRNA水平僅通過其存在與否與一種癌癥相關(guān)聯(lián)。在其他實(shí)施方案中，可確立一種診斷性或預(yù)后性miRNA水平的閾值水平，并可只將受試者樣品中的所述miRNA水平與該閾值水平進(jìn)行比較。如所述的，在一些實(shí)施方案中，可多次進(jìn)行一種或多種診斷性或預(yù)后性miRNA水平的測定，所述水平的時間性變化可用于確定診斷或預(yù)后。例如，一種或多種具體miRNA水平可在初始時間被測定，并在第二時間再次被測定。在這樣的實(shí)施方案中，所述一種或多種miRNA水平從初始時間至第二時間內(nèi)的增加是一種癌癥的診斷指標(biāo)，或者是一種給定的預(yù)后指標(biāo)。同樣，所述一種或多種miRNA水平從初始時間至第二時間內(nèi)的降低是所述癌癥的指示，或者一種給定的預(yù)后指示。再者，可以將一種或多種miRNA水平的變化程度與所述癌癥的嚴(yán)重度和/或疾病進(jìn)展的時間線和未來的不良事件相關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，雖然在某些實(shí)施方案中可以在多個時間點(diǎn)進(jìn)行相同的一種或多種miRNA水平的比較測量，但是也可以在一個時間點(diǎn)測量給定的一種或多種miRNA水平并在另一時間點(diǎn)測量另外的一種或多種miRNA水平，對這些水平的比較可提供診斷信息。本文使用的短語"確定預(yù)后"是指這樣的方法，即本領(lǐng)域技術(shù)人員通過該方法可預(yù)測受試者中一種病癥的過程或結(jié)果。術(shù)語"預(yù)后"不是指基于一種生物標(biāo)記物的存在、不存在或水平以100%的準(zhǔn)確性預(yù)測一種病癥的過程或結(jié)果的能力，甚至也不是指基于一種生物標(biāo)記物的存在、不存在或水平預(yù)測一種給定過程或結(jié)果更可能發(fā)生或更不可能發(fā)生的能力。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，術(shù)語"預(yù)后"是指某一過程或結(jié)果出現(xiàn)的可能性增加；即當(dāng)與沒有呈現(xiàn)一種給定病癥的那些個體相比時，一種過程或結(jié)果更可能出現(xiàn)在呈現(xiàn)該病癥的受試者中。例如，在不呈現(xiàn)該病癥(例如不表達(dá)或者以降低的水平表達(dá)所述一種或多種miRNA水平)的個體中，給定結(jié)果(例如患一種癌癥)出現(xiàn)的可能性可以很低(如<1%)甚或沒有。相反，在呈現(xiàn)該病癥(例如表達(dá)或以大大高于對照的水平表達(dá)所述一種或多種miRNA水平)的個體中，給定結(jié)果(例如患一種形式/階段的癌癥)出現(xiàn)的可能性可以較高。在某些實(shí)施方案中，預(yù)后是有約5%的可能性、約7%的可能性、約10%的可能性、約12%的可能性、約15%的可能性、約20%的可能性、約25%的可能性、約30%的可能性、約40%的可能性、約50%的可能性、約60%的可能性、約75%的可能性、約90%的可能性或約95%的可能性出現(xiàn)一種給定預(yù)期結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，將預(yù)后指示物與產(chǎn)生不良結(jié)果的傾向進(jìn)行關(guān)聯(lián)是一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)分析。例如，在一些實(shí)施方案中，高于或低于對照水平的一種或多種miRNA水平(例如一個樣品中的一種或多種miRNA的量)可預(yù)兆受試者比具有低于或等于所述對照水平的受試者更有可能患一種癌癥，這由統(tǒng)計(jì)顯著性水平來確定。另外，一種或多種miRNA水平相對于基線水平的變化可以反映出受試者的預(yù)后情況，并且標(biāo)記物水平變化的程度可以與不良事件的嚴(yán)重度相關(guān)聯(lián)。統(tǒng)計(jì)顯著性經(jīng)常通過以下方式確定，即比較兩個或多個群并確定置信區(qū)間及/或P值。例如，見DowdyandWearden，StatisticsforResearch,JohnWiley&Sons,NewYork,1983，該參考文獻(xiàn)通過引用的方式全文納入本文。本發(fā)明主題的示例性置信區(qū)間為90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%和99.99X，而示例性p值為0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。在其他實(shí)施方案中，可確立一種或多種預(yù)后性和診斷性miRNA水平的水平變化閾值度，并可只將生物樣品中的該指示物的水平變化度與該水平變化閾值度進(jìn)行比較。本申請公開的主題的一種或多種miRNA水平的水平變化閾值優(yōu)選為約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約50%、約60%、約75%、約100%和約150%。在又一個實(shí)施方案中，可確立一種"諾模圖(nomogram)"，通過該圖可以將預(yù)后性和診斷性指示物水平與一個給定結(jié)果的相關(guān)傾向進(jìn)行直接關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉使用這種諾模圖來關(guān)聯(lián)兩個數(shù)值，并同時理解由于所參照的是個體樣品的測量值而非群體的平均值，因此該測量的不確定性與該標(biāo)記物濃度的不確定性相同?！獋€樣品中miRNA的特征(identity)和相對量可用于為具體的樣品提供miRNA譜。一個樣品的miRNA譜包括所述樣品中包含的miRNA特征的信息、所述樣品中包含的miRNA的定量水平及/或miRNA的定量水平相對于另一個樣品的變化。例如，一個樣品的miRNA譜包括這樣的信息，即該信息是關(guān)于與一種具體癌癥有關(guān)的miRNA的特征、定量水平及/或定量水平的變化。進(jìn)一步，對于本申請公開的主題的診斷方法，優(yōu)選的受試者是脊椎動物受試者。優(yōu)選的脊椎動物是溫血動物；優(yōu)選的溫血脊椎動物是哺乳動物。優(yōu)選的哺乳動物最優(yōu)選人。如本文中使用的，術(shù)語"受試者"包括人受試者和動物受試者。因此，根據(jù)本申請公開的主題提供了獸醫(yī)的治療用途。由此，本申請公開的主題提供了對哺乳動物的治療，所述哺乳動物例如人以及那些由于瀕臨滅絕而重要的哺乳動物，例如東北虎(Siberiantiger);具有重要經(jīng)濟(jì)學(xué)價值的哺乳動物，例如在農(nóng)場中飼養(yǎng)用于人消費(fèi)的動物；以及/或者在社會關(guān)系上對人來說重要的動物，例如作為寵物或在動物園中的動物。這些動物的實(shí)例包括但不限于食肉動物例如貓和狗；豬類(swine)，包括豬(pig)、閹豬(hog)和野豬(wildboar);反芻動物及/或19有蹄動物例如牛(cattle)、公牛(ox)、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝；以及馬。還提供了對鳥類的治療方法，不但包括對禽類特別是家養(yǎng)禽(即家禽，例如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞(guineafowl)等)的治療方法，而且包括對那些瀕臨滅絕并/或在動物園中的鳥種類的治療方法，這是因?yàn)樗鼈儗θ艘灿兄匾慕?jīng)濟(jì)學(xué)價值。因此，還提供了對家畜的治療方法，所述家畜包括但不限于家豬、反芻動物、有蹄動物、馬(包括競賽馬)、家禽等。如上文所述的，本申請公開的主題提供了對受試者的生物液體中的源自癌癥的外來體且與癌癥相關(guān)的miRNA進(jìn)行量確定，所述生物液體尤其是來自受試者的血清學(xué)樣品，例如血液。這提供的試驗(yàn)生物樣品的優(yōu)點(diǎn)是易于從所述受試者獲取。然后，可以利用本領(lǐng)域中公知的多種方法的任一種確定所述生物樣品中的一種或多種目標(biāo)miRNA的量，并將該量與miRNA對照水平比較。確定的一種或多種miRNA的"量"是指所述一種或多種miRNA的定性測量值(例如在所述測量樣品中存在或不存在)和/或定量測量值(例如存在多少)。"對照水平"是指未患癌癥的受試者中的可比較樣品中存在的一種或多種miRNA的量(包括定性存在或不存在)或量區(qū)間。作為計(jì)算該對照水平的一個非限制性實(shí)例，可計(jì)算正常生物樣品(例如血液)中存在的一種或多種目標(biāo)miRNA的量并將其外推至全體受試者。用于從生物樣品的外來體測量miRNA水平的一種示例性方法是微陣列技術(shù)，該技術(shù)是基因表達(dá)研究中應(yīng)用的一個強(qiáng)大工具。該技術(shù)提供了大量具有已知序列信息的多核苷酸作為探針，以在一個樣品中尋找并雜交互補(bǔ)鏈，從而通過選擇性結(jié)合捕獲所述互補(bǔ)鏈。圖1和8提供的示例方案的流程圖可用于通過微陣列分離并測量源自外來體的miRNA。本文使用的術(shù)語"選擇性結(jié)合"是指探針與靶多核苷酸特異性雜交的能力的測量值。因此，所述探針包括這樣的多核苷酸序列，即其與至少部分的靶多核苷酸序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)。"互補(bǔ)的"核酸序列可依照標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick互補(bǔ)規(guī)則進(jìn)行堿基配對。本文使用的術(shù)語"互補(bǔ)序列"是指基本互補(bǔ)的核酸序列，這可以通過與上文列出的相同的核苷酸比較進(jìn)行評估，或者被定義為在相對嚴(yán)格的條件(例如本文描述的那些條件)能夠與論及的所述核酸區(qū)段雜交。被考慮的互補(bǔ)核酸區(qū)段的一個具體實(shí)例是反義寡核苷酸。關(guān)于本文公開的對miRNA具有結(jié)合親和性的探針，所述探針與所述靶多核苷酸序列可以是100%互補(bǔ)。然而，所述探針不必與所述靶多核苷酸在所述多核苷酸的全長上完全互補(bǔ)，條件是所述探針可以與所述靶多核苷酸以特異性結(jié)合，并將其從所述樣品中捕獲。除了堿基組成、互補(bǔ)鏈的長度和所述雜交核酸之間的核苷酸堿基錯配的數(shù)目之外，核酸雜交還將受諸如鹽濃度、溫度或有機(jī)溶劑這類條件的影響，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。嚴(yán)格的溫度條件通常包括超過3(TC的溫度，一般超過37t:，并優(yōu)選超過45t:。嚴(yán)格的鹽條件通常低于1，000mM，一般低于500mM，并且優(yōu)選低于200mM。然而，參數(shù)的結(jié)合比任何單個參數(shù)的測量值更重要。為鑒定及/或分離包含高同源性水平的序列確定合適的雜交條件是本領(lǐng)域中公知的。為了指定高嚴(yán)格度的條件之目的，優(yōu)選的條件為約200mM的鹽濃度和約45t:的溫度。數(shù)據(jù)挖掘的工作通過生物信息學(xué)完成，包括掃描芯片、信號獲取、圖像處理、歸一化、統(tǒng)計(jì)處理和數(shù)據(jù)比較，以及通路分析。由此，微陣列可以以高通量的性能同時對數(shù)百和數(shù)千種多核苷酸進(jìn)行作譜。在基礎(chǔ)研究中，mRNA表達(dá)的微陣列作譜分析已成功地為基因表達(dá)研究提供了有用的數(shù)據(jù)。并且，該技術(shù)還已被進(jìn)一步應(yīng)用于制藥工業(yè)和臨床診斷中。隨著可獲得的miRNA的量的增加并且隨著miRNA在基因調(diào)控中的重要性證據(jù)的積累，微陣列已經(jīng)成為用于高通量miRNA研究的一種有用的技術(shù)。對與癌癥有關(guān)的miRNA的分析可以在一個試驗(yàn)樣品中單獨(dú)進(jìn)行與多個多核苷酸探針同時地進(jìn)行。例如，可將數(shù)種探針聯(lián)合到一個試驗(yàn)，用于多個樣品的有效處理，并且有可能用于提供更為準(zhǔn)確的診斷和/或預(yù)后。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解對來自相同受試者的多個樣品(例如在連續(xù)的時間點(diǎn))進(jìn)行測試的價值。這種系列樣品的測試使得可鑒定miRNA水平隨時間的變化。miRNA水平的升高或降低以及無變化可提供有關(guān)所述疾病狀態(tài)的有用信息。在一些實(shí)施方案中，可構(gòu)建由與源自癌癥且與一種或多種癌癥相關(guān)的外來體miRNA選擇性結(jié)合的多核苷酸探針組成的面板，以提供與癌癥診斷或預(yù)后以及與對患癌癥的受試者進(jìn)行管理的有關(guān)的相關(guān)信息。例如，可使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500或1000種個體的多核苷酸探針構(gòu)建這種面板。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對單個探針或包含一個較大探針面板的探針亞組進(jìn)行分析，以在多種臨床環(huán)境下優(yōu)化臨床敏感性或特異性。它們包括但不限于門診、緊急護(hù)理、危重癥護(hù)理、重癥監(jiān)護(hù)、監(jiān)測室、住院受試者、門診受試者、醫(yī)生辦公室、醫(yī)療診所和健康篩查環(huán)境。再者，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用單個探針或者構(gòu)成較大探針面板的另外探針的亞組與對每一前述的環(huán)境下的診斷閾值的調(diào)整相結(jié)合，以優(yōu)化臨床敏感性和特異性。一項(xiàng)測定的臨床敏感性被定義為該測定正確預(yù)測的患所述疾病的患者的百分?jǐn)?shù)，一項(xiàng)測定的特異性被定義為該測定正確預(yù)測的無所述疾病的患者的百分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方案中，確定所述一種或多種miRNA的量包括標(biāo)記所述一種或多種miRNA。然后，所述標(biāo)記的miRNA可以被各自選擇性結(jié)合所述一種或多種miRNA的一種或多種多核苷酸探針捕獲。本文使用的術(shù)語"標(biāo)記"和"標(biāo)記的"是指一個能夠通過分光計(jì)方法、放射學(xué)方法或其他方法檢測的部分與一個探針分子的附著。因此，術(shù)語"標(biāo)記"或"標(biāo)記的"是指任選共價地或非共價地將一種可探測的標(biāo)記物結(jié)合或附著于一種分子例如多核苷酸之中或之上。多種標(biāo)記多肽的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的并且可被使用。用于多核苷酸的標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于下列放射性同位素、熒光標(biāo)記、重原子、酶標(biāo)記或報(bào)告基因、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、生物素基團(tuán)、被第二報(bào)告物(例如亮氨酸拉鏈對序列、抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合區(qū)域、表位標(biāo)簽等)識別的預(yù)設(shè)的多肽表位。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記通過不同長度的間隔子臂附著，以降低潛在的位阻。利用多核苷酸探針分析miRNA水平也可以以多種物理形式進(jìn)行。例如，微量滴定板或自動控制可用于幫助大量試驗(yàn)樣品的處理?；蛘?，可開發(fā)單樣品形式，以有利于及時地進(jìn)行即刻治療和診斷。在一些實(shí)施方案中，多種多核苷酸探針各自結(jié)合于一種基底。在一些實(shí)施方案中，所述基底包括多個地址。每個地址可與所述陣列的至少一種多核苷酸探針相關(guān)聯(lián)。如果一個陣列具有不同部分(如不同的多核苷酸序列)的多個區(qū)域，使得位于所述陣列上一個具體的預(yù)設(shè)位置(即一個"地址")的一個區(qū)域(即所述陣列的一個"要素"或"點(diǎn)")可檢測一種具體的靶或一類靶(雖然一個要素可能偶然地檢測非該要素的靶)，那么該陣列是"可尋址的"。陣列要素通常但不必須由插入空間分隔。對于陣列而言，所述"靶"miRNA可以被看作流動相(一般是流體)中待被結(jié)合于所述基底不同區(qū)域的探針("靶向探針")檢測的一個部分。通過將此前已獲得的生物聚合物(例如來自合成源或天然源)沉積于一個基底之上或者通過原位合成方法，可制造生物聚合物陣列(如多核苷酸微陣列)。沉積獲得生物聚合物的方法包括但不限于將針或毛細(xì)管裝載，然后接觸一個表面，例如美國專利5，807，522中的描述；通過從脈沖噴射口例如墨水噴射頭噴發(fā)進(jìn)行沉積，例如PCT公開文本W(wǎng)095/25116和W098/41531中以及別處的描述。原位制造方法包括以下的方法并且還可將脈沖噴射用于沉積試劑美國專利5，449，754中描述用于合成肽陣列的那些方法，以及美國專利6，180，351、W098/41531和本文引用的參考文獻(xiàn)用于多核苷酸的那些方法。通過沉淀此前已獲得的生物聚合物或者通過原位方法制造生物聚合物陣列的細(xì)節(jié)進(jìn)一步記載于美國專利6，242，266、6，232，072、6，180，351和6，171，797中。在通過沉淀已獲得的生物聚合物或者通過原位方法制造陣列中，在其上將要形成或已形成陣列的基底表面上的每個區(qū)域("陣列區(qū)域")通常被完全地暴露于一種或多種試劑中。例如，在兩種方法之一中，所述陣列區(qū)經(jīng)常被暴露于一種或多種試劑，以在所述表面形成一層合適的層，該層可同時結(jié)合所述基底和生物聚合物或生物單體。在原位制造中，所述陣列區(qū)域還通常被暴露于氧化試劑、去封閉試劑及任選的加帽試劑中。類似地，特別是在通過沉積已獲得的生物聚合物進(jìn)行制造中，可能需要將所述陣列區(qū)域暴露于一種合適的封閉試劑，以阻斷所述表面上的無要素的位置與靶的非特異性結(jié)合的位置。備選地或除微陣列分析之外，對源自癌癥的miRNA的量進(jìn)行測定可包括使用實(shí)時多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)，例如在本申請實(shí)施例中詳細(xì)公開的。實(shí)時PCR(RT-PCR)可準(zhǔn)確且快速地提供有關(guān)miRNA在一個樣品中的存在和量的數(shù)據(jù)。圖2提供的一個示例性方案的流程圖可用于通過RT-PCR分離并測量源自外來體的miRNA。示例性方法的其他細(xì)節(jié)在本發(fā)明的實(shí)施例中列出。在本申請公開的主題的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于在受試者中診斷潛在的不利妊娠結(jié)果的方法?？蓱?yīng)用在上文詳細(xì)公開的用于分離包含miRNA的外來體并測定miRNA量的方法，這種應(yīng)用類似于對與不利妊娠結(jié)果相關(guān)的具體miRNA進(jìn)行定量，有如下面描述的幾點(diǎn)改良。為了預(yù)測不利妊娠結(jié)果，可從生物樣品分離源自胎盤的循環(huán)系統(tǒng)外來體，所述生物樣品例如血液或其組分。雖然胎盤源自胚胎，但它是唯一真正與母體系統(tǒng)接觸的胚胎組織。由此，由胎盤細(xì)胞產(chǎn)生的外來體可在母親的血液中循環(huán)。為了分離源自胎盤的外來體，可以使用連接于磁珠上的抗EpCAM抗體(這用于腫瘤外來體分離)或抗胎盤型堿性磷酸酶抗體(PLAP)(見例如圖8)。例如，在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供一個來自一個受試者的生物樣品，并從所述生物樣品分離包含微RNA(miRNA)的外來體。然后，確定一種或多種所述miRNA的量并將該量與一種或多種miRNA對照的水平比較。如果來自所述外來體的所述一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平相比有可測量的差異，那么所述受試者被診斷為處于不利妊娠結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述不利妊娠結(jié)果為一種選自先兆子癇、早產(chǎn)(例如在妊娠32周之前分娩)、胎膜早破、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失的障礙。除非另外指出，對本申請公開的主題的實(shí)施可應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的描述。例如，見MolecularCloningALaboratoryManual(1989)，2ndEd.，ed.bySambrook，F(xiàn)ritschandManiatis，eds.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Chapters16and17;美國專利4，683，195;DNACloning，VolumesIandII，Glover，ed.，1985;OligonucleotideSynthesis,M.J.Gait，ed.，1984;NucleicAcidHybridization,D.Hames&S.J.Higgins，eds.，1984;TranscriptionandTranslation,B.D.Hames&S.J.Higgins，eds.，1984;CultureOfAnimalCells,R.I.Freshney，AlanR丄iss，Inc.，1987;ImmobilizedCellsAndEnzymes,IRLPress,1986;Perbal(1984)，APracticalGuideToMolecularCloning;SeeMethodsInEnzymology(AcademicPress,Inc.，N.Y.);GeneTransferVectorsForMammalianCells,J.H.MillerandM.P.Calos，eds.，ColdSpringHarborLaboratory,1987;MethodsInEnzymology，Vols.154and155，Wuetal.，eds.，AcademicPressInc.，N.Y.;ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker,eds.，AcademicPress,London,1987;HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI_IV，D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.，1986。實(shí)施例引入以下的實(shí)施例來說明本申請公開的主題的實(shí)施方式?？紤]到本申請的公開內(nèi)容及本領(lǐng)域中的一般技術(shù)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，以下的實(shí)施例僅被意欲作為示例，并且只要不偏離本申請公開的主題的范圍可進(jìn)行多種改變、修飾和修改。本申請公開的主題公開了miRNA存在于生物液體的外來體中并可從中分離。所述分離的miRNA可被用作癌癥和不利妊娠結(jié)果的診斷工具。本發(fā)明的實(shí)施例為這些應(yīng)用提供了支持。實(shí)施例1-5的材料和方法患者樣品和細(xì)胞系這些實(shí)施例利用作為示例性生物液體的血清，其源自被診斷為卵巢的漿液性乳頭狀腺癌的女性(n二50;I期n二10、n期n二10、III期n=20且IV期n=10)、年齡匹配的患良性卵巢腺癌的女性(n=10)和年齡匹配的無卵巢疾病癥狀的女性(n=10)?；谂c患早期卵巢癌的患者匹配的年齡選擇對照、患良性卵巢疾病的患者、III期卵巢癌的患者和IV期卵巢癌的患者。這些實(shí)施例進(jìn)一步包括這樣的數(shù)據(jù)，即這些數(shù)據(jù)來自對從6名患有IIIc期卵巢囊腺癌的女性建立的原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物及其相應(yīng)的手術(shù)前血清樣品的研究。所有這些材料的獲得經(jīng)路易斯維爾大學(xué)(UniversityofLouisville)的大學(xué)人類研究委員會(UniversityHumanStudiesCommittee)的知情同意審查。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中，已經(jīng)建立了所述原代卵巢腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，被命名為UL-1、UL-2、UL-3、UL-6、UL-B和UL_0。UL-2和UL-3來自遺傳性卵巢癌，而UL_1、UL-6、UL_B和UL-0來自自發(fā)癌。這些卵巢腫瘤細(xì)胞在濕潤5%C02空氣中被培養(yǎng)于補(bǔ)充有10%的無外來體的(經(jīng)超濾)的胎牛血清、0.lmM非必需氨基酸、lmM丙酮酸鈉、200mML-谷氨酰胺、100mg/ml鏈霉素和100IU/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。通過臺盼藍(lán)拒染法評估細(xì)胞活性，使用的所有培養(yǎng)物活率都>95%。f跡碰夕卜雄,m使用抗上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)抗體，通過改良的磁激活細(xì)胞分選(MACS)方法特異地分離源自腫瘤的外來體。本發(fā)明人以前的研究已證明，在來自上皮腫瘤的外來體的表面上表達(dá)EpCAM，并可被用于它們的選擇性分離。將來自正常對照、患良性疾病的患者和患早期卵巢癌的患者的血清樣品(2.5ml)與偶聯(lián)于磁性微珠上的抗EpCAM抗體(50iU)孵育。將它們混合并在4t:下孵育2小時。將LD微柱置于MACS分離器的磁場中，以500的Tris-緩沖鹽水(TBS)沖洗該柱。將磁性免疫復(fù)合物加樣至該柱，未結(jié)合的(未標(biāo)記的)物質(zhì)流過該柱并被丟棄。以500ill的TBS洗滌該柱4次。通過將該柱從所述分離器中取出并將其置于一個采集管中，回收所述特異性選擇的外來體。將TBS(lml)添加至該柱，通過施用隨該柱提供的柱塞獲得所述磁性標(biāo)記的外來體。將所分離的外來體/微珠稀釋于IgG洗脫緩沖液(PierceChemicalCo，Rockford，IL)中，以10，OOOrpm離心該復(fù)合物，以從所述外來體分離所述微珠(上清液)。然后，在4t:下以lOO，OOOg離心該上清液l小時。將沉淀的外來體重新懸浮于250iU磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，并測定這些源自腫瘤的外來體的總蛋白質(zhì)。使用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)，通過Bradford微測定方法(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)確定所述蛋白質(zhì)的量。誘射電子顯微術(shù)為進(jìn)行透射電子顯微術(shù)，將沉淀的外來體在2.5%(w/v)戊二醛的PBS溶液中固定、脫水并包埋入環(huán)氧樹脂(Epon)中。切超薄切片(65nm)并以乙酸雙氧鈾和Reynold檸檬酸鉛染色。用Jeol1210透射電子顯微鏡檢查所述切片。miRNA的分離和作譜使用mirVanamiRNA分離試劑盒依照生產(chǎn)商的說明書(Ambion，Austin,TX)從腫瘤細(xì)胞和外來體分離總RNA。使用Agilent2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies,FosterCity，CA)分析該RNA的質(zhì)量、產(chǎn)率及miRNA部分的大小。使用mirVanamiRNA陣列標(biāo)記試劑盒(Ambion)和標(biāo)記后反應(yīng)染料試劑盒(PostLabelingReactiveDyekit)(AmershamBioscience,Pittsburgh,PA)，以Cy3標(biāo)記所分離miRNA的3'端。使用包含針對467種人成熟miRNA的探針的微陣歹lj，由OceanRidgeBiosciences(Jupiter，F(xiàn)L)重復(fù)進(jìn)行兩次微RNA作譜。該分析使用覆蓋了存在于SangerInstitutemirBASEv9.0中的467種miRNA的定制開發(fā)的miRNA陣列，該陣列由35-44-mer的寡核苷酸組成、由Invitrogen制作并進(jìn)行兩次重復(fù)點(diǎn)樣。在雜交之后，使用GenePix4000A陣列掃描儀(AxonInstruments,UnionCity，CA)掃描所述miRNA陣列，使用GeneSpring7.0軟件(SiliconGenetics,RedwoodCity，CA)歸一化和分析原始數(shù)據(jù)。歸一化是通過相對于添加至每個樣品的對照miRNA(Ambion)表示每個miRNA重復(fù)，使得可在陣列之間進(jìn)行比較來進(jìn)行?；趤碜躁幮詫φ仗结樀碾s交信號計(jì)算閾值和陰性對照的第95百分位(TPT95)，所述對照探針包括38個錯配和混洗的對照探針及87個非保守的秀麗線蟲(C.elegans)探針。為了確定敏感性，NCode合成的miRNA以1/500，000質(zhì)量比參與到反應(yīng)的標(biāo)記，并檢測了信號強(qiáng)度。對于特異性，使用miR-93、miR-27a和miR-152的完全匹配探針及其2個錯配的探針。所述2堿基對錯配探針在所有陣列上都呈現(xiàn)TPT95的信號或低于TPT95的信號。為了評估所述外來體作譜在存儲和操作方面的穩(wěn)定性，從患卵巢癌的患者獲得血清，并分成4個4ml的樣品的等分部分。經(jīng)MACS步驟立即從第一等分部分分離腫瘤外來體，分離總RNA并存儲于-701:直至將所有樣品分離。將剩下的血清樣品存儲于4t:，用于后續(xù)的外來體分離。在4t:下，在24小時后從第二等分部分、在48小時后從第三等分部分以及在96小時后從第四等分部分分離腫瘤外來體。從每個外來體制品分離RNA并保存。在類似的研究中，將另外3個血清等分部分存儲于-7(TC下7-28天，然后分離外來體和RNA以模擬儲存標(biāo)本的用途。一膽鄉(xiāng)充i十越使用統(tǒng)計(jì)軟件包SAS9.l(SASInstitute,Cary，NC)分析數(shù)據(jù)。每組患者的循環(huán)系統(tǒng)外來體水平被表示為來自至少兩個獨(dú)立的重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用單因素ANOVA進(jìn)行這些組之間的比較，然后是試驗(yàn)后比較每個群體的Tukey多重比較。以2-AACt方法(AppliedBiosystemsUserBulletinNo.2)計(jì)算miRNA表達(dá)的相對量，數(shù)據(jù)被分析表示為耙miRNA的相對量(RQ)的loglO值，相對于添加至每個樣品的對照miRNA進(jìn)行歸一化，使得可在陣列之間進(jìn)行比較。對每個亞組計(jì)算miRNA隨置信區(qū)間的分布和相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)顯著性被設(shè)定為P《0.05。實(shí)施例l在患良性和惡性卵巢疾病的女性中存在EPCAM陽性的循環(huán)系統(tǒng)外來體使用抗EpCAM抗體的磁珠特異性地分離EpCAM陽性的外來體，測定這些循環(huán)系統(tǒng)外來體的總蛋白質(zhì)，并相對于疾病的階段作圖(圖3A)。年齡匹配的正常志愿者(對照)中EpCAM陽性的外來體的水平為0.039±0.030mg/ml的外來體蛋白質(zhì)，這代表該測定的背景值。被診斷為良性卵巢疾病的患者具有O.149±0.065mg/ml的外來體蛋白質(zhì)，這顯著高于對照值。被診斷為卵巢癌的患者都呈現(xiàn)顯著高水平的EpCAM陽性的外來體(與良性疾病或?qū)φ毡容^)。患I期卵巢癌的女性呈現(xiàn)0.320±0.056mg/ml的循環(huán)系統(tǒng)外來體蛋白質(zhì)，這顯著高于對照和良性疾病(p<0.01)。循環(huán)系統(tǒng)外來體的水平隨階段的進(jìn)展升高，II期癌癥為0.640±0.053mg/ml，III期為0.995±0.084mg/ml，且IV期呈現(xiàn)1.42±0.228mg/ml。這三個階段相關(guān)的外來體水平顯著高于患良性疾病的女性或?qū)φ?P<0.001)。通過電子顯微術(shù)進(jìn)一步分析了所生成的部分，證明了外來體的小泡結(jié)構(gòu)特征(圖3B)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡，四旋蛋白(tetraspanin)、I類抗原和胎盤型堿性磷酸酶的存在進(jìn)一步確證了該材料的外來體性質(zhì)。實(shí)施例2小RNA與源自腫瘤的外來體的關(guān)聯(lián)為了鑒定這些分離的外來體是否包含小RNA，使用Bio-Analyzer2100檢查它們(圖4)。這些分析鑒定了在不存在通常與源自細(xì)胞的RNA—塊出現(xiàn)的18S和28SRNA的情況下，存在顯著數(shù)量的小RNA。這些材料隨后用于miRNA作譜。實(shí)施例3源自外來體的與源自細(xì)胞的MIRNA的作譜使用探測467種miRNA的微陣列分析(圖1)確定源自細(xì)胞的和源自外來體的miRNA的特異性miRNA的存在和水平。示例性結(jié)果顯示于表1中。本發(fā)明人的卵巢腫瘤的miRNA譜確證了以前報(bào)道的這些差別(Iorioetal.，2007)。而且，本發(fā)明人已證明，467種miRNA中的218種在基于細(xì)胞和外來體中陰性對照探針信號的第95百分位計(jì)算的歸一化閾值以上(表2)。所述218種陽性miRNA的175種的水平在所述卵巢腫瘤細(xì)胞和它們的相應(yīng)外來體之間沒有顯著性差異。通過比較，12種在所述細(xì)胞中以較高比例存在，而31種在外來體內(nèi)以升高的水平存在。以前，已證明特定的miRNA在人卵巢癌細(xì)胞中過量表達(dá)(miR_21、miR_141、miR-200a、miR-200c、miR-200b、miR_203、miR-205和miR-214)。為了將這些結(jié)果與源自外來體的材料相關(guān)聯(lián)，從所述源腫瘤細(xì)胞和同一患者的循環(huán)系統(tǒng)腫瘤外來體分離RNA部分(圖5)。通過微陣列分析，在源自腫瘤的miRNA譜和源自外周血的外來體的miRNA之間的比較表明，它們沒有顯著差異。而且，源自腫瘤的miRNA譜的水平與源自外周血的外來體的miRNA呈現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性(miR-21，r=0.77;miR_141，r=0.88;miR-200a，r=0.76;miR_200b，r=0.85;miR_200c，r=0.83;miR_203，r=0.85;miR_205，r=0.91;且miR-214，r=0.71)。表l來自癌癥受試者的循環(huán)系統(tǒng)外來體和腫瘤細(xì)胞中的miRNA的定量性比較^<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>^原始數(shù)據(jù)經(jīng)背景消減丄(^2-轉(zhuǎn)化及歸一化。每個寡核苷酸探針的強(qiáng)度基于對兩個重復(fù)點(diǎn)進(jìn)行平均?；贚og2(5l夂點(diǎn)背景的標(biāo)準(zhǔn)差+去頭尾平均陰性對照探針信號)計(jì)算歸一化的閾值。表2miRNA與源自外周血腫瘤的外來體的關(guān)聯(lián)，與從它們的相應(yīng)腫瘤分離的miRNA相比較微RNA與源自外周血腫瘤的外來體的關(guān)聯(lián)，與從它們的相應(yīng)腫瘤分離的微RNA相比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實(shí)施例4外來體miRNA與疾病存在和階段的關(guān)聯(lián)本發(fā)明人以前對晚期患者在腫瘤和循環(huán)系統(tǒng)外來體之間進(jìn)行了比較。為了在多個階段比較具體miRNA與疾病存在的關(guān)聯(lián)，確定了外來體miRNA的平均強(qiáng)度。對于8種診斷性miRNA的大多數(shù)而言，在I期、11期和III期患者中它們的存在沒有顯著性差異(圖6)。與II期和III期患者相比，I期患者中的miR-200c和miR-214更低。然而，在所有這些情形中，這些miRNA都顯著高于在源自良性疾病的外來體中檢測到的水平。無法證明在正常受試者中存在所述小RNA部分，并且評估m(xù)iRNA存在的嘗試結(jié)果是否定的。實(shí)施例5外來體MIRNA譜的穩(wěn)定性由于對循環(huán)系統(tǒng)外來體miRNA的測量在本文中已證明是有診斷價值的，接著對它的穩(wěn)定性的技術(shù)問題進(jìn)行說明。當(dāng)對在4t:下經(jīng)短時間(最長至96小時)保存的血清樣品進(jìn)行miRNA作譜并將強(qiáng)度進(jìn)行比較時(圖7A)，在所分析的3種診斷性miRNA中沒有出現(xiàn)顯著差異。當(dāng)血清樣品在-7(TC下保存更長的時間間隔時，所述微陣列上這些miRNA的強(qiáng)度無顯著差異(圖7B)。這些結(jié)果表明，這些外來體miRNA的水平是穩(wěn)定的，不會隨保存而顯著變化。實(shí)施例1-5的討論微RNA表達(dá)作譜可用作當(dāng)前缺乏可靠分子標(biāo)記物的癌癥(例如卵巢癌)的診斷工具。雖然以前的研究已表明miRNA標(biāo)志可作為卵巢癌的診斷的和預(yù)后的標(biāo)記物，但是這些數(shù)據(jù)是基于它們在組織標(biāo)本中的表達(dá)。本發(fā)明的實(shí)施例提供的數(shù)據(jù)第一次證明了miRNA與源自腫瘤的循環(huán)系統(tǒng)外來體的關(guān)聯(lián)。在以前的研究中，miRNA已經(jīng)被證明在人卵巢癌中異常表達(dá)，并且總miRNA表達(dá)可區(qū)分正常組織與癌癥組織(Iorioetal.，2007)。Lu等人(2005)的研究證明了miRNA標(biāo)志的使用在癌癥診斷中是一項(xiàng)重大進(jìn)步。他們的工作表明，基于miRNA的癌癥鑒定在正確診斷不明原發(fā)灶的癌癥中優(yōu)于mRNA分類。然而，在本申請公開的主題之前，在不存在待進(jìn)行生物活檢的組織塊的情況下，不可能使用miRNA作譜。本發(fā)明人最初對外來體的電子顯微術(shù)表征表明，它們是中空的(即無病毒樣結(jié)構(gòu))(Taylor&Black,1986)。結(jié)果是，本發(fā)明人的小組與其他人一起將目光聚焦于外來體的外部蛋白質(zhì)及外來體暴露的生物后果。然而，在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明人意外地第一次證明了與循環(huán)系統(tǒng)腫瘤外來體有關(guān)的小RNA種類的存在(圖4)。這種小RNA缺乏與細(xì)胞RNA相關(guān)的18S和28S。而且，本文公開的微陣列分析表明，至少部分的所鑒定的小RNA是miRNA。本發(fā)明人的卵巢腫瘤細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜確證了以前研究中報(bào)道的miRNA異常。對循環(huán)系統(tǒng)腫瘤外來體和來自相同患者的腫瘤細(xì)胞的分析表明，兩者均有46%的測試miRNA(218/467)是陽性的。當(dāng)將所述miRNA的強(qiáng)度歸一化后，大多數(shù)的這些miRNA在所述細(xì)胞和外來體之間以類似的水平表達(dá)或者在所述外來體中升高(175種無顯著性差異，31種在外來體中升高)。因此，用于確立癌癥特異性標(biāo)志的異常表達(dá)的miRNA存在于卵巢癌患者的細(xì)胞區(qū)室和外來體區(qū)室中。本發(fā)明人對具體miRNA的比較——以前被證明是有診斷價值的——表明了在來自腫瘤和其相應(yīng)外來體的miRNA之間的高水平的相關(guān)(在0.71-0.90之間)。這種高相關(guān)甚至適用于似乎以更高比例出現(xiàn)于外來體中的miRNA，例如miR-214。特定miRNA在外來體中一致升高已說明，對于至少部分miRNA，miRNA在外來體中的區(qū)室化是一個主動的(選擇的)過程。這種過程可能被在腫瘤外來體上異常表達(dá)的組分例如核仁素(nucleolin)或核磷蛋白介導(dǎo)。由于這些結(jié)果證明了外來體miRNA作譜可用作組織miRNA的代表物并且篩查的目標(biāo)可以是對早期疾病進(jìn)行鑒定，所以在早期疾病中檢查了對循環(huán)系統(tǒng)外來體miRNA進(jìn)行檢測的能力。在患早期卵巢癌與晚期卵巢癌的患者之間，所述診斷性miRNA的外來體miRNA表達(dá)對于大多數(shù)的這些miRNA沒有顯著差別(圖6)。與II期和III期相比，miR-200c和miR-214在患I期的患者中更低；然而，在所有情況下，這些miRNA比源自良性疾病的外來體中檢測的水平顯著升高。無法證明在正常受試者中存在所述小RNA部分，并且評估m(xù)iRNA存在的嘗試結(jié)果是否定的。因此，不存在外來體和/或外來體小RNA與正常個體、非攜帶癌癥的個體有關(guān)，映射正常組織miRNA譜的外來體miRNA似乎與良性疾病有關(guān)。在卵巢癌的階段之間的相似性可能是對起始的外來體小RNA的量的標(biāo)準(zhǔn)化和對所產(chǎn)生的陣列數(shù)據(jù)歸一化的結(jié)果。盡管有這種標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化，以來自患良性疾病的患者的外來體miRNA獲得的譜仍然是不同的。這些結(jié)果表明，對與循環(huán)系統(tǒng)外來體相關(guān)的具體miRNA的分析可適用于卵巢癌的所有階段，并且基于本文中提及的8種具體miRNA的水平似乎可區(qū)分良性疾病和惡性疾病。外來體的miRNA特征平行與起源腫瘤細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜相當(dāng)，這表明miRNA作譜可在無組織的條件下進(jìn)行并且可準(zhǔn)確地反映所述腫瘤的譜。本發(fā)明人還已發(fā)現(xiàn)，來自肺癌患者的且源自腫瘤的外來體包含類似于相應(yīng)腫瘤miRNA特征的miRNA(見實(shí)施例6)。使用腫瘤標(biāo)記物例如EpCAM可分離來自循環(huán)系統(tǒng)腫瘤的外來體，然后對外來體相關(guān)的miRNA進(jìn)行分析。由于該方法是非侵入性的——原因是它不需要一個組織塊來進(jìn)行活組織檢查，外來體miRNA作譜可用作一種檢測多種不同癌癥的篩查工具。由于鑒定了可預(yù)測預(yù)后(包括治療性抗拒)且與腫瘤組織有關(guān)的具體miRNA(例如let-7i、miR-16、miR-21和miR-214)(Yangetal.，2008;Bloweretal.，2008)，還可評估它們在腫瘤外來體中的存在，以進(jìn)一步確定外來體的miRNA作譜作為一種預(yù)后指示物的效用。外來體miRNA作譜的應(yīng)用可將該方法擴(kuò)展至對無癥狀個體的篩查，以及用于監(jiān)測疾病復(fù)發(fā)。實(shí)施例6miRNA與源自外周血的肺腫瘤外來體的關(guān)聯(lián)，與從它們的相應(yīng)肺腫瘤分離的miRNA相比較在證明非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的診斷性miRNA特征的研究中，與正常肺組織相比，特定miRNA是過量表達(dá)的(miR-17-3p、miR-21、miR-106a、miR_146、miR_155、miR-191、miR-192、miR-203、miR_205、miR_210、miR-212和miR-214)。為了將這些結(jié)果與源自患者的材料相關(guān)聯(lián)，使用上文公開的和圖8中顯示的方法，從循環(huán)系統(tǒng)腫瘤外來體和原始腫瘤分離miRNA部分并作譜。使用mirVanamiRNA陣列標(biāo)記試劑盒，以Cy3標(biāo)記所分離miRNA的3'端。使用包含針對467種成熟人miRNA的探針的微陣列，重復(fù)進(jìn)行兩次miRNA作譜。在雜交之后，使用GenePix4000A陣列掃描儀掃描所述miRNA陣列，使用GeneSpring7.0軟件(SiliconGenetics,RedwoodCity，CA)歸一化和分析原始數(shù)據(jù)。歸一化是通過相對37于添加至每個樣品的對照微RNA(Ambion)表示每個miRNA重復(fù)，使得可在芯片之間進(jìn)行比較來進(jìn)行。在源自外周血的腫瘤外來體和腫瘤之間的比較表明miRNA標(biāo)志沒有顯著差異(圖9)。該方法確證了，至少12種特定miRNA在NSCLC中有升高，并且這12種的相關(guān)性被映射于源自腫瘤的循環(huán)系統(tǒng)外來體中。因此，對這些miRNA的評估可用作它們在所述腫瘤中水平的代表物，因此對癌癥(在這個具體情形下為NSCLC)的存在有診斷價值。實(shí)施例7用于與不利妊娠結(jié)果關(guān)聯(lián)的源自胎盤的外來體miRNA作譜為了確定循環(huán)系統(tǒng)外來體是否包含可診斷不利妊娠結(jié)果(如早產(chǎn))的miRNA，收集來自懷孕的受試者的血清樣品并使用連接于磁珠的抗胎盤堿性磷酸酶抗體分離源自胎盤組織的外來體部分。如上文公開的和圖8中顯示的，從分離的源自胎盤的循環(huán)系統(tǒng)外來體及直接從來自相同受試者的胎盤組織分離miRNA并對其作譜。簡而言之，使用mirVanamiRNA陣列標(biāo)記試劑盒，以Cy3標(biāo)記所分離miRNA的3'端。使用包含針對467種成熟人miRNA的探針的微陣列，重復(fù)進(jìn)行兩次miRNA作譜。在雜交之后，使用GenePix4000A陣列掃描儀掃描所述miRNA陣列，使用GeneSpring7.0軟件(SiliconGenetics,RedwoodCity，CA)歸一化和分析原始數(shù)據(jù)。歸一化是通過相對于添加至每個樣品的對照微RNA(Ambion)表示每個miRNA重復(fù)，使得可在芯片之間進(jìn)行比較來進(jìn)行。結(jié)果在表3中列出。DTI樣品為從懷孕至足月的女性的胎盤組織分離的miRNA。DT2樣品為從懷孕至足月的女性的源自胎盤的外來體分離的miRNA。DT3樣品為從早產(chǎn)(在妊娠32周之前分娩)女性的胎盤組織分離的miRNA。DT4樣品為從早產(chǎn)女性的源自胎盤的外來體分離的miRNA。陰影的單元格表示miRNA存在于測試樣品中。這些數(shù)據(jù)表明，已實(shí)現(xiàn)對源自胎盤的外來體的miRNA作譜并且這些數(shù)據(jù)與來自胎盤的miRNA譜有關(guān)。由此，從胎盤細(xì)胞產(chǎn)生的外來體分離的miRNA的miRNA譜可用于不利妊娠結(jié)果的診斷目的。表3來自源自外周血的胎盤外來體和相關(guān)胎盤組織的miRNA的檢測和定量^<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>^原始數(shù)據(jù)經(jīng)背景消減、Log2_轉(zhuǎn)化及歸一化。每個寡核苷酸探針的強(qiáng)度基于對兩個重復(fù)點(diǎn)進(jìn)行平均。顯示了所有467種人寡核苷酸探針的數(shù)據(jù)?；贚og2(5w非點(diǎn)背景標(biāo)準(zhǔn)差+去頭尾平均陰性對照探針信號)計(jì)算歸一化的閾值?；陉幮詫φ仗结樞盘柕牡?5百分位計(jì)算歸一化的閾值?？偣?36種人探針在至少一個樣品中高于閾值?？偣?58種人探針在至少一個樣品中高于TPT95。本發(fā)明的實(shí)施例證明了對癌癥和不利妊娠結(jié)果的診斷測定的成功應(yīng)用，具有大大優(yōu)于現(xiàn)行可用診斷的特異性、敏感性和陽性預(yù)測的價值；并且還提供了在任何其他測定形式中無法得到的有關(guān)階段、等級和治療反應(yīng)的附加的信息。參考文獻(xiàn)AndreF，SchartzNE，MovassaghM，etal.Malignanteffusionsandimm皿ogenictumour-derivedexosomes.Lancet2002;360:295_305.BardMP，HegmansJP，HemmesA，etal.Proteomicanalysisofexosomesisolatedfromhumanmalignantpleuraleffusions.AmJRespirCellMolBiol2004;31:114-21.BartelDP.MicroRNAs:Genomics，biogenesis,mechanism,andfunction.Cell2004;116:281-97.BerekJS，SchultesBCNicodemusCF.Biologicandimmunologictherapiesforovariancancer.JClinOncol2003;21(sl0):168-74.CalinGA，CroceCM.MicroRNA-cancerconnection:thebeginningofanewtale.CancerRes2006a;66:7390-94.CalinGA，CroceCM.MicroRNAsignaturesinhumancancers.NatureRevCancer2006b;6:857-66.ChoiDS，LeeJM，ParkGW，etal.Proteomicanalysisofmicrovesiclesderivedfromhumancolorectalcancercells.JProteomeRes2007;6:4646—55.DeCeccoL，Marchio皿iL，GariboldiM，ReidJF，LagonigroMS，CaramutaS，etal.Geneexpressionprofilingofadvancedovariancancer:Characteristizationofamolecularsignatureinvolvingfibroblastgrowthfactor2.0ncogene2004;23:8171-83.Esquela-KerscherA，SlackFJ.Oncomirs-microRNAswitharoleincancer.NatureRevCancer2006;6:259-69.HeijnenHFG，SchielAE，F(xiàn)ijnheerR，GeuzeHJ，SixmaJJ.Activationplateletsreleasetwotypesofmembranevesicles:Microvesiclesbysurfacesheddingandexosomesderivedfromexocytosisofmultivesicularbodiesandalphagranules.Blood1999;94:3791-9.IorioMV，VisoneR，DiLevaG，DonatiV，PetroccaF，CasaliniP，etal.MicroRNAsignaturesinhumanovariancancer.CancerRes2007;67:8699—707.J.M.EscolaJM，KleijmeerMJ，StoorvogelW，GriffithJM，Yoshie0，GeuzeHJ.SelectiveenrichmentoftetraspanproteinsontheinternalvesiclesofmultivesicularendosomesandonexosomessecretedbyhumanB—lymphocytes.JBiolChem1998;273:20121-7.KogaK，MatsumotoK，AkiyoshiT，KuboM，etal.Purification,characterizationandbiologicalsignificanceoftumor—derivedexosomes,AnticancerRes2005;25:3703-7.LuJ，GetzG，MiskaEA，Alvarez-SaavedraE，LambJ，PeckD，etal.MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature2005;435:834—8.MearsR，CravenRA，HanrahanS，etal.Proteomicanalysisofmelanoma—derivedexosomesbytwo—dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresisandmassspectrometry.Proteomics2004;4:4019—31.MenonU，JacobsIJ.Recentdevelopmentsinovariancancerscreening.Curr0pin0bstetGynecol2000;12:39-42.MiskaEA.HowmicroRNAscontrolcelldivision,differentiation,anddeath.CurrOpi.GenetDev2005;5:563_8.OlverC，VidalM，Proteomicanalysisofsecretedexosomes.Subcel1Biochem.2007;43:99-131.PaulE.BlowerPE，ChungJH，VerducciJS，LinS，ParkJK，DaiZ，LiuCG，SchmittgenTD,ReinholdWC，CroceCM，WeinsteinJN，SadeeW.MicroRNAsmodulatethechemosensitivityoftumorcells.MolCancerTherap2008;7:1—9.RaposoG，TenzaD，MecheriS，PeronetR，BonnerotC，Desaymard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含所述源自癌癥的外來體的色譜流分。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述色譜流分為外水體積流分。40.權(quán)利要求31的方法，其中使用一種抗癌癥抗原的抗體，通過免疫吸附捕獲使非源自癌癥的外來體與所述源自癌癥的外來體相分離。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述抗癌癥抗原的抗體為抗上皮細(xì)胞粘附分子(抗EpCAM)抗體。42.權(quán)利要求31的方法，其中確定所述一種或多種miRNA的量包括標(biāo)記所述一種或多禾中miRNA。43.權(quán)利要求31的方法，其中確定所述一種或多種miRNA的量包括以各自選擇性結(jié)合所述一種或多種miRNA的一種或多種多核苷酸探針捕獲所述一種或多種miRNA。44.權(quán)利要求31的方法，其中確定所述一種或多種miRNA的量包括使用實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)，以定量測定所述一種或多種miRNA的量。45.權(quán)利要求31的方法，其中所述一種或多種miRNA為表2中列出的一種或多種miRNA。46.權(quán)利要求31的方法，其中所述一種或多種miRNA選自miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR_203、miR_205禾口miR_214。47.權(quán)利要求31的方法，還包括基于所確定的所述一種或多種miRNA的量為所述癌癥選擇一種療法或改變一種療法。48.—種用于診斷受試者中不利妊娠結(jié)果的方法，包括(a)提供來自一個受試者的一個生物樣品；(b)從所述生物樣品分離包含miRNA的外來體；(c)確定一種或多種所述miRNA的量；以及(d)將所述一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平比較，其中，如果來自所述外來體的一種或多種miRNA的量與所述一種或多種miRNA對照的水平相比有可測量的差異，那么所述受試者被診斷具有所述不利妊娠結(jié)果。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述不利妊娠結(jié)果為一種選自胎膜早破、先兆子癇、早產(chǎn)、子宮內(nèi)發(fā)育受限和反復(fù)妊娠丟失的障礙。50.權(quán)利要求48的方法，其中所述受試者為人。51.權(quán)利要求48的方法，其中所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、囊內(nèi)液、胸膜液、腹膜液、腦脊液、淚液、尿液、唾液、痰液或它們的結(jié)合物。52.權(quán)利要求48的方法，其中分離所述外來體包括使用分子排阻色譜來分離所述外來體。53.權(quán)利要求52的方法，其中分離所述外來體進(jìn)一步包括離心包含所述外來體的色譜流分。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述色譜流分為外水體積流分。55.權(quán)利要求48的方法，其中確定所述一種或多種miRNA的量包括標(biāo)記所述一種或多禾中miRNA。56.權(quán)利要求48的方法，其中確定所述一種或多種miRNA的量包括以各自選擇性結(jié)合所述一種或多種miRNA的一種或多種多核苷酸探針捕獲所述一種或多種miRNA。57.權(quán)利要求48的方法，其中確定所述一種或多種miRNA的量包括使用實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)，以定量測定所述一種或多種miRNA的量。58.權(quán)利要求48的方法，還包括基于所確定的所述一種或多種miRNA的量為所述不利妊娠結(jié)果選擇一種療法或改變一種療法。全文摘要本申請公開的主題提供了在受試者中診斷癌癥或不利妊娠結(jié)果的方法，所述方法是通過測量在從所述受試者的生物樣品分離的且源自癌癥的外來體中存在的一種或多種微RNA的量實(shí)施。文檔編號G01N33/53GK101755208SQ200880025224公開日2010年6月23日申請日期2008年7月25日優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日發(fā)明者C·格塞歐-泰勒,D·D·泰勒申請人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會公司