專利名稱：：微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，可以在向其中引入樣品之后順序進行免疫反應(yīng)、清洗過程、底物引入和分析信號產(chǎn)生。
背景技術(shù)：
：隨著科學(xué)技術(shù)的顯著發(fā)展帶來的對生活質(zhì)量大大提高的關(guān)注，對疾病診斷和預(yù)防的重要性、食品質(zhì)量確保和環(huán)境全面監(jiān)測的需求不斷增加。因此，對部位的相關(guān)有機或無機分析物的定量測量非常需要，并且事實上，準(zhǔn)確地確定有機或無機分析物水平的能力對于疾病診斷、食品化學(xué)或工業(yè)化學(xué)領(lǐng)域中的特定質(zhì)量控制過程以及環(huán)境工業(yè)中污染物的監(jiān)測是必不可少的。對于改善相關(guān)有機、無機和生物材料的定量分析的準(zhǔn)確性已經(jīng)進行了許多嘗試ο此外，對于處理和輸送極少量樣品或試劑的技術(shù)的興趣不斷增加，這是因為由于科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微分析成為可能。生物傳感器技術(shù)作為在眾多研究和發(fā)展領(lǐng)域中處理極微量樣品和試劑的方式正在受到高度重視，例如，臨床試驗、新鮮和食品污染的測試、生物過程的控制、環(huán)境監(jiān)測等，因為它允許快速方便地分析各種相關(guān)材料。生物傳感器是一種使用檢測部件來檢測與諸如酶、微生物、抗體、天然或人工受體、DNA探針等生物成分混合的分析物的裝置，其被構(gòu)造成使生物物質(zhì)與電子或生理化學(xué)傳導(dǎo)相關(guān)，使生物物質(zhì)與信號產(chǎn)生元件相關(guān)，造成電活性分析物的物理變化，并檢測分析物或以電化學(xué)、光學(xué)、熱或壓電方式的變化?；诳贵w對抗原特定識別原理而設(shè)計的免疫傳感器顯示出了高選擇性和低檢出限，從而作為醫(yī)療領(lǐng)域中使用的診斷傳感器引起了高度重視。免疫傳感器主要是基于固相夾心酶免疫分析。在固相夾心酶免疫分析中，抗原結(jié)合到固定的抗體上，然后在不同的抗原決定部位與輔助的抗體_酶聯(lián)物締合。已知的是，固相夾心酶免疫分析具有比其他免疫分析更高的靈敏度。例如，在用作固相競爭性免疫分析中的反應(yīng)部位的基質(zhì)中的免疫反應(yīng)可能會由于其他物質(zhì)的空間位阻而中斷。然而，在夾心酶免疫分析的情況下，免疫反應(yīng)僅發(fā)生在抗原決定部位，使它的中斷程度遠(yuǎn)比競爭性免疫分析小，從而產(chǎn)生敏感的信號。在夾心酶免疫分析中，病原體、病毒、細(xì)胞等保持相關(guān)的分析物，并且通常是大尺寸蛋白，它們與固定的抗體結(jié)合、清洗并與輔助抗體_酶聯(lián)物締合。因此，固相上剩余的標(biāo)記酶量與分析物量成比例。在通過清洗去除輔助抗體-酶聯(lián)物后，通過測量與底物的反應(yīng)速率可以檢測出標(biāo)記酶的量。由于顯示出更好的特異性和敏感性，尤其是對于蛋白分析物，因此夾心酶免疫分析廣泛應(yīng)用于臨床上重要的血液蛋白的分析。芯片上的實驗室是一種通過將多種裝置集成在板(或芯片)上形成的化學(xué)微處理器，板(或芯片)的大小只有幾平方厘米，并使用一般用于半導(dǎo)體技術(shù)中的光刻或微加工由玻璃、硅或塑料制成。因此，芯片上的實驗室可以用來以高產(chǎn)量、高效率和低成本地進行自動化實驗。這種微分析系統(tǒng)正逐漸成為最近急劇發(fā)展的制藥業(yè)中的重要技術(shù)，因為它可以大大降低尋找新藥物所需的成本和時間。此外，芯片上的實驗室是可以在各個領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用的核心技術(shù)，包括醫(yī)療診斷儀器、床頭健康監(jiān)測設(shè)備、化學(xué)或生物過程監(jiān)控、環(huán)境污染物測試用便攜式分析設(shè)備、無人化學(xué)/生物試劑檢測/識別裝置等。然而，常規(guī)芯片上的實驗室感應(yīng)器在大規(guī)模生產(chǎn)方面具有有問題的結(jié)構(gòu)。鑒于芯片上的實驗室技術(shù)在大多數(shù)情況下被應(yīng)用于一次性生物化學(xué)傳感器，很難以低成本和高可靠性制造常規(guī)結(jié)構(gòu)。進一步地，芯片上的實驗室中的常規(guī)生物傳感器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因為它們使用微型閥、高壓毛細(xì)管電泳和/或通過通道輸送流體的復(fù)雜微型化機械部件的組合，并且需要清洗過程。為完成本發(fā)明，本發(fā)明人深入研究了易于制作、便于攜帶和構(gòu)造簡單、適合大規(guī)模生產(chǎn)的生物傳感器，其被設(shè)計成方便實用的芯片上的實驗室系統(tǒng)，一旦注入樣品后，借助于順序地通過分別含有抗體_酶聯(lián)物和信號產(chǎn)生底物的分割通道和貯槽以及通過抗體固定的電極而出現(xiàn)的毛細(xì)現(xiàn)象驅(qū)動樣品到總的酶聯(lián)電化學(xué)免疫分析用的清洗通道。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)造簡單、便于攜帶并可大規(guī)模生產(chǎn)的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其包括下板，其上形成有多個參比電極、工作電極、流體感應(yīng)電極和相應(yīng)的電極接頭；中間板，覆蓋在所述下板上，其中包括樣品進入通道；微流體通道，從所述樣品進入通道延伸，用作樣品在整個中間板上流動的導(dǎo)引，并在接近所述樣品進入通道的位置處分成分別設(shè)置酶聯(lián)物貯槽和底物貯槽的兩個分支，所述兩個分支在露出所述參比電極和所述工作電極的檢測通道之前匯合；混合通道，在所述微流體通道匯合位置之前從所述底物貯槽延伸設(shè)置，包括用于使流經(jīng)所述底物貯槽的樣品比流經(jīng)所述酶聯(lián)物貯槽的樣品更晚到達(dá)所述檢測通道的空氣排放通道；吸收通道，吸收從所述檢測通道流出的樣品流體；空氣進入通道，設(shè)置在所述吸收通道的端部；和上板，覆蓋在所述中間板上，用于在形成于所述中間板上的所述微流體通道中誘導(dǎo)毛細(xì)現(xiàn)象。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，所述下板設(shè)有流體感應(yīng)電極，用于檢測到達(dá)所述中間板的吸收通道端部的樣品。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，所述流體感應(yīng)電極被設(shè)置成通過檢測所述樣品的到達(dá)而指示允許所述底物進一步前進的時間點。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，所述下板還設(shè)有用于使檢測到的信號的偏差最小的一個或多個校驗電極。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，所述校驗電極包括用于測量背景信號的第一校驗電極和用于檢測飽和或部分飽和的酶聯(lián)物的飽和信號的第二校驗電極。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，所述中間板還設(shè)有過濾墊通道和過濾墊，它們均用于只選擇所述樣品的一種分析物組分。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，所述過濾墊被設(shè)計成僅將血清引入所述樣品進入通道。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，從所述酶聯(lián)物貯槽流出的樣品比從所述底物貯槽流出的樣品提早預(yù)定時間到達(dá)所述工作電極。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，能夠誘導(dǎo)所述樣品的分析物的免疫反應(yīng)的抗體或分子識別物質(zhì)被固定在所述工作電極上。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，所述檢測通道用于在抗體或分子識別物質(zhì)與分析物的免疫反應(yīng)后發(fā)送經(jīng)酶聯(lián)物和底物流體之間的酶_底物反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)信號，從而產(chǎn)生所述分析物的定量信息。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，所述吸收通道在微流體通道中維持毛細(xì)現(xiàn)象而驅(qū)動所述樣品的移動，使得在所述檢測通道中持續(xù)反應(yīng)，并且所述吸收通道用于提高未反應(yīng)材料的清洗效果，從而產(chǎn)生高敏感的檢測信號。根據(jù)所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的一種優(yōu)選改進，所述上板覆蓋在所述中間板上，使得所述樣品進入通道和所述吸收通道的終端區(qū)露出，從而在所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)上誘導(dǎo)毛細(xì)現(xiàn)象。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供一種使用上述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)來定量分析分析物的方法。根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)允許僅通過毛細(xì)現(xiàn)象驅(qū)動樣品的移動，而沒有額外的操作，并允許在引入樣品后的一個循環(huán)中進行免疫反應(yīng)、清洗和電化學(xué)分析。因此，僅需要很短的測量時間、便于處理并且表現(xiàn)出敏感性和選擇性。此外，由于可以使用簡單方法從常見的有機聚合物制作，因而可以大規(guī)模地生產(chǎn)微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)。基于分析電化學(xué)，所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)可以用作小型傳感器，可以在實際部位使用。圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的分解立體圖。圖2是圖1的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的組裝結(jié)構(gòu)的立體圖和平面圖。圖3是圖1的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的平面圖。圖4是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)中反應(yīng)路線的示圖，沿著該反應(yīng)路線使樣品中所含的相關(guān)分析物反應(yīng)。圖5是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的分解立體圖。圖6是圖5的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的組裝結(jié)構(gòu)的立體圖和平面圖。圖7是圖5的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的平面圖。圖8是在根據(jù)本發(fā)明一個實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)上形成的微流體通道的平面圖。圖9是形成根據(jù)本發(fā)明實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的微流體通道的方法示圖。圖10是通過根據(jù)本發(fā)明實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)測量的電流值對肌紅蛋白量的校準(zhǔn)曲線。附圖標(biāo)記說明100:下板101工作電極102:參比電極103:電極接頭104流體感應(yīng)電極105第一校驗電極106第二校驗電極107流動感應(yīng)電極108生物傳感器確認(rèn)電極200中間板201血液過濾墊通道202血液過濾墊203樣品進入通道204酶聯(lián)物貯槽205底物貯槽206混合通道207空氣排放通道208檢測通道209吸收通道210空氣進入通道300上板具體實施例方式下面參考本發(fā)明，在附圖中相同的附圖標(biāo)記在不同附圖中用于指代相同或相似的部件。參考圖1，示出根據(jù)本發(fā)明一個實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的分解立體圖。其組裝結(jié)構(gòu)的立體圖和平面圖示于圖2中。如圖所示，根據(jù)本發(fā)明一個實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)是一種疊置結(jié)構(gòu)，包括下板100，其上形成有由工作電極101、參比電極102和電極接頭103構(gòu)成的電極單元；中間板200，設(shè)有樣品進入通道203、吸收通道209和微流體通道，微流體通道通過電極單元從樣品進入通道203延伸到吸收通道209；和上板(或蓋子)300。下板100由有機聚合物制成，如聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯等。通過絲網(wǎng)印刷法或物理/化學(xué)氣相沉積法使下板100上的導(dǎo)電材料圖案化形成電極單兀。中間板200可以由與下板100相同的材料制成。可通過壓模工藝提供微流體通道。例如，將由材料制成的雙面膠帶壓在模具上。優(yōu)選地，使用光刻法在干光刻膠膜上制作微流體通道。例如，通過層壓機的滾筒將干光刻膠膜熱粘合在70°C以上溫度的下板100上，然后用其上設(shè)計有微流體通道的光掩模覆蓋，然后用蝕刻劑蝕刻露出部分，在下板100上形成中間層200，微流體通道形成在其中(參見圖9)。用作蓋子的上板300覆蓋在中間板上，從而完成能夠誘導(dǎo)毛細(xì)現(xiàn)象的微流體通道。上板300可以是透明或不透明的，其材料根據(jù)制作微流體通道的方法確定。例如，當(dāng)使用干光刻膠膜來構(gòu)造中間板200時，上板300由有機聚合物制成，粘合劑涂布到與中間板200接觸的面上。上板300放在中間板200上，使得樣品進入通道203和吸收通道209的終端區(qū)露出。因此，露出的終端區(qū)作為空氣進入通道210以誘導(dǎo)毛細(xì)現(xiàn)象。參考圖3，示出圖1的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的去除上板300的平面圖。如圖3所示，在中間板200中，微流體通道被制作成包括樣品進入通道203、酶聯(lián)物貯槽204、底物貯槽205、空氣排放通道207、檢測通道208和吸收通道209，用于保持樣品流動，以誘導(dǎo)連續(xù)反應(yīng)和清洗效果。在樣品進入通道203之后，微流體通道分成兩個通道，其上分別設(shè)置酶聯(lián)物貯槽204和底物貯槽205。在沿著微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的微流體通道流動的同時，樣品中所含的相關(guān)分析物根據(jù)參考圖4所示的反應(yīng)路線反應(yīng)。如圖4所示，引入樣品進入通道中的樣品借助毛細(xì)現(xiàn)象通過兩個分支通道輸送。在沿著分支通道流動的同時，樣品流體溶解分別保存在通道上的貯槽204和205中的酶聯(lián)物和底物。在貯槽204中樣品溶解的酶聯(lián)物與樣品中所含的相關(guān)分析物的特定部位結(jié)合。在接近形成有電極單元的檢測通道208的入口處，樣品流體的流動在兩個分支通道之間變得不同。盡管含有與酶聯(lián)物結(jié)合的分析物的樣品朝著檢測通道208的電極單元移動，但是含有底物的樣品不能進一步前進，而是留在混合通道206中，這是因為從酶聯(lián)物貯槽204流出的樣品的空氣排放阻塞造成的毛細(xì)現(xiàn)象未得以維持。此時，在樣品的分析物和固定在工作電極101上的抗體或分子識別物質(zhì)之間發(fā)生免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)后，當(dāng)空氣排放通道207打開時，保存在混合通道206中的含有底物的樣品由于吸收通道209維持毛細(xì)現(xiàn)象而前進到工作電極101。一旦洗掉在檢測通道208中未反應(yīng)的酶聯(lián)物后，底物誘導(dǎo)信號產(chǎn)生。信號強度根據(jù)分析物濃度變化，從而允許電化學(xué)分析。因此，一旦樣品被引入根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)中，其微流體通道結(jié)構(gòu)允許免疫反應(yīng)、清洗和電化學(xué)分析。參考圖5，示出根據(jù)本發(fā)明另一實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的分解立體圖。其組裝結(jié)構(gòu)示于圖6的立體圖(a)和平面圖(b)中。圖7示出微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的微流體通道結(jié)構(gòu)的平面圖。根據(jù)該實施例，微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)包括在中間層中的過濾墊通道和過濾墊，它們均用于只選擇樣品的一種分析物組分。如圖57所示，血液過濾墊通道201和血液過濾墊202均安裝在樣品進入通道203中。血液過濾墊202被設(shè)計成過濾掉血球并僅將血清引入樣品進入通道203。由于相關(guān)分析物在大多數(shù)情況下存在于血清中并且大尺寸的血球會破壞分析物的測量，因此當(dāng)過濾掉血球時可以更為準(zhǔn)確地分析。此外，根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)優(yōu)選在下板中還包括傳感器裝置，用于檢測樣品到達(dá)中間板的吸收通道的端部。當(dāng)樣品被引入樣品進入通道203并通過酶聯(lián)物貯槽204和檢測通道208移到吸收通道209時，底物從底物貯槽205移到檢測通道208，使得信號可以被檢測到。優(yōu)選地，設(shè)置用于指示底物開始朝著檢測通道208移動的時間點的感應(yīng)裝置104。例如，感應(yīng)裝置可以是流體感應(yīng)電極。當(dāng)感應(yīng)到樣品流入時，位于吸收通道209內(nèi)的流體感應(yīng)電極104可用于讀取微信號，并將其轉(zhuǎn)換成聲音，從而通知用戶引入時間。感應(yīng)裝置可以提高測量結(jié)果的重復(fù)性。感應(yīng)裝置可以根據(jù)吸收通道209的結(jié)構(gòu)布置，優(yōu)選位于吸收通道209的端部區(qū)域，這樣在免疫反應(yīng)完成后可以恰當(dāng)?shù)剡M行清洗過程。通過定量分析引入的樣品，可以確定感應(yīng)裝置后運行的微流體通道的長度和寬度。當(dāng)感應(yīng)裝置檢測到樣品的流入并指示引入時間點時，例如，使用尖銳工具(例如針)物理地形成空氣排放通道207，或者預(yù)先形成的空氣排放通道打開，從而使底物朝著電極單元前進。此后，在檢測通道中電化學(xué)分析樣品的分析物，以確定血液中的分析物水平。檢測通道用于在抗體或分子識別物質(zhì)與分析物的免疫反應(yīng)后發(fā)送經(jīng)酶聯(lián)物和底物流體之間的酶-底物反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)信號，從而產(chǎn)生分析物的定量信息。吸收通道借助于在整個微流體通道中維持毛細(xì)現(xiàn)象而驅(qū)動樣品移動而使得在檢測通道中持續(xù)反應(yīng)方面起作用。此外，吸收通道用于提高未反應(yīng)材料的清洗效果，從而產(chǎn)生高敏感的檢測信號。此外，根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)還包括在下板中的至少一個校驗電極，以盡量減少檢測到的信號的偏差。參考圖8，示出根據(jù)本發(fā)明另一個實施例的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)的平面圖，在檢測通道208中包括兩個自校驗電極(第一校驗電極105和第二校驗電極106)，使用校驗電極，可測量重復(fù)信號，其平均值被確定為標(biāo)準(zhǔn)信號值(背景信號值或飽和信號值)。將由工作電極101檢測到的信號與標(biāo)準(zhǔn)信號值作比較以進行校正，從而可以減少實驗之間的差異。在圖8的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)中，例如，第一校驗電極105用于測量背景信號，工作電極101用于將抗體與相關(guān)分析物固定并根據(jù)分析物濃度測量檢測信號，第二校驗電極106用于檢測飽和或部分飽和的酶聯(lián)物的飽和信號。通過第一校驗電極105，可以檢查在抗體和酶聯(lián)物之間是否發(fā)生非特異性反應(yīng)。第二校驗電極106用于檢查酶聯(lián)物的問題在于其量還是其溶解度。這三個電極(工作電極101、第一校驗電極105和第二校驗電極106)均與參比電極102連接，以測量分析物的濃度。這可以使用檢測器進行。對于校驗電極的數(shù)量或位置沒有限制。根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)可以按下述制作。首先，通過在下板100上印刷或沉積碳或金屬基板形成電極單元(工作電極101、參比電極102、電極接頭103和流體感應(yīng)電極104)。在中間板中形成微流體通道，包括樣品進入通道203、酶聯(lián)物貯槽204、混合通道206、空氣排放通道207、檢測通道208和吸收通道209?？梢允褂脡耗７?通過在熱壓模具上施用一條由有機聚合物制成的雙面膠帶)或使用光刻法(利用干光刻膠膜)來實現(xiàn)微流體通道的形成。此后，將抗體或分子識別物質(zhì)固定在露出的工作電極101上，它們的各自貯槽204和205與酶聯(lián)物和底物連通。在適當(dāng)條件下固定各組分之后，安裝樣品進入通道和空氣進入通道，使得在整個微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)中維持毛細(xì)現(xiàn)象?？梢晕锢砘蚧瘜W(xué)地實現(xiàn)將抗體或分子識別物質(zhì)固定在工作電極101上。在這方面，物理吸附法可用于固定，該方法利用抗體和電極之間的親脂性。經(jīng)稀釋的抗體溶液液滴裝載在工作電極101上，并在適當(dāng)?shù)臈l件下干燥。因此，物理法很簡單，只需要很短時間進行固定。至于化學(xué)法，抗體經(jīng)由共價連接劑附著在電極表面上，如伯胺基團、巰基或碳水化合物，使得功能分子可以在電極表面上長時間地以高密度排列。為了發(fā)揮其功能，涂布在酶聯(lián)物貯槽204上的酶聯(lián)物必須溶解在樣品中。優(yōu)選使用快速冷凍_干燥法，以用酶聯(lián)物涂布酶聯(lián)物貯槽204，然后在添加劑的輔助下溶解。同樣地，蛋白(白蛋白(BSA)、脫脂牛奶、酪蛋白等)和糖類(葡萄糖、蔗糖、海藻糖等)用來制備酶聯(lián)物溶液。蛋白用于維持抗體的活性，防止蛋白酶分解抗體，以及減少非特異性吸收。糖類被用作穩(wěn)定劑，以防止干燥后蛋白結(jié)晶化并保持蛋白結(jié)構(gòu)。此外，表面活性劑(Tween20,Tween80,TritonX-100)用于提高酶的活性。酶聯(lián)物溶液還可以包括對于所用酶的活性所必需的金屬離子。保存在酶聯(lián)物貯槽中的酶可以根據(jù)使用的底物選自各種酶。例如，葡萄糖氧化酶要求葡萄糖作為其底物。堿性磷酸酶與作為底物的對氨基苯基磷酸酯一起使用。對于辣根過氧化物酶，當(dāng)測量減少電流時使用過氧化物。用作標(biāo)記的這些酶使得能夠電化學(xué)檢測分析物。此外，各種抗體或分子識別物質(zhì)可用于本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，以分析生物樣品中的有機物或無機物水平，如環(huán)境樣品、農(nóng)業(yè)樣品或食品樣品。此外，本發(fā)明涉及使用上述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)定量分析分析物的方法。例如，如圖10所示，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)用于根據(jù)肌紅蛋白的量測量電流值時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，電流值與肌紅蛋白水平成比例，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020.18。因此，根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)是非常敏感的并適用于各種分析物的定量分析。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)由于可以從有機聚合物容易地制作，因而可以大規(guī)模地生產(chǎn)。此外，當(dāng)將樣品引入到樣品進入通道中時，由于毛細(xì)現(xiàn)象驅(qū)動移動的原因，其可以在整個微流體通道中移動。因此，上述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)可以用作免疫傳感器，其中樣品可以溶解各組分和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，并且可被洗去和定量測量，從而提供快速和準(zhǔn)確的分析結(jié)果?？梢栽跊]有調(diào)節(jié)值或泵的情況下在毛細(xì)通道中控制樣品流動，使得可以低成本地制作微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，并且可以簡單地操作。因此，上述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)可用作適于各種分析物的生物傳感器。實施方式通過下面的例子可以更好地理解本發(fā)明，這些例子僅是說明性的，而不被解釋為限制本發(fā)明。實施例1制作定量分析肌紅蛋白的微流體傳感器1(1)制備電極和微流體通道使用通常用于半導(dǎo)體技術(shù)中的光刻形成微流體通道。在這方面，丙烯酸酯類涂布的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜用作板。碳糊絲網(wǎng)印刷在膜上，形成工作電極、電極接頭和流體感應(yīng)電極。使用銀漿形成參比電極和電極接頭。將干光刻膠膜熱壓在其上形成電極的膜上，然后使用曝光系統(tǒng)形成微流體通道。使用CAD程序設(shè)計微流體通道，并印刷在OHP膜上，然后用作圖案掩模。在經(jīng)過預(yù)定量的紫外光束曝光后，用2%碳酸鈉溶液蝕刻干光刻膠膜，形成圖案。蝕刻劑保持在30°C下。在遮蔽條件下干燥由此制備的傳感器芯片并保存。(2)抗體、酶聯(lián)物和底物的固定將肌紅蛋白抗體物理地固定在工作電極上。首先，將肌紅蛋白抗體在pH7.2的0.OlM磷酸鹽緩沖液中的稀釋液滴在工作電極上，并在25°C下干燥。涂布在酶聯(lián)物貯槽上的酶聯(lián)物是與堿性磷酸酶結(jié)合的輔助肌紅蛋白抗體，并允許使用夾心酶免疫分析對其進行分析。將預(yù)定量的酶聯(lián)物的稀釋液置于酶聯(lián)物貯槽上，并在25°C下干燥。在含有20mM磷酸鹽緩沖液、PH7.2,0.5%BSA、1%海藻糖、0.聚乙烯醇(PVA)和0.01%Tween20的緩沖液中稀釋酶聯(lián)物。向稀釋緩沖液中加入各種用于在酶聯(lián)物溶解后使其移動的試劑。在底物貯槽中，通過使溶液干燥，濃縮用作堿性磷酸酶的底物的4-氨基苯基磷酸酯。該溶液含有1.OM碳酸鹽緩沖液、0.5%海藻糖、0.05%Tween20和0.5%CMC(羧甲基纖維素)，從而在很短的時間內(nèi)使底物水合。隨后，將用作膠帶一面的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜應(yīng)用到中間板上，從而形成微流體傳感器。實施例2制作定量分析肌紅蛋白的微流體傳感器2按與實施例1所述相同方式制作微流體傳感器，除了在樣品進入通道處設(shè)置血液過濾墊，并且流體感應(yīng)電極安裝在吸收通道的端部區(qū)域。血液過濾墊可從LydallFiltration以LyPoreGrade9389商購得到。與工作電極一樣，使用碳糊制備流體感應(yīng)電極。實施例3制作定量分析肌紅蛋白的微流體傳感器3按與實施例1所述相同方式制作微流體傳感器，除了還安裝兩個校驗電極。兩個校驗電極由碳糊形成，并且用BSA涂布第一校驗電極，用IgG涂布第二校驗電極。用BSA涂布的第一校驗電極用于檢測背景信號，而用與快速試劑盒中對照線一致的IgG涂布的第二校驗電極用于通過與未反應(yīng)的酶聯(lián)物結(jié)合而監(jiān)測酶聯(lián)物溶液，也就是說，用于監(jiān)測飽和信號。實施例4制作定量分析抗生素的微流體傳感器1按與制作定量分析肌紅蛋白的微流體傳感器相同方式，制作定量分析抗生素(例如，四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素、磺胺間二甲氧嘧啶等)的微流體傳感器。使用競爭性酶免疫分析而不是使用夾心酶免疫分析來測量抗生素，因為抗生素的分子量很小。通過將抗體固定在工作電極上，抗生素和酶聯(lián)物可以是競爭性的。將抗生素抗體在pH7.2的0.OlM磷酸鹽緩沖液中的稀釋液滴在工作電極上，并在25°C下干燥。涂布在酶聯(lián)物貯槽上的酶聯(lián)物是抗生素-HRP(辣根過氧化物酶)結(jié)合物，其中使用HRP與抗生素直接結(jié)合。向稀釋緩沖液中加入各種用于在酶聯(lián)物溶解后使其移動的試劑。在底物貯槽中，通過使溶液干燥，濃縮用作HRP的底物的過氧化物和TMB(3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺)。隨后，將用作膠帶一面的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜應(yīng)用到中間板上，從而形成微流體傳感器。實施例5制作定量分析抗生素的微流體傳感器2可以設(shè)計與實施例4不同的競爭性酶免疫分析。將抗生素_蛋白結(jié)合物固定在工作電極上，可以使固定的抗生素-蛋白結(jié)合物和游離抗生素在抗生素抗體_酶聯(lián)物上均變成競爭性的。將抗生素-BSA(或BTG，OVA)物理地固定在工作電極上并干燥。涂布在酶聯(lián)物貯槽上的酶聯(lián)物是使用堿性磷酸酶制備的抗體_酶聯(lián)物。在底物貯槽中，涂布用作堿性磷酸酶的底物的4-氨基苯基磷酸酯。隨后，將膠帶應(yīng)用到中間板上，從而形成微流體傳感器。實驗例1測量肌紅蛋白濃度進行下面的試驗，檢查根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)是否可以用作生物傳感器。將含有濃度0、0.01、0.05、0.1、0.5或1μg/ml的肌紅蛋白的血漿引入按實施例1制作的微流體傳感器的樣品進入通道中。當(dāng)樣品到達(dá)吸收通道的流體感應(yīng)電極時，使用針打開空氣排放通道，使得水合的底物被允許流入電極單元。此后，使用EZ恒電位程序，向每個電極施加+150mV電勢，測量電流60秒。結(jié)果繪制在圖10中，并總結(jié)在下表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從圖10和表1可以看到，電流隨肌紅蛋白的濃度變化，在00.1μg/ml范圍內(nèi)敏感性斜率的線性度為0.786，在0.11μg/ml范圍內(nèi)敏感性斜率的線性度為0.977，這表明該微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)可以用作定量分析生物分析物的生物傳感器。因此，根據(jù)本發(fā)明的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)可用于適于分析各種分析物的生物傳感器。雖然出于說明目的已經(jīng)披露了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在所附權(quán)利要求披露的本發(fā)明范圍和精神內(nèi)可以作出各種修改、添加和替代。權(quán)利要求一種微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其包括下板，其上形成有參比電極、工作電極和電極接頭；中間板，覆蓋在所述下板上，其中包括樣品進入通道；微流體通道，從所述樣品進入通道延伸，用作樣品在整個中間板上流動的導(dǎo)引，并在接近所述樣品進入通道的位置處分成分別設(shè)置酶聯(lián)物貯槽和底物貯槽的兩個分支，所述兩個分支在露出所述參比電極和所述工作電極的檢測通道之前匯合；混合通道，在所述微流體通道匯合位置之前從所述底物貯槽延伸設(shè)置，包括用于使流經(jīng)所述底物貯槽的樣品比流經(jīng)所述酶聯(lián)物貯槽的樣品更晚到達(dá)所述檢測通道的空氣排放通道；吸收通道，吸收從所述檢測通道流出的樣品流體；空氣進入通道，設(shè)置在所述吸收通道的端部；和上板，覆蓋在所述中間板上，用于在形成于所述中間板上的所述微流體通道中誘導(dǎo)毛細(xì)現(xiàn)象。2.如權(quán)利要求1所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述下板設(shè)有流體感應(yīng)電極，用于檢測到達(dá)所述中間板的吸收通道端部的樣品。3.如權(quán)利要求2所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述流體感應(yīng)電極被設(shè)置成通過檢測所述樣品的到達(dá)而指示允許所述底物進一步前進的時間點。4.如權(quán)利要求1所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述下板還設(shè)有用于使檢測到的信號的偏差最小的一個或多個校驗電極。5.如權(quán)利要求4所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述校驗電極包括用于測量背景信號的第一校驗電極和用于檢測飽和或部分飽和的酶聯(lián)物的飽和信號的第二校驗電極。6.如權(quán)利要求1所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述中間板還設(shè)有過濾墊通道和過濾墊，它們均用于只選擇所述樣品的一種分析物組分。7.如權(quán)利要求6所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述過濾墊被設(shè)計成僅將血清引入所述樣品進入通道。8.如權(quán)利要求1所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中從所述酶聯(lián)物貯槽流出的樣品比從所述底物貯槽流出的樣品提早預(yù)定時間到達(dá)所述工作電極。9.如權(quán)利要求1所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中能夠誘導(dǎo)所述樣品的分析物的免疫反應(yīng)的抗體或分子識別物質(zhì)被固定在所述工作電極上。10.如權(quán)利要求1所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述檢測通道用于在抗體或分子識別物質(zhì)與分析物的免疫反應(yīng)后發(fā)送經(jīng)酶聯(lián)物和底物流體之間的酶_底物反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)信號，從而產(chǎn)生所述分析物的定量信息。11.如權(quán)利要求1所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述吸收通道在微流體通道中維持毛細(xì)現(xiàn)象而驅(qū)動所述樣品的移動，使得在所述檢測通道中持續(xù)反應(yīng)，并且所述吸收通道用于提高未反應(yīng)材料的清洗效果，從而產(chǎn)生高敏感的檢測信號。12.如權(quán)利要求1所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述上板覆蓋在所述中間板上，使得所述樣品進入通道和所述吸收通道的終端區(qū)露出，從而在所述微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)上誘導(dǎo)毛細(xì)現(xiàn)象。13.一種使用權(quán)利要求112中任一項所述的微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)來定量分析分析物的方法。全文摘要本發(fā)明公開一種微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)，其包括下板、中間板和上板。參比電極、工作電極和電極接頭形成在該下板上。該中間板中包括微流體通道。該上板覆蓋在該中間板上，用于在形成于該中間板上的該微流體通道中誘導(dǎo)毛細(xì)現(xiàn)象。該微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)允許僅通過毛細(xì)現(xiàn)象驅(qū)動樣品的移動，而沒有額外的操作，并允許在引入樣品后的一個循環(huán)中進行免疫反應(yīng)、清洗和電化學(xué)分析。因此，僅需要很短的測量時間、便于處理并且表現(xiàn)出敏感性和選擇性。此外，由于可以使用簡單方法從常見的有機聚合物制作，因而可以大規(guī)模地生產(chǎn)?；诜治鲭娀瘜W(xué)，該微流體傳感器復(fù)合結(jié)構(gòu)可以用作小型傳感器，可以在實際部位使用。文檔編號G01N33/49GK101821620SQ200880102829公開日2010年9月1日申請日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日發(fā)明者南學(xué)鉉,崔文姬,樸柱憲,車根植,鄭承賢,金英勛申請人:愛-森斯株式會社;納米-迪泰克有限公司