專利名稱：用于檢測生物靶點(diǎn)的快速和靈敏的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測生物樣品中的至少一種生物標(biāo)志。因此，本發(fā)明還提供檢測給定樣品中的多種(例如兩種、三種)生物標(biāo)志，因此其提供獲得數(shù)據(jù)的方法，所述數(shù)據(jù)(例如)為診斷信息、生物標(biāo)志的相關(guān)表達(dá)、蛋白、基因、或一種或多種蛋白和一種或多種基因的組合的組(panel)的數(shù)據(jù)。作為例子(但非限制性的)，例如可在癌癥診斷分析(例如乳腺癌分析)中同時(shí)篩選HER2蛋白和HER2基因。另一個(gè)非限制性例子包括(例如)篩選三種標(biāo)志以檢測子宮癌。標(biāo)志可包括Ki67/mib-1和細(xì)胞增殖標(biāo)志p16(INK4a)、以及諸如蛋白或核酸之類的用于人乳頭瘤病毒的標(biāo)志。然而另一個(gè)非限制性例子包括篩選與前列腺癌有關(guān)的多個(gè)標(biāo)志。這些標(biāo)志可包括AMACR P504S、聚合物量細(xì)胞角蛋白(HMW-CK)、和p63。篩選標(biāo)志的這種組合提供了一種從惡性前列腺腫瘤中區(qū)別良性前列腺腫瘤的方法。
例如在檢測多種標(biāo)志時(shí)需要使交聯(lián)劑之間的交叉反應(yīng)性最小化。這可通過在檢測步驟中使用不同探針和不同報(bào)道分子來實(shí)現(xiàn)。這種體系的例子示于圖3中，其中使用下列步驟來檢測兩種不同生物標(biāo)志，例如兩種不同細(xì)胞受體 (1)孵育樣品和第一探針1(1P1)(例如HRP偶聯(lián)的抗體AB1)； (2)在存在交聯(lián)劑(例如DAB)的條件下孵育樣品(1)和報(bào)道子1(R1)(例如阿魏酸-PNA1偶聯(lián)物)； (3)孵育樣品(2)和過氧化氫(＞3％v/v)； (4)孵育樣品(3)和第一探針2(1P2)(例如HRP-偶聯(lián)的抗體AB2)； (5)孵育樣品(4)和報(bào)道子2(R2)(例如阿魏酸-PNA2偶聯(lián)物)； (6)孵育樣品(5)和第二探針1(2P1)(例如PNA1’-FITC)以及第二探針2(2P2)(例如PNA2’-德克薩斯紅)。
結(jié)果，從R1沉積的靶位點(diǎn)中檢測到綠色熒光信號(從PNA1’-FITC發(fā)出)，從R2沉積的靶位點(diǎn)中檢測到紅色熒光信號(從PNA2’-德克薩斯紅發(fā)出)，并且從R1和R2沉積的靶位點(diǎn)(即同時(shí)存在靶A1和A2的位點(diǎn))中檢測到黃色熒光信號。
該方法的所有步驟(從(a)至(c))可在2-20分鐘內(nèi)完成。這種快速檢測可有利地用于自動(dòng)或半自動(dòng)檢測靶生物標(biāo)志。自動(dòng)染色裝置是本領(lǐng)域中已知的，并且該方法可適用于這些裝置。
自動(dòng)染色裝置可用在本發(fā)明的多種實(shí)施方式中，例如用于檢測多種生物標(biāo)志。檢測多種生物標(biāo)志通常需要從不同可檢測物質(zhì)中發(fā)出的信號的平衡。自動(dòng)步驟可包括多個(gè)將從靶生物標(biāo)志中發(fā)出的信號放大的步驟。當(dāng)檢測多種標(biāo)志時(shí)這是特別有利的。
抗體探針 術(shù)語“探針”是指可與靶特異性結(jié)合的物質(zhì)，其中靶可以是生物標(biāo)志、另外探針、報(bào)道子、或任何與所述生物標(biāo)志、另外探針或報(bào)道子有關(guān)的分子。
在一個(gè)實(shí)施方式中，探針為抗體探針。
在本文中使用的抗體是指免疫球蛋白或其一部分，其包括任何包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽，而不論其來源、制備方法和其他特性如何。該術(shù)語包括(例如)多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、人源化、單鏈、嵌合、合成、重組、雜交、變異和CDR移植的抗體。一部分抗體可包括任何仍能夠結(jié)合抗原的片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv?？贵w來源通過基因組序列來限定，而不論制備方法如何。
本文中使用的第一抗體是指與生物樣品內(nèi)存在的目標(biāo)生物標(biāo)志特異性結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方式中，第一抗體可聚合。第一抗體可衍生自任何溫血種類，例如哺乳動(dòng)物、鳥。
本文中使用的第二抗體是指具有這樣的抗原結(jié)合域的抗體，所述抗原結(jié)合域與第一探針(例如第一抗體)、或沉積在靶位點(diǎn)中的半抗原、或者直接或間接與第一探針連接的半抗原特異性結(jié)合。
本文中使用的第三抗體是指具有這樣的抗原結(jié)合域的抗體，所述抗原結(jié)合域與第二探針(例如第二抗體)、或與第二探針連接的半抗原、或與偶聯(lián)至第二探針的聚合物連接的半抗原、或沉積在靶位點(diǎn)中的半抗原特異性結(jié)合。
有時(shí)抗體可同時(shí)起到第二抗體和第三抗體的作用。
本發(fā)明中使用的抗體(包括第一抗體、第二抗體和第三抗體)可衍生自任何哺乳動(dòng)物種類，例如小鼠、大鼠、山羊、豚鼠、驢、兔、馬、羊駝(lama)、駱駝、或任何鳥類種類(例如雞、鴨)。本文中使用的衍生自任何哺乳動(dòng)物或鳥類種類是指編碼特定抗體的至少一部分核酸序列源自特定哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、山羊、或兔)或特定鳥類(例如雞、鴨)的基因組序列?？贵w可以是任何同型，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、或任何亞類，例如IgG1、lgG2、lgG3、lgG4。
在某些實(shí)施方式中，第一抗體含有可與生物樣品包含的細(xì)胞表達(dá)的生物標(biāo)志特異性結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)域。所述標(biāo)志可表達(dá)在細(xì)胞表面上，或在細(xì)胞膜內(nèi)(即在細(xì)胞的內(nèi)部，例如在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、在細(xì)胞核內(nèi)、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi))。在一些實(shí)施方式中，生物標(biāo)志選自細(xì)胞，因此存在于溶液中，例如在細(xì)胞培養(yǎng)基中、在血液或血漿中。
在某些實(shí)施方式中，第二抗體含有與第一抗體特異性結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)域，例如第一抗體的恒定區(qū)域。在某些實(shí)施方式中，第二抗體與聚合物偶聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，聚合物與2-20種第二抗體偶聯(lián)。在其他實(shí)施方式中，聚合物與2-10種第二抗體偶聯(lián)。
在某些實(shí)施方式中，第三抗體含有與第二抗體特異性結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)域，例如第二抗體的恒定區(qū)域、或與第二抗體連接的半抗原、或與第二抗體偶聯(lián)的聚合物。在某些實(shí)施方式中，第三抗體與聚合物偶聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，聚合物與1-20種第三抗體偶聯(lián)。在其他實(shí)施方式中，聚合物與1-5種第三抗體偶聯(lián)。
本發(fā)明的方法和組合物中可使用的抗體包括單克隆和多克隆抗體、工程化抗體，包括使用噬菌體展示技術(shù)或可選擇的技術(shù)制備的嵌合、CDR移植和人工選擇的抗體。
已經(jīng)公開了多種制備抗體的技術(shù)，例如參見Kohler和Milstein，(1975)Nature 256495、Harlow和Lane，Antibodiesa Laboratory Manual，(1988)(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)，其通過引用的方式并入本文。制備重組抗體分子的技術(shù)在上述參考文獻(xiàn)中有所公開，此外還在(例如)EP 0623679、EP 0368684和EP 0436597中有所公開。
可以以重組或合成的方式來制備抗體。編碼抗體的核酸可分離自cDNA庫。編碼抗體的核酸可分離自噬菌體庫(例如參見McCafferty et al.1990，Nature 348552，Kang et al.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884363、EP 0 589877 B1)。編碼抗體的核酸可通過已知序列的基因改組來獲得(Mark et al.1992，Bio/Technol.10779)。編碼抗體的核酸可通過體內(nèi)重組來分離(Waterhouse et al.1993，Nucl.Acid Res.212265)。本發(fā)明的方法和組合物中使用的抗體包括人源化免疫球蛋白(美國專利No.5,585,089，Jones et al.1986，Nature 332323)。
所述抗體可以是包含效應(yīng)子蛋白(例如毒素或標(biāo)記(例如可檢測物質(zhì)))的改變抗體。
抗體可得自動(dòng)物血清，或在單克隆抗體或其片段的情況下在細(xì)胞培養(yǎng)基中制得。根據(jù)建立的方法，重組DNA技術(shù)可用于在細(xì)菌、酵母菌、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中制備抗體。在某些實(shí)施方式中，選擇的細(xì)胞培養(yǎng)基體系優(yōu)選分泌抗體產(chǎn)物。
核酸探針 在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一探針可以是或包含核酸或核酸類似物分子(例如DNA分子、RNA分子、PNA分子)以用在原位雜交中。核酸探針可以化學(xué)合成，或在細(xì)胞中重組制備(例如參見Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press)。在一些實(shí)施方式中，探針包含肽核酸(PNA)。肽核酸為核酸分子，其中通常存在于DNA和RNA中的脫氧核糖或核糖骨架被肽骨架取代。制備PNA的方法是本領(lǐng)域已知的(例如參見Nielson，2001，Current Opinion inBiotechnology 1216)(通過引用的方式并入本文)。在其他實(shí)施方式中，探針包含鎖核酸(LNA)(Sorenson et al.2003，Chem.Commun.7(17)2130)。在一些實(shí)施方式中，核酸探針與生物標(biāo)志(例如生物樣品中所含的核酸分子)特異性結(jié)合。
在特定實(shí)施方式中，核酸探針至少包含與生物樣品中的靶序列(例如核酸序列(例如基因組DNA序列或mRNA序列))在特定嚴(yán)格條件下特異性雜交的序列。在本文中使用的術(shù)語“在特定嚴(yán)格條件下雜交”旨在描述在彼此顯著互補(bǔ)的核苷酸序列保持彼此結(jié)合的情況下雜交和洗滌的條件。該條件為使得至少70％、至少80％、至少85-90％互補(bǔ)的序列保持彼此結(jié)合。互補(bǔ)百分率按照下列文獻(xiàn)所述來測定Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402(通過引用的方式并入本文)。
具體的嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域已知的，并且可在下列文獻(xiàn)中找到CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(Ausubel et al.1995eds.)，第2、4和6章(通過引用的方式并入本文)。另外，具體的嚴(yán)格條件在下列文獻(xiàn)中有所描述Sambrook et al.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press，第7、9和11節(jié)(通過引用的方式并入本文)。在一些實(shí)施方式中，雜交條件為高度嚴(yán)格條件。高度嚴(yán)格雜交條件的例子為在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在65-70℃下雜交或在4X SSC和50％甲醛中在42-50℃下雜交，然后在1X SSC中在65-70℃下進(jìn)行一次或多次洗滌。應(yīng)理解另外試劑可加入雜交和/或洗滌緩沖液中，例如封閉劑(BSA或鮭魚精子DNA)、去污劑(SDS)、螯合劑(EDTA)、Ficoll、PVP等。
在一些實(shí)施方式中，核酸探針與樣品中的靶序列在中度嚴(yán)格條件下雜交。本文中使用的中度嚴(yán)格雜交條件包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于(例如)DNA的長度可以容易地確定的條件。示例性條件在下列文獻(xiàn)中有所闡述Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(通過引用的方式并入本文)，并且包括使用預(yù)洗滌液(5X SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0))，雜交條件為50％的甲醛、6X SSC、在42℃下(或其他類似的雜交溶液，例如在50％甲醛中的Stark’s溶液、在42℃下)，洗滌條件為60℃、0.5X SSC、0.1％SDS。
在一些實(shí)施方式中，核酸探針與樣品中的靶序列在低度嚴(yán)格條件下雜交。本文中使用的低度嚴(yán)格雜交條件可包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于(例如)DNA的長度可以容易地確定的條件。低度嚴(yán)格雜交條件可包括(例如)在40℃下、在含有35％甲酰胺、5x SSC、50mM Tris-HCI(pH 7.5)、5mMEDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml變性鮭魚精子DNA的溶液中預(yù)處理DNA6小時(shí)。在相同溶液中進(jìn)行雜交，不同之處在于進(jìn)行下列改變0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml變性鮭魚精子DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20x106 CPM探針。將樣品在雜交混合物中在40℃下孵育18-20小時(shí)，然后在55℃下在含有2x SSC、25mMTris-HCI(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗滌1.5小時(shí)。將洗滌液用新鮮溶液取代，并在60℃下另外孵育1.5小時(shí)。
探針的其他實(shí)施方式包括肽序列，例如所述肽序列衍生自不同蛋白的蛋白或核酸結(jié)合域、不同細(xì)胞和細(xì)胞核受體以及它們的衍生物的配體、可與大的生物分子的某些結(jié)構(gòu)單元特異性結(jié)合的小分子，然而這僅僅列出了可用作本發(fā)明的目的的探針的物質(zhì)的非限制性例子。
實(shí)施例 1.本發(fā)明的報(bào)道子和交聯(lián)劑分子的實(shí)施例 縮寫 MBHA 4-甲基二苯甲基胺 NMPN-甲基吡咯烷酮 HATU 2-(1h-7-疊氮苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽； 甜菜堿 DIPEA 二異丙基乙胺 DCM二氯甲烷 TFA三氟乙酸 TFMSA 三氟甲基磺酸 Fer阿魏酸 FLU熒光素 Tyr酪氨酸 Lys賴氨酸 Dex葡聚糖 HPLC 高效液相色譜法 equi. 當(dāng)量 1.1.Fer-L30-Lys(Flu)-NH2(D17158) 使用Fmoc-Lys(ivDDE)來卸載MBHA樹脂至負(fù)載量為150微摩爾/g。使用在NMP中的20％的哌啶使200mg樹脂去Fmoc化，并用Boc-L30-OH(1.5mL，在NMP中0.26M，使用0.9當(dāng)量的HATU、2當(dāng)量的DIPEA預(yù)活化2分鐘)進(jìn)行一次20分鐘的偶聯(lián)。使用NMP中的5％的肼來除去ivDDE基團(tuán)，用羧基熒光素(Flu)(1.5mL，在NMP中0.2M，使用0.9當(dāng)量的HATU、2當(dāng)量的DIPEA預(yù)活化2分鐘)標(biāo)記賴氨酸側(cè)鏈2x20分鐘。使用在NMP、NMP、DCM、然后DCM中20％的哌啶處理樹脂。使用TFA∶TFMSA∶間甲酚(7∶2∶1，1.5ml，1小時(shí))將中間產(chǎn)物H-L30-Lys(Flu)-NH2從樹脂上分開，使用二乙基醚沉淀，重新懸浮在TFA，使用二乙基醚沉淀，重新懸浮在NMP，再次使用二乙基醚沉淀。使用100微升DIPEA將其制成堿性，并直接溶解在用0.9當(dāng)量的HATU和2當(dāng)量的DIPEA預(yù)活化的0.5mL 0.3M的阿魏酸中。在25分鐘后，將粗產(chǎn)物用二乙基醚沉淀，并溶解在450微升NMP和50微升乙二胺中。在5分鐘后，將產(chǎn)物用二乙基醚沉淀，并溶解在水中的15％乙腈(8mL)中，使用100微升TFA進(jìn)行酸化，并進(jìn)行RP-HPLC純化。
1.2.Fer-L150-Lys(Flu)-NH2(D17157) 使用Boc-Lys(Fmoc)來卸載MBHA樹脂至負(fù)載量為100微摩爾/g。用Boc-L30-OH對100mg樹脂進(jìn)行5次偶聯(lián)循環(huán)(a.如1中那樣使用Boc-L30-OH進(jìn)行偶聯(lián)。b.使用在NMP∶吡啶1∶1中2％的乙酸酐封端2分鐘。c.使用在TFA中的5％的間甲酚去Boc化2x5分鐘)。將賴氨酸側(cè)鏈去Fmoc化，并如1中那樣使用羧基熒光素標(biāo)記。將中間產(chǎn)物H-L150-Lys(Flu)-NH2從樹脂上分開，并用阿魏酸標(biāo)記N末端，然后如1.1那樣進(jìn)行純化。
1.3.βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16127) 使用標(biāo)準(zhǔn)固相化學(xué)法(如1.1和1.2)在0.5g的MBHA樹脂上制備Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)。使用在NMP中的20％的哌啶從賴氨酸側(cè)鏈中除去Fmoc基團(tuán)，然后使化合物進(jìn)行重復(fù)的羧基熒光素標(biāo)記(3x30分鐘)。在使用TFA除去Boc基團(tuán)后，在固相上使用β-丙氨酸-N，N-二乙酸(βα)叔丁基酯標(biāo)記N末端。在從樹脂上分開并進(jìn)行HPLC純化后，分離βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2。
1.4.H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16126) 制備Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)樹脂，并使用1.3中所述的方法利用熒光素來標(biāo)記。在除去Boc基團(tuán)后，使用N-Boc-S(4-甲氧基芐基)-Cys-OH來標(biāo)記N末端。將化合物從柱上分開，并通過HPLC純化。
分子1.1、1.2、1.3和1.4為包含熒光素殘基的報(bào)道子的非限制性實(shí)施方式。
1.5.Fer-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2(D17128) 將Boc-Lys(Fmoc)(2個(gè)循環(huán))、Boc-L30-OH(5個(gè)循環(huán))和Boc-Lys(2CIZ)-OH依次偶聯(lián)至MBHA樹脂。在存在10％的茴香硫醚清除劑的條件下將中間產(chǎn)物從樹脂分開，從而除去2CIZ基團(tuán)。如1.1那樣使用阿魏酸標(biāo)記N末端和5個(gè)脫保護(hù)的賴氨酸側(cè)鏈(2x30分鐘)。然后在純化之前使用在NMP中的10％的乙二胺除去C末端賴氨酸殘基中的N上的Fmoc基團(tuán)。
1.6.Fer-(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH-βα((L90-Lys(Flu))3-NH2)-NH2(D17134) 將500nmol的βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(化合物1.4)溶解在88微升NMP和2微升吡啶中，并通過與10微升二異丙基碳二亞胺反應(yīng)10分鐘來轉(zhuǎn)化成環(huán)狀酸酐。將該酸酐用二乙基醚沉淀，然后將小球溶解在包含250nmol的Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2的100微升NMP中。在20分鐘后，加入5微升乙二胺，在5分鐘后將產(chǎn)物用二乙基醚沉淀，酸化，然后進(jìn)行HPLC純化。
1.7.Ac-(Tyr(OH)-L30)6-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-Lys(Flu)-NH2(D18044) 在MBHA樹脂上制備Ac-(Tyr(2BrZ)-L30)6-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)。在固相上除去Fmoc基團(tuán)，并且使用羧基熒光素來標(biāo)記賴氨酸側(cè)鏈。在從樹脂上分開后，將產(chǎn)物進(jìn)行HPLC純化。
1.8. Fer-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2(D17140) 在MBHA樹脂上制備Boc-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L30-Lys(Fmoc)。在從樹脂上分開后，通過沉淀來分離中間產(chǎn)物H-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L30-Lys(Fmoc)，并如1.1那樣用阿魏酸標(biāo)記。通過HPLC來分離最終產(chǎn)物。
例子1.5.-1.8.是具有下式的交聯(lián)劑分子的例子 (R1)n-(X)q-R2(m)， 其中 R1和R2為不同的HRP的底物部分(例如Fer或Tyr)， X為具有下式的連接分子
其中R3和R4為Lys的殘基，并且m、n和q為1至6。
具有熒光素、阿魏酸(1.6)和/或酪氨酸(1.7)的數(shù)個(gè)殘基的線性聚合物交聯(lián)劑(例如上述分子1.6.和1.7.)也是可在存在另外交聯(lián)劑(例如DAB)的條件下被HRP沉積的報(bào)道子的實(shí)施方式。當(dāng)HRP酶部分與不容易在(例如)細(xì)胞核(例如DNA)中受到影響或暴露的靶位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，這種線性、相對低分子量(MW＜15kDa)的交聯(lián)劑/報(bào)道子可以是特別有用的。當(dāng)過氧化物酶部分位于更容易受到影響的靶位點(diǎn)中時(shí)，可使用大的報(bào)道分子，例如含有與數(shù)十和數(shù)百個(gè)標(biāo)記(例如Flu和/或Fer和/或Tyr)偶聯(lián)的葡聚糖分子(例如下述分子1.9.)的報(bào)道子。
1.9.與交聯(lián)劑1.5.和交聯(lián)劑1.4.偶聯(lián)的Dex70(D17130) 使10nmol的葡聚糖(MW 70kDa，用二乙烯基砜活化)與500nmol的Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2(化合物1.5)在總體積300微升的0.16M的NaHCO3(pH9.5)中在40℃下反應(yīng)30分鐘。在觀察到少量沉淀后，進(jìn)一步加入100微升的水，并使反應(yīng)進(jìn)行另外30分鐘。進(jìn)一步加入200微升的0.15M的NaHCO3和500nmol的H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(化合物1.4)。在40℃下1小時(shí)后，通過加入50微升的0.165M的半胱氨酸使反應(yīng)混合物淬火30分鐘，將溶液過濾，將產(chǎn)物通過FPLC在superdex200上用在含有10mM CHES、pH 9.0和0.1M NaCl的水溶液中的20％EtOH進(jìn)行純化。洗脫產(chǎn)物為包含約56個(gè)熒光素和113個(gè)阿魏酸殘基的葡聚糖偶聯(lián)物。
1.10.山羊-抗-小鼠-Dex70-HRP(D18033) 將葡聚糖(70kDA MW)用13.7nmol的二乙烯基砜活化，并在600微升緩沖液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和602nmol HRP在30℃下反應(yīng)3小時(shí)。然后加入在105微升水中的41.1nmol的山羊-抗-小鼠F(ab)2抗體，繼續(xù)反應(yīng)另外16小時(shí)。通過加入70微升的0.165M的半胱氨酸來使反應(yīng)混合物淬火30分鐘，將產(chǎn)物在superdex 200上在100mM NaCl、10mM HEPES(pH 7.2)中純化。洗脫產(chǎn)物為包含山羊-抗-小鼠(GaM)和HRP的葡聚糖偶聯(lián)物(dex∶GaM∶HRP的比＝1∶1∶1)。
1.11.抗-FITC-Dex70-HRP(D18058) 將葡聚糖(70kDA MW)用10nmol的二乙烯基砜活化，并在400微升緩沖液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和440nmol的HRP在30℃下反應(yīng)3小時(shí)。然后，加入在80微升水中的30nmol的抗-小鼠F(ab)2抗體，在40℃下繼續(xù)反應(yīng)另外90分鐘。通過加入50微升的0.165M的半胱氨酸來使反應(yīng)混合物淬火30分鐘，將產(chǎn)物在superdex 200上在100mM NaCl、10mM HEPES(pH 7.2)中純化。洗脫產(chǎn)物為具有抗-FITC和HRP的葡聚糖偶聯(lián)物(dex/抗-FITC/HRP比＝1/2/9)。
1.12.抗-FITC-Dex70-HRP(D17030) 將葡聚糖(70kDA MW)用10nmol的二乙烯基砜活化，并在374微升緩沖液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和440nmol HRP以及25nmol F(ab)2抗-FITC在30℃下反應(yīng)16。通過加入50微升的0.165M的半胱氨酸來使反應(yīng)混合物淬火30分鐘，將產(chǎn)物在superdex 200上在100mMNaCl、10mM HEPES(pH7.2)中純化。洗脫產(chǎn)物為包含抗-FITC和HRP的葡聚糖偶聯(lián)物(比為1∶1∶1)。
分子1.10、1.11和1.12表示可用作檢測沉積的報(bào)道分子的探針的抗體-葡聚糖-HRP偶聯(lián)物的實(shí)施方式。偶聯(lián)物1.10.還可用作檢測與沉積的報(bào)道子結(jié)合的探針的另外的探針(例如上述在檢測靶位點(diǎn)中的標(biāo)志的方法中的步驟(b)中)。
3.使用本發(fā)明的方法進(jìn)行IHC染色的實(shí)施例 在福爾馬林固定、石蠟嵌入的扁桃體上進(jìn)行IHC。將3-5個(gè)微切片切削、烘烤并儲存在4℃下直到使用為止。然后通過二甲苯(2x5分鐘)、99％乙醇(2x2分鐘)、70％乙醇(2x2分鐘)、并最終通過水來除去石蠟。將玻片置于靶修復(fù)溶液(pH 9)(DAKO S2367)中，然后在微波爐中加熱(沸騰10分鐘)。此后，使玻片冷卻，然后轉(zhuǎn)移至洗滌緩沖液(DAKO S3006)。該步驟后面是使用3％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性5分鐘的步驟，然后再次將玻片轉(zhuǎn)移至洗滌緩沖液中，然后進(jìn)行染色。為了使玻片與玻片之間差異最小化，在相同日子使用連續(xù)切片進(jìn)行各種比較試驗(yàn)。使用從0至4的評分等級來對具體和背景信號進(jìn)行評分，其中0表示根本沒有染色，1表示較弱程度染色，2表示中等程度染色，3表示較強(qiáng)程度染色，4表示過度染色。
IHC試驗(yàn)1. 將細(xì)胞角蛋白、山羊-抗-小鼠-HRP和抗-FITC-HRP分別稀釋在BCPT-緩沖液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。將報(bào)道子D17128和DAB(DAKO K5007C)稀釋在DAB的底物緩沖液(DAKO K5007 B)中。所有孵育持續(xù)5分鐘，接著在DAKO洗滌緩沖液中洗滌2分鐘，除了在孵育后使用D17128的情況以外，在該情況中在10mM CHES(pH 9)+0.1％Tween20中進(jìn)行洗滌。下表和描述概括了試驗(yàn)的實(shí)施方式 玻片1-標(biāo)準(zhǔn)DAB-HRP染色(沒有放大)。標(biāo)準(zhǔn)DAB DAKO試劑(K7005C)含有3mM DAB。
玻片4-在存在1mM DAB-GaM-HRP偶聯(lián)物D18033(與玻片1相比其稀釋25倍)的條件下沉積報(bào)道子D17128-一步放大。
玻片7和玻片9-與玻片1相比進(jìn)一步稀釋GaM-HRP偶聯(lián)物D18033，并且進(jìn)行另外的報(bào)道子沉積步驟。
玻片1、4和7都具體染色評分為2.5至3。由于在存在DAB的條件下沉積報(bào)道子D17128、接著通過抗-FITC-HRP探針D17030來識別該報(bào)道子，因此獲得放大250倍的信號(與玻片1相比的玻片9)。玻片7和9的明顯染色保持鮮明(即非擴(kuò)散的)，其中染色和未染色區(qū)域之間的強(qiáng)烈邊界表明在沉積位點(diǎn)發(fā)生非常少的擴(kuò)散。
IHC試驗(yàn)2. 將細(xì)胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP都稀釋在BCPT-緩沖液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。將D17128和DAB(DAKO K5007 C)稀釋在DAB的底物緩沖液(DAKO K5007 B)中。所有孵育持續(xù)5分鐘，接著在DAKO S3006中洗滌2分鐘，除了在孵育后使用D17128的情況以外，在該情況中在10mMCHES(pH 9)+0.1％Tween20中進(jìn)行洗滌。
下表和描述概括了試驗(yàn)的實(shí)施方式 玻片12和14強(qiáng)烈和特異性地染色(評分都為2)，而玻片9未被染色(評分為0)。結(jié)果表明在沒有交聯(lián)劑(例如DAB(玻片14)或D17140(玻片12))的情況下HRP不會引起報(bào)道子沉淀。
試驗(yàn)進(jìn)一步示出減少預(yù)孵育(10分鐘)第一抗體和第二抗體-HRP偶聯(lián)物的步驟次數(shù)的可能性。
IHC試驗(yàn)3. 將細(xì)胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP分別稀釋在BCPT-緩沖液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。將D17128和DAB(DAKO K5007C)稀釋在DAB的底物緩沖液(DAKO K5007B)中。所有孵育持續(xù)5分鐘，接著在DAKO S3006中洗滌2分鐘，除了在孵育后使用D17128和D18044的情況以外，在該情況中在10mM CHES(pH 9)+0.1％Tween20中進(jìn)行洗滌。當(dāng)具有DAB的玻片(玻片3和5)在底物緩沖液中進(jìn)行第三孵育步驟時(shí)，孵育時(shí)間為1分鐘。
下表和描述概括了試驗(yàn)的實(shí)施方式 玻片2是染色密度最高的玻片(評分3)，這表明第三步驟的對于玻片3(評分2，5)特別施加1分鐘的DAB不是很大改善，而是相當(dāng)輕微降低染色密度。在缺乏交聯(lián)劑的條件下對于缺乏對于玻片4(評分0)的染色符合IHC試驗(yàn)2(上述)中獲得的結(jié)果。在玻片5(其中在施加報(bào)道子偶聯(lián)物D17128之前施加DAB)上觀察到染色(評分2)，盡管這些染色不如玻片3上的染色那樣密度高。
該結(jié)果表明在孵育具有報(bào)道子和交聯(lián)劑的玻片(即預(yù)孵育步驟)之前可以首先在單獨(dú)步驟施加交聯(lián)劑。所觀察到的在沉積標(biāo)記的報(bào)道子前施加DAB的另一種積極作用是明顯降低背景染色(玻片2評分為0.5-1，玻片3評分為0)，盡管特定信號強(qiáng)度并沒有降低太多。在許多情況下通過在沉積前1分鐘的額外DAB步驟，實(shí)質(zhì)上消除了與山羊-抗-小鼠-HRP偶聯(lián)物的非特異性結(jié)合有關(guān)的特別弱的擴(kuò)散背景染色。
IHC試驗(yàn)4. 將細(xì)胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP全部稀釋在BCPT-緩沖液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。將D17128、D18044和DAB(DAKO K5007C)稀釋在DAB的底物緩沖液(DAKO K5007B)中。所有孵育持續(xù)5分鐘，接著在DAKO S3006中洗滌2分鐘，除了在孵育后使用D17128和D18044的情況以外，在該情況中在10mM CHES(pH9)+0.1％Tween20中進(jìn)行洗滌。
下表和描述概括了試驗(yàn)的實(shí)施方式 該試驗(yàn)示出了交聯(lián)劑濃度對于兩種不同類型的報(bào)道子沉積的影響。玻片9是染色濃度最高的玻片(評分4)。以稀釋度1∶150將作為交聯(lián)劑的DAB(1mM)施加在玻片9上。DAB的更高(1∶50(3mM)，玻片8)或更低(1∶500(30mM)，玻片10)濃度產(chǎn)生密度稍低的染色(評分3.5)。和DAB的預(yù)孵育的背景降低效果也是可見的；6個(gè)玻片(上表)中沒有一個(gè)具有明顯的背景染色。
低分子量報(bào)道子(例如上述報(bào)道子18044)在較低濃度的DAB(玻片13；評分3)下被更好地沉積，隨著DAB濃度的增加(玻片12，評分2.5；玻片11，評分2)，染色密度降低。
該試驗(yàn)還示出為了獲得相同或甚至更好的染色結(jié)果，與包含相同但更少的過氧化物酶的底物部分的小的報(bào)道分子(例如D 18044，t 5μM)相比，可以使用更少量的包含多個(gè)過氧化物酶的底物部分的大的報(bào)道分子(例如熒光素-阿魏酸葡聚糖偶聯(lián)物D17128，50nM)。
4.使用本發(fā)明的方法放大核酸探針信號的實(shí)施例 通過在Chromogen溶液和信號增強(qiáng)溶液中使用和不使用DAB來試驗(yàn)樣品，可以示出DAB的沉淀效果。通過進(jìn)一步稀釋探針、抗體或通過省略第二過氧化物酶-封閉步驟，可以獲得本發(fā)明信號放大的進(jìn)一步解釋。
組織福爾馬林-固定石蠟嵌入的扁桃體。
熒光素標(biāo)記的探針靶向于染色體11的著絲粒。
在實(shí)施例中使用下列溶液 抗原修復(fù)/預(yù)處理(Dako K 5599) 洗滌緩沖液1(Dako K5331) 洗滌緩沖液2(Dako S 3006) 胃蛋白酶RTU(Dako K 5331) 嚴(yán)格的洗滌緩沖液(Dako K 5331) R-a-Fitc/HRP，F(xiàn)(ab)(Dako P 5100) 抗體稀釋液(Dako S 2022) 探針(Dako Y 5505) 過氧化物酶-封閉液(Dako S 2023) 核快紅(Dako S1968) Chromogen緩沖液(Dako K5007) 雜交劑(Dako S2451)被用于雜交探針。
Chromogen溶液和信號增強(qiáng)溶液的制備 溶液A 將102.5mg的5-氨基-2-(3-[5-氨基-1，3-二氫-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-2H吲哚-2-亞基]-1-丙烯基]-3，3二甲基-1-(4磺基丁基)-3H-吲哚鎓三氟乙酸鹽溶解在4,525mL的丙二醇/水(8∶2)中。
溶液B 將59,6mg的3，3’-二氨基鹽酸聯(lián)苯胺溶解在5,96mL的丙二醇/水(8∶2)中。加入13,7μL 12M的鹽酸。
溶液C 按照1mL A∶9mL B的比混合溶液A和溶液B。
Chromogen溶液 為了染色，將這些儲存液稀釋成試劑盒(得自Dakocytomation code#K5007)的chromogen緩沖液。
將1mL的溶液C與19mL的Chromogen緩沖液混合。
溶液D 將1mL的溶液B用499mL的Chromogen緩沖液稀釋。
信號增強(qiáng)溶液 其為在20％的乙醇中的D1734、0,1M NaCl、10mM CHES(pH 9,0)的溶液，用溶液D稀釋至Fer-L30-FITC濃度為250nM或50nM。在溶液中沒有DAB的情況下，直接在Chromogen緩沖液中進(jìn)行稀釋。
組織染色過程 將人扁桃體組織玻片去石蠟化、洗滌并在微波爐中進(jìn)行10分鐘的抗原修復(fù)。在另一次洗滌后，在37℃下進(jìn)行胃蛋白酶處理，洗滌，使玻片脫水并和PNA探針孵育。在85℃下使樣品變性5分鐘后，將探針在45℃下雜交1小時(shí)。將玻片在65℃下嚴(yán)格洗滌10分鐘。將過氧化物酶封閉3分鐘，將玻片洗滌并和兔-抗-FITC/HRP(以1∶20稀釋)孵育。在30分鐘后，將玻片洗滌并和信號增強(qiáng)溶液孵育。在30分鐘后，將玻片洗滌，并將過氧化物酶封閉3分鐘，再次洗滌，將玻片和兔-抗-FITC/HRP(以1/20稀釋)孵育。在30分鐘后，將玻片洗滌并和Chromogen溶液孵育。在使用水洗滌后，將玻片用核快紅復(fù)染，洗滌和設(shè)置。
試驗(yàn)建立和染色結(jié)果示于下表中
玻片1為示出探針需要獲得信號的對照。
玻片2示出在信號增強(qiáng)溶液中沒有交聯(lián)劑，無法獲得特定信號。
玻片3示出向信號增強(qiáng)溶液中加入交聯(lián)劑(DAB)導(dǎo)致高的信號放大。這僅是chromogen溶液中沒有DAB的玻片。
玻片4示出向chromogen溶液中加入交聯(lián)劑進(jìn)一步增強(qiáng)了信號(與玻片3相比)。
玻片6示出通過增加信號增強(qiáng)劑(D17134)的濃度，可以在沒有交聯(lián)劑的情況下獲得弱的信號。然而，加入交聯(lián)劑導(dǎo)致該信號更強(qiáng)的放大(如玻片5所示)。
權(quán)利要求
1.一種在靶位點(diǎn)沉積報(bào)道子的方法，所述方法包括在包含報(bào)道子和交聯(lián)劑的介質(zhì)中孵育靶位點(diǎn)，其中所述靶位點(diǎn)具有過氧化物酶活性，其中所述報(bào)道子為可檢測分子，以及其中所述交聯(lián)劑是包含至少兩個(gè)過氧化物酶的底物部分的分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述過氧化物酶活性與所述靶位點(diǎn)中存在的至少一個(gè)過氧化物酶部分有關(guān)。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述過氧化物酶選自辣根過氧化物酶(HRP)或大豆過氧化物酶(SP)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述交聯(lián)劑為具有下式的分子
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2為過氧化物酶的底物的部分，
X為連接基團(tuán)或化學(xué)鍵，以及
m、n和q為1至10的整數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中
R1和R2為鄰苯二胺的部分，
X為共價(jià)鍵，以及
m、n和q為1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中
R1和R2為阿魏酸的部分，
X為具有下式的連接基團(tuán)
其中R3和R4為氨基酸賴氨酸的殘基，和
m和n為2至10的整數(shù)，
以及q為1至10的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述交聯(lián)劑在所述介質(zhì)中的存在量為約10-5至約10-2M。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述報(bào)道子為包含骨架聚合物和至少一種可檢測物質(zhì)的分子，其中所述至少一種可檢測物質(zhì)通過化學(xué)鍵或通過連接基團(tuán)與所述骨架聚合物相連。
9.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述報(bào)道子包含至少兩種相同或至少兩種不同的可檢測物質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述可檢測物質(zhì)選自熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或顯色標(biāo)記、酶、酶的底物、半抗原或特異性結(jié)合對的成分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述報(bào)道子是小分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述小分子選自熒光或顯色物質(zhì)、半抗原、特異性結(jié)合對的成分或酶的底物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶位點(diǎn)包含生物標(biāo)志。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述介質(zhì)包含過氧化物化合物。
15.一種具有下式的化合物
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2為過氧化物酶的底物的部分，
X為連接基團(tuán)，以及
m、n和q為1至10的整數(shù)。
16.根據(jù)權(quán)利要求16所述的化合物，其中
R1和R2為阿魏酸的部分，
X為具有下式的連接基團(tuán)
其中R3和R4為氨基酸賴氨酸的殘基，和
m和n為2至10的整數(shù)，
以及q為1至10的整數(shù)。
17.一種水緩沖化介質(zhì)，包含
(i)能夠在存在過氧化物酶活性的條件下使至少兩種報(bào)道分子交聯(lián)的化合物，其中所述化合物為包含至少兩個(gè)過氧化物酶的底物部分的分子，并且其中所述兩種報(bào)道分子為可檢測分子，以及
(ii)過氧化物化合物，
所述介質(zhì)的pH為約4至約9。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的介質(zhì)，其中所述能夠在存在過氧化物酶活性的條件下使至少兩種報(bào)道分子交聯(lián)的化合物為具有下式的分子
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2為過氧化物酶的底物的部分，
X為連接基團(tuán)或化學(xué)鍵，以及
m、n和q為1至10的整數(shù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的介質(zhì)，其中所述化合物為二氨基聯(lián)苯胺。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的介質(zhì)，其中所述化合物為權(quán)利要求15或16中所限定的化合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項(xiàng)所述的介質(zhì)，其中所述介質(zhì)中所述化合物的量為約10-5至約10-2M。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)所述的介質(zhì)，其中所述介質(zhì)中所述過氧化物化合物的量為約10-4至約10-2M。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的介質(zhì)，包含0-20％的有機(jī)改性劑和0-2M的有機(jī)鹽或無機(jī)鹽。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的介質(zhì)，還包含過氧化物酶活性增強(qiáng)劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的介質(zhì)，還包含鐵螯合劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求23、24或25任一項(xiàng)所述的介質(zhì)，還包含去污劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求17所述的介質(zhì)，其中所述報(bào)道子為包含骨架聚合物和至少一種可檢測物質(zhì)的分子，所述至少一種可檢測物質(zhì)通過化學(xué)鍵或通過連接基團(tuán)與所述骨架聚合物相連，其中所述至少一種可檢測物質(zhì)選自熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或顯色標(biāo)記、酶、酶的底物、半抗原或特異性結(jié)合對的成分，或其中所述報(bào)道分子為選自熒光或顯色物質(zhì)、半抗原、特異性結(jié)合對的成分或酶的底物的小分子。
28.一種體外檢測生物樣品中的生物標(biāo)志的方法，包括下列步驟
d)將推測包含生物標(biāo)志的生物樣品與一種或多種探針進(jìn)行孵育，其中所述一種或多種探針中的至少一種包含辣根過氧化物酶(HRP)的至少一個(gè)部分，從而所述生物標(biāo)志與包含HRP至少一個(gè)部分的至少一種探針形成絡(luò)合物；
e)在包含報(bào)道子和交聯(lián)劑的介質(zhì)中孵育樣品，所述樣品含有步驟(a)的所述生物標(biāo)志與包含HRP至少一個(gè)部分的至少一種探針形成的絡(luò)合物，從而使所述報(bào)道子沉積在存在步驟(a)的絡(luò)合物的位點(diǎn)中；
f)檢測(b)的所述沉積的報(bào)道子，從而檢測所述生物標(biāo)志。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述生物標(biāo)志為選自蛋白、核酸、脂質(zhì)、碳水化合物中的生物分子，或者為包含兩種或多種所述生物分子或其衍生物的分子絡(luò)合物或聚合物，或者為細(xì)胞狀結(jié)構(gòu)。
30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述探針為特異性結(jié)合對的成分，或?yàn)榘禺愋越Y(jié)合對的成分的偶聯(lián)物，其中所述特異性結(jié)合對的成分能夠與所述生物標(biāo)志特異性結(jié)合。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述探針選自核酸、核酸類似物、肽或蛋白。
32.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟(b)的所述孵育介質(zhì)為權(quán)利要求18至23中任一項(xiàng)所限定的介質(zhì)，其中所述介質(zhì)還包含報(bào)道子。
33.根據(jù)權(quán)利要求24或28所述的方法，其中孵育步驟(b)包括至少如下兩個(gè)步驟
(iii)在根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的介質(zhì)中孵育所述樣品；然后
(iv)在包含報(bào)道子的根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的介質(zhì)中孵育所述樣品。
34.根據(jù)權(quán)利要求24、28或29任一項(xiàng)所述的方法，其中所述報(bào)道子如權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)所限定。
35.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述步驟(i)和(ii)重復(fù)進(jìn)行。
36.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟(c)包括下列步驟將所述樣品和能夠與所述沉積的報(bào)道子特異性結(jié)合的物質(zhì)進(jìn)行孵育。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述物質(zhì)被可檢測地標(biāo)記。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求24至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法在2至20分鐘內(nèi)進(jìn)行。
39.根據(jù)權(quán)利要求24至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法用于生物標(biāo)志的自動(dòng)、半自動(dòng)或人工檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)生的生物標(biāo)記方法。由于可檢測的報(bào)道分子從包含含有至少兩個(gè)過氧化物酶的底物部分的物質(zhì)(本文中稱為“交聯(lián)劑”)的介質(zhì)中沉積到包含過氧化物酶活性和生物標(biāo)志的靶位點(diǎn)中，因此發(fā)生標(biāo)記。本文中所述的標(biāo)記反應(yīng)可通常用于檢測試驗(yàn)方案(其用于檢測并使生物或化學(xué)靶可視化)的宿主中的靶，所述試驗(yàn)方案包括免疫組織化學(xué)法(IHC)，原位雜交法(ISH)例如ELISA、DNA印跡法、RNA印跡法和蛋白質(zhì)印跡法的抗體基染色法，和其他方法。
文檔編號G01N33/58GK101836117SQ200880112656
公開日2010年9月15日 申請日期2008年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日
發(fā)明者J·洛澤, K·H·彼得森 申請人:丹麥達(dá)科有限公司