專(zhuān)利名稱(chēng)：?jiǎn)喂庾庸庾V儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳感器系統(tǒng)和，尤其是涉及單光子傳感器系統(tǒng)以及檢測(cè)由多種熒光標(biāo) 記物標(biāo)記的生物樣品發(fā)射的多色熒光的方法以及分析多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記的生物樣品的 方法。所述傳感器系統(tǒng)和檢測(cè)方法包括一光譜分離單元、一檢測(cè)單元和用于采集的數(shù)據(jù)的 信號(hào)處理算法。
背景技術(shù)：
已有多種基于記錄單光子的熒光檢測(cè)技術(shù)。這些技術(shù)通常指的是單光子檢測(cè) (SPD)技術(shù)。由于它們的復(fù)雜性和價(jià)格昂貴，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中單光子檢測(cè)技術(shù)主要用于時(shí) 間分辨熒光光譜學(xué)或檢測(cè)單個(gè)熒光分子。如圖1的方框圖所示，至今傳統(tǒng)的單光子檢測(cè)器由若干組件組成，所述若干組件 包括一單光子傳感器或光電倍增管(PMT)檢測(cè)器、一脈沖放大器、一脈沖形成器、一計(jì)數(shù)器 和一計(jì)算機(jī)。至今為止一阻礙單光子檢測(cè)器性能的因素是可用的光子計(jì)數(shù)裝置的相對(duì)窄的 線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍。檢測(cè)器的動(dòng)態(tài)范圍是由所述檢測(cè)器為響應(yīng)一單光子所需要的響應(yīng)時(shí)間(τ
來(lái)決定。所述τ 的量取決于所述設(shè)備的所有組件的響應(yīng)時(shí)間，并且通常被認(rèn)為是各 個(gè)組件響應(yīng)時(shí)間的總和。如圖2的圖所示，事實(shí)上現(xiàn)有的單光子傳感器的最短響應(yīng)時(shí)間為 大約Ins。然而，至今為止，具有一給定的τ 的傳統(tǒng)的單光子PMT檢測(cè)器被限于動(dòng)態(tài)范 圍為每秒IO6-IO7光子計(jì)數(shù)(photocounts)。在生物學(xué)應(yīng)用，以及尤其是在DNA檢測(cè)中，至今DNA序列分析系統(tǒng)還不能處理和檢 測(cè)超高速DNA序列分析。實(shí)際上，傳統(tǒng)的DNA序列測(cè)定儀被限于以每秒10-30幀(frames) 記錄測(cè)序過(guò)程。而且，傳統(tǒng)的DNA儀器的動(dòng)態(tài)范圍局限于16bit。至今用于連續(xù)稀釋的 BigDyeDNA測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)樣品的傳統(tǒng)裝置由于至少一因素10少于所需要的而變得相對(duì)不靈敏。因此，需要傳感器，所述傳感器包括具有光子計(jì)數(shù)器的單光子檢測(cè)器，所述單光子 檢測(cè)器具有每秒大于IO7光子計(jì)數(shù)的線(xiàn)性范圍，例如達(dá)到每秒IO8光子計(jì)數(shù)，每秒大于10-30 幀的DNA測(cè)序處理能力以及一更為靈敏的BigDye DNA測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)(standard)?；诙嗤ǖ?單光子檢測(cè)器(例如基于一 32通道PMT傳感器)的光譜儀將能夠非常精確的高速檢測(cè)多 色發(fā)射光。尤其是，所述檢測(cè)器將證明高度精確的快速識(shí)別結(jié)合的熒光部分，以及高品質(zhì)檢 測(cè)DNA序列分析。

發(fā)明內(nèi)容
一基于32通道PMT傳感器的纖維化的單光子靈敏的光譜儀是高靈敏度的，其具有寬的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍。所述光譜儀可精確高速檢測(cè)、鑒定和分析用多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記的生 物樣品，所述熒光標(biāo)記物為例如由多種熒光染料發(fā)出的多色熒光信號(hào)或發(fā)射光的組合物。 所述光譜儀的光纖輸入(fiberized optical input)可容易的有效的連接到任何基于纖維 采集分析的熒光的測(cè)量系統(tǒng)。所述光譜儀提供高度精確的DNA序列分析。一 32通道PMT 單光子檢測(cè)器具有一高于20bits的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍和一大約每秒3300幀的幀速率。所述檢 測(cè)器的像素的動(dòng)態(tài)范圍可達(dá)到每秒IO7光子計(jì)數(shù)并能增強(qiáng)10倍。采用有效增加多通道檢測(cè)器的動(dòng)態(tài)范圍的信號(hào)處理方法來(lái)檢測(cè)和識(shí)別結(jié)合的多 種熒光部分。在一實(shí)施例中描述了一熒光檢測(cè)傳感器，所述熒光檢測(cè)傳感器能檢測(cè)由微量 多種熒光染料的混合物發(fā)出的單光子發(fā)射光，并能非常準(zhǔn)確測(cè)定在染料混合物中各個(gè)染料 的含量。包括一 32通道PMT、一脈沖放大器、比較器和計(jì)數(shù)器的所述傳感器或單光子檢測(cè)器 可能具有的τ _時(shí)間等于或小于1ns，例如0. Ins或0.01ns。采用信號(hào)處理算法能精確分 離由各個(gè)熒光染料發(fā)出的熒光信號(hào)。尤其是，所述實(shí)施方式在此公開(kāi)了 將多色光傳輸?shù)焦庾V分離器的光導(dǎo)纖維；至少一多通道光傳感器，每個(gè)光傳感器通道具有適于接收來(lái)自所述光譜分離器的 不同的光譜，并在響應(yīng)所述接收的光譜的單光子時(shí)產(chǎn)生電流脈沖的光敏像素；一多通道放大器，每個(gè)放大器通道適于接收與來(lái)自所述多通道光傳感器的所述傳 感器通道的一個(gè)對(duì)應(yīng)通道的光譜對(duì)應(yīng)的所述電流脈沖，并適于放大所述電流脈沖；以及一多通道光子計(jì)數(shù)器，每個(gè)光子計(jì)數(shù)器通道適于接收來(lái)自所述多通道放大器的所 述放大器通道的一個(gè)對(duì)應(yīng)通道的所述放大的電流脈沖，所述多通道光子計(jì)數(shù)器具有適于在 一預(yù)設(shè)的時(shí)間區(qū)間累計(jì)每個(gè)計(jì)數(shù)器通道內(nèi)的所述放大的電流脈沖的積分儀。還有公開(kāi)一種鑒別DNA序列的方法，包括以下步驟用熒光染料對(duì)所選的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記；將所述DNA片段輸入到一光導(dǎo)纖維分離毛細(xì)管；用一預(yù)設(shè)波長(zhǎng)的激光照射在所述光導(dǎo)纖維分離毛細(xì)管內(nèi)所述標(biāo)記的DNA片段以 產(chǎn)生所述DNA片段的熒光光譜；用來(lái)自所述DNA片段的熒光光譜照射光導(dǎo)纖維，所述光纖傳送所述熒光光譜到一 光譜分離器，將所述光譜分離器的輸出入射在至少一多通道光傳感器上，每個(gè)光傳感器通 道具有適于接收來(lái)自所述光譜分離器的不同光譜并適于在響應(yīng)所述不同光譜的每個(gè)不同 波長(zhǎng)的單光子時(shí)產(chǎn)生電流脈沖的光敏像素。還有公開(kāi)一種檢測(cè)顏色編碼的微粒的方法，包括以下步驟用熒光染料標(biāo)記微粒；在一緩沖液中懸浮所述標(biāo)記的微粒；以一預(yù)設(shè)速度將具有所述標(biāo)記的微粒的緩沖液傳送通過(guò)一光導(dǎo)纖維毛細(xì)管；用激光照射在所述光纖毛細(xì)管中的標(biāo)記的微粒以從其中產(chǎn)生熒光光譜；用來(lái)自所述標(biāo)記的微粒的熒光光譜照射光導(dǎo)纖維，所述光導(dǎo)纖維傳送所述熒光光 譜到一光譜分離器，將所述光譜分離器的輸出入射在至少一多通道光傳感器上，每個(gè)光傳 感器通道具有適于接收來(lái)自所述光譜分離器的不同光譜并適于在響應(yīng)所述不同光譜的每 個(gè)不同波長(zhǎng)的單光子時(shí)產(chǎn)生電流脈沖的光敏像素。


為進(jìn)一步理解本發(fā)明，可參考下列附圖，其中圖1是傳統(tǒng)單光子傳感器的方框圖；圖2是一顯示從一購(gòu)買(mǎi)的32通道PMT的一個(gè)通道直接測(cè)量到的脈沖的圖片；圖3是一具有單光子敏感性的傳感器的方框圖；圖4是光譜分離組件的示意圖；圖4A是圖4的光譜分離組件的透視圖；圖5是一具有兩個(gè)32通道PMT檢測(cè)器的雙光譜分離組件的透視圖；圖6表示在用一 400MHz 26dB放大器放大后從一 SiPM 二極管測(cè)量到的脈沖；圖6A是一 3級(jí)、2GHz、60dB脈沖放大器的電路圖；圖7顯示一來(lái)自PMT的典型的Ins電壓脈沖；圖8是一 32通道單光子檢測(cè)器的方框示意圖；圖9描述來(lái)自一 32通道PMT的一通道的放大脈沖的脈沖形狀和在一 PECL比較器 后的脈沖形狀；圖10是一 2級(jí)脈沖放大器的電路圖；圖11是一顯示一單光子檢測(cè)器的通道串?dāng)_的圖片；圖12是一高速光子計(jì)數(shù)器的方框圖；圖13是一顯示光與一單光子檢測(cè)器的一個(gè)通道的光子計(jì)數(shù)特征的比較的曲線(xiàn) 圖；圖14中上面的組表示一具有32通道PMT傳感器的光譜儀的通道分辨率，下面的 組表示所述光譜儀的波長(zhǎng)分辨率；圖15是一單光子檢測(cè)器的光學(xué)系統(tǒng)的方框圖；圖16是一顯示光與為三個(gè)波長(zhǎng)測(cè)量的圖15的所述單光子檢測(cè)器的一個(gè)通道的光 子計(jì)數(shù)特征的比較的曲線(xiàn)圖；圖17表示在光子檢測(cè)組件輸出的光子計(jì)數(shù)分布的直方圖；圖18包括一單道(Iane)DNA測(cè)序儀的照片和示意圖；圖19包括上面的組中表示用于處理DNA序列分析數(shù)據(jù)的系統(tǒng)矩陣C的曲線(xiàn)圖和 一下面的組中表示用于處理DNA序列分析數(shù)據(jù)的色彩解卷積矩陣；圖20是DNA測(cè)序軌跡(traces)和堿基測(cè)定(base calling)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(quality scores)的曲線(xiàn)圖；圖21包括顯示色碼識(shí)別和計(jì)算機(jī)模擬色彩解碼的精確度的曲線(xiàn)圖；圖22是一小珠(bead)檢測(cè)系統(tǒng)的示意圖；圖23是一顯示隨機(jī)染色小珠的識(shí)別的圖片；圖24是一 32通道快速大動(dòng)態(tài)范圍單光子光譜儀的方框圖；圖25是一 32通道脈沖放大器的電路原理圖。優(yōu)選實(shí)施的詳細(xì)說(shuō)明參照?qǐng)D3，其顯示了一具有單光子敏感性的傳感器10的方框圖，所述傳感器10是 用于測(cè)量由微量的多種熒光染料的混合物發(fā)出的發(fā)射光。如圖4所示，一光輸入纖維11采集多色熒光，然后所述多色熒光被傳送通過(guò)一光譜分離組件12。在通過(guò)所述組件12后，分 解的熒光信號(hào)照射一 32通道光子傳感器13的光敏像素，所述32通道光子傳感器13可以 是，僅作為示例，由日本公司Hamamatsu制造的所述32通道PMT陣列(array) H7260-20。每 個(gè)所述分離的波長(zhǎng)通過(guò)所述PMT的一個(gè)通道檢測(cè)，并且所述PMT的每個(gè)通道可檢測(cè)范圍在 大約IOnm內(nèi)的波長(zhǎng)。所述接收的光子產(chǎn)生非常短的電流脈沖，所述電流脈沖經(jīng)過(guò)放大和光 子計(jì)數(shù)。例如，如圖7所示，當(dāng)所述PMT以一單光子計(jì)數(shù)模式工作時(shí)，每個(gè)通道在響應(yīng)一入 射光子流時(shí)產(chǎn)生一股短的(大約Ins)電流脈沖。所述脈沖振幅范圍在0.4-0. 6mA之間，且 對(duì)應(yīng)的峰值電壓范圍在8-12mV之間。用一設(shè)定的電壓閾值小于所述脈沖振幅的比較器計(jì) 數(shù)所述脈沖。得到的光子計(jì)數(shù)被傳遞到一計(jì)算機(jī)14以進(jìn)行記錄和處理數(shù)據(jù)。在一實(shí)施例中，所述光譜分離組件12執(zhí)行分離和測(cè)量波長(zhǎng)范圍在480nm到630nm 之間的多色熒光。參照?qǐng)D4和4A，通過(guò)一光導(dǎo)纖維輸入16連接到一準(zhǔn)直器17將所述多 色熒光傳送到所述光譜分離組件，所述準(zhǔn)直器17可以是例如由Thorlabs Inc, NJ制造的 所述F810SMA-543準(zhǔn)直器。所述準(zhǔn)直器17產(chǎn)生直徑大約是IOmm的平行多色束。所述準(zhǔn) 直的或平行的光束通過(guò)一激光拒波濾波器18并由一衍射光柵19將其分離成它的構(gòu)成的 波長(zhǎng)組分，所述衍射光柵19可以是一衍射光柵例如由Thorlabs Inc, NJ制造的衍射光柵 GR13-1850。在一實(shí)施例中，所述衍射光柵19可以被調(diào)諧進(jìn)行光譜分離和測(cè)量波長(zhǎng)范圍在 490nm到630nm之間的熒光。將分離的單色束組分聚焦到所述32通道PMT 13的像素上。所述聚焦可通過(guò)一球 形聚焦鏡21和一柱面透鏡22來(lái)完成，所述球形聚焦鏡21可以是由Thorlabs Inc,NJ制造 的球形聚焦鏡CM254-075-G01，所述柱面透鏡22可以是也是由Thorlabs Inc制造的柱面透 鏡 LJ1095L2。在一實(shí)施例中，所述光譜分離組件可檢測(cè)與IOnm不同的波長(zhǎng)。每個(gè)分離波長(zhǎng)主要 是由所述PMT的一個(gè)通道進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)PMT通道檢測(cè)范圍在大約IOnm內(nèi)的波長(zhǎng)。所述光譜儀的光譜分離組件可提供高達(dá)Inm的光譜分辨率。可通過(guò)具有由0. 2mm 間距分開(kāi)的0. 8mmX 7mm檢測(cè)帶的32通道PMT獲得大約IOnm的光譜分辨率。已有發(fā)現(xiàn)可 通過(guò)采用接收光的纖維陣列(arrays ofphotoreceiving fibers)來(lái)提高所述傳感器的總 的光譜分辨率，每個(gè)陣列被連接來(lái)照射一單光子傳感器。已發(fā)現(xiàn)所述具有一用于每個(gè)光子 傳感器的纖維束的光譜儀的光譜分辨率為大約5nm。實(shí)際上，在一些應(yīng)用中，當(dāng)需要高的光 譜分辨率時(shí)，所述接收的光導(dǎo)纖維可作為帶通濾波器使用。如以下更詳細(xì)的說(shuō)明所述，如果 熒光染料具有一寬的光譜，一些陣列的光導(dǎo)纖維束可被用來(lái)采集所述染料的光譜并引導(dǎo)其 覆蓋所述光譜儀的一些通道。根據(jù)圖5，一實(shí)施例的一光譜儀可適用于更寬范圍的波長(zhǎng)?？刹捎靡欢质?器擴(kuò)大所述波長(zhǎng)的范圍，所述二色片分束器可以是例如由Edmund Optics, Inc, NJ制造的 分束器NT47-424。所述分束器也可以是由Semrock Inc.，NY制造的分束器FF650_Di01。 在準(zhǔn)直所述入射的發(fā)射光或光后，所述分束器23將所述準(zhǔn)直的光分成兩部分。較短波長(zhǎng) (例如Edmund分束器的530-585nm波長(zhǎng)或Semrock分束器的500_640nm波長(zhǎng))被偏轉(zhuǎn)到 一通道24。同時(shí)，較長(zhǎng)波長(zhǎng)(例如Edmund分束器的601-800nm波長(zhǎng)或Semrock分束器的 660-825nm波長(zhǎng))被引導(dǎo)入一第二通道26。因此所述較長(zhǎng)的和較短的波長(zhǎng)在所述光譜儀中 被空間分離將近90度。根據(jù)檢測(cè)器設(shè)備的類(lèi)型，一二色片分束器的使用允許在波長(zhǎng)范圍為500nm-800nm和300-500nm內(nèi)，所述光譜儀具有更寬范圍的光譜分離和更高的光譜分辨率。 已發(fā)現(xiàn)可購(gòu)買(mǎi)得到的檢測(cè)器組件H7620-20和H7620-04可分別地用于所述波長(zhǎng)范圍。在相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解一傳感器或光譜儀可包括兩種不同類(lèi)型的多 通道單光子檢測(cè)器。例如，在不脫離本發(fā)明的范圍下，對(duì)于較長(zhǎng)波長(zhǎng)可采用一 PMT，而對(duì)于 較短波長(zhǎng)可采用一硅光電倍增管(SiPM) 二極管檢測(cè)器。所述SiPM 二極管是CMOS技術(shù)，相 對(duì)便宜的，并包括在一普通硅襯底上并聯(lián)連接在一起的各個(gè)像素的矩陣。為響應(yīng)單光子，一 SiPM產(chǎn)生單電壓脈沖。所述技術(shù)是SiPM陣列可被用于與所述驅(qū)動(dòng)(driving)和讀出的電 路在所述相同芯片上集成。SiPMs是高增益的，增益高達(dá)IO5-IO7,并在相對(duì)低電壓(例如 20-70V)上工作。它們的響應(yīng)時(shí)間范圍是l_20ns。參照?qǐng)D6，可觀察到在用400MHz、26dB脈 沖放大器放大后，可從一 SiPM 二極管得到大約2ns單光子脈沖。已發(fā)現(xiàn)與一 SiPM 二極管 連接的1級(jí)、2級(jí)或3級(jí)2GHz、60dB SiPM脈沖放大器可用作為用于在單光子計(jì)數(shù)領(lǐng)域的單 光子的檢測(cè)器。圖6A表示一 3級(jí)2GHz、60dB脈沖放大器的電路圖。SiPM陣列也可用作為 一用于單光子光譜儀的單光子傳感器。也有發(fā)現(xiàn)SiPMs適用于檢測(cè)DNA序列分析。相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解的是，半透明鏡可用于代替二色分光鏡。由于將 通過(guò)兩個(gè)單光子檢測(cè)器檢測(cè)由所述光譜儀接收的全部光子束，采用半透明鏡可擴(kuò)大檢測(cè)動(dòng) 態(tài)范圍。同樣地，所述光子束可被分成若干束，每個(gè)所述束由專(zhuān)用的單光子檢測(cè)器檢測(cè)。所 述方法也可用于擴(kuò)大所述光子檢測(cè)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍。參照?qǐng)D8，在一實(shí)施例中，一檢測(cè)器包括一 32通道脈沖放大器27和一 32通道光子 計(jì)數(shù)器31，所述32通道脈沖放大器27可以是基于表面安裝設(shè)備技術(shù)，而所述32通道光子 計(jì)數(shù)器31可以是基于現(xiàn)場(chǎng)可編程門(mén)陣列(field programmed gate array)。所述檢測(cè)器 的放大器部分包括32個(gè)相同的脈沖放大通道28，其中每個(gè)通道在一實(shí)施例中具有35-40dB 增益和IGHz帶寬。所述檢測(cè)器還可具有32個(gè)快速比較器29，每個(gè)比較器具有的上升和下 降時(shí)間為大約2ns。該排列限制最小脈沖寬度為將近4. 5ns并將PMT負(fù)脈沖從10_50mV提 高到能可靠地觸發(fā)所述比較器的水平。圖9顯示，在上面的軌跡中所述來(lái)自一 32通道PMT 的一個(gè)通道的放大的脈沖的脈沖形狀和在下面的軌跡中在一 PECL比較器后所述脈沖的形 狀。參照?qǐng)D10，其顯示一脈沖放大器的電路的一實(shí)施例，一 2級(jí)放大器包括2BGA427放 大器32和33，即分別是U57和TO8。每個(gè)放大級(jí)提供2GHz范圍內(nèi)的20db放大倍數(shù)。所述 放大信號(hào)被輸入到一具有τ _為Ins的ADCCMP553LVPECL比較器34。一放大的負(fù)信號(hào)脈 沖從所述比較器產(chǎn)生一 PECL水平輸出脈沖，所述PECL水平輸出脈沖被輸入到所述計(jì)數(shù)器 31(圖 8)?？刹捎靡浑娢黄?6 (即電位器R9)調(diào)節(jié)所述參比電壓從0到3. 3伏。在一實(shí)施例 中，所述參比電壓可被設(shè)定從1.2V(所述放大器的中點(diǎn))一直到所述放大脈沖振幅。可選 擇接近于所述脈沖最低值并盡可能停留在噪聲水平以上的閾值電壓?？梢岳斫獾氖?，1級(jí) 放大器也可為觸發(fā)所述比較器34提供充分的增益。在所述實(shí)施例中，可以不采用電容器 37(即電容器C35)。得到的電路提供20dB放大倍數(shù)，并改變一次所述脈沖的極性。如圖9 所示，在高的軌跡中顯示的是在被輸入到所述比較器34前的放大的脈沖的脈沖形狀，以及 在低的軌跡中顯示的是來(lái)自所述比較器34的脈沖輸出的脈沖形狀。在單光子檢測(cè)器中可能發(fā)生兩種主要類(lèi)型的串?dāng)_。一種是在所述32通道PMT內(nèi)的電子串?dāng)_。圖11的圖形表示在所述PMT的相鄰的通道之間的典型的串?dāng)_。所述串?dāng)_由 所述PMT內(nèi)的電子光學(xué)的一定特征所產(chǎn)生。在一 32通道PMT內(nèi)的通道串?dāng)_包括一光學(xué)的 和一電子的分量(component)。由于不完全的光線(xiàn)聚焦照射相鄰的通道而產(chǎn)生光學(xué)串?dāng)_，而 所述電子串?dāng)_是由在所述PMT通道之間的內(nèi)部電流產(chǎn)生。當(dāng)各個(gè)通道被光導(dǎo)纖維照射時(shí)， 可在已知的32通道PMT的通道中觀察到3%級(jí)的較小的通道串?dāng)_。另一種類(lèi)型的串?dāng)_是在所述放大器內(nèi)的所述放大通道和在所述計(jì)數(shù)器內(nèi)的所述 通道之間的電子串?dāng)_。一般來(lái)說(shuō)，至今仍未觀察到在所述放大器的通道和所述32通道光 子計(jì)數(shù)器的通道之間的電子串?dāng)_。然而，即使在傳感器內(nèi)的非常小的通道串?dāng)_也可引起在 例如染料混合物的分析中的錯(cuò)讀，尤其是在不同染料組分的組合物的數(shù)量級(jí)(orders of magnitude)不同的時(shí)候。為了使所述光學(xué)串?dāng)_最小化，可通過(guò)在單PMT通道上聚焦一來(lái)自 現(xiàn)有的532nm NdYAG激光器的光束來(lái)照射所述單PMT通道。可以看出，所述完整通道串?dāng)_ 僅限于幾個(gè)百分點(diǎn)，并且其與在主要的通道內(nèi)測(cè)量到的信號(hào)是線(xiàn)性相關(guān)的。再參照?qǐng)D8，在放大后，所述放大器27的每個(gè)通道的輸出被輸入到所述32通道高 速光子計(jì)數(shù)器31中。計(jì)數(shù)器31累計(jì)到達(dá)所述通道輸入端的脈沖。由所述計(jì)數(shù)器31內(nèi)的同 步生成器提供積分時(shí)間區(qū)間(未顯示)。在一實(shí)施例中，所述最小積分時(shí)間是大約0.3ms。參照?qǐng)D12，圖中的方框圖顯示所述高速計(jì)數(shù)器31的一實(shí)施例的詳圖(圖8)。在 該實(shí)施例中，所述高速計(jì)數(shù)器包括一對(duì)相同的計(jì)數(shù)電路38和38A。每個(gè)計(jì)數(shù)電路包括一三 字節(jié)PECL計(jì)數(shù)器39和39A、分別三個(gè)PECL到TTL 3態(tài)緩沖器41A-C和41D-F，以及分別三 個(gè)與門(mén)(ANDgates)42A-C和42D-F。每個(gè)計(jì)數(shù)電路輸入到一同步電路，所述同步電路包括一 固定值同步字節(jié)單元44、一同步塊兩字節(jié)計(jì)數(shù)器46、三個(gè)3態(tài)緩沖器47A-C和3與門(mén)(AND gates)48A-C。所述高速計(jì)數(shù)器也包括一控制電路49，所述控制電路49包括一晶體振蕩器51、一 14級(jí)二進(jìn)制紋波計(jì)數(shù)器52以及多個(gè)開(kāi)關(guān)53，每個(gè)開(kāi)關(guān)53對(duì)應(yīng)于所述計(jì)數(shù)器52的一個(gè)級(jí)。 所述控制電路49還包括一字節(jié)計(jì)數(shù)器54、所述字節(jié)計(jì)數(shù)器的輸出被輸入到一塊計(jì)數(shù)器56。 所述字節(jié)計(jì)數(shù)器54和塊計(jì)數(shù)器56各自連接到所述與門(mén)42A-F和48A-C。所述字節(jié)計(jì)數(shù)器 54的輸出也被輸入到一對(duì)額外的與門(mén)57A和57B，每個(gè)所述與門(mén)57A和57B連接到四個(gè)TTL 到PECL轉(zhuǎn)換器58A-D中的一個(gè)。一非門(mén)(NOT gate) 59連接到所述塊計(jì)數(shù)器56和所述與 門(mén)42A-F和48A-C。所述控制電路包括一連接到每個(gè)所述四個(gè)TTL到PECL轉(zhuǎn)換器58A-D的 觸發(fā)器。一 LPT輸出控制電路62包括一時(shí)間延遲器63、或門(mén)(OR gates)64和一觸發(fā)器。來(lái)自所述高速放大器27的脈沖被同時(shí)提供到所述3字節(jié)PECL計(jì)數(shù)器39和39A 的輸入端。這些計(jì)數(shù)器中的一個(gè)一直處于計(jì)數(shù)狀態(tài)，而另一個(gè)則暫停使用(on hold)。累積 的數(shù)據(jù)被一個(gè)字節(jié)接一個(gè)字節(jié)地通過(guò)對(duì)應(yīng)字節(jié)數(shù)的PECL到TTL 3態(tài)緩沖器傳送到LPT端所述三字節(jié)PECL計(jì)數(shù)器39和39A的態(tài)由被對(duì)應(yīng)的TTL到PECL轉(zhuǎn)換器58A-D轉(zhuǎn) 換的控制電路信號(hào)決定。例如，來(lái)自所述TTL到PECL轉(zhuǎn)換器58B的輸出信號(hào)設(shè)置和保持所 述三字節(jié)PECL計(jì)數(shù)器39在暫停使用狀態(tài)以及，同時(shí)，設(shè)置所述三字節(jié)PECL計(jì)數(shù)器39A進(jìn) 入計(jì)數(shù)狀態(tài)。來(lái)自所述TTL到PECL轉(zhuǎn)換器58C的輸出信號(hào)設(shè)置和保持所述三字節(jié)PECL計(jì) 數(shù)器39A進(jìn)入暫停狀態(tài)以及設(shè)置所述三字節(jié)PECL計(jì)數(shù)器39進(jìn)入計(jì)數(shù)狀態(tài)。在所述對(duì)應(yīng)的 三字節(jié)PECL計(jì)數(shù)器的數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換到所述LPT端口 67后，轉(zhuǎn)換器58A和58C的輸出信號(hào)重新設(shè)置對(duì)應(yīng)的三字節(jié)PECL計(jì)數(shù)器。在每個(gè)102傳輸字節(jié)后，開(kāi)始所述同步電路43的三個(gè)同步字節(jié)。如圖11所示，所 述第一字節(jié)具有固定值00010001，以及第二和第三字節(jié)代表所述同步塊兩字節(jié)計(jì)數(shù)器46 的隨后的當(dāng)前狀態(tài)。所述計(jì)數(shù)器46的同步字節(jié)輸出通過(guò)對(duì)應(yīng)的3態(tài)緩沖器47A-C被傳送 到系統(tǒng)輸出67?？刂齐娐?9的晶體振蕩器51產(chǎn)生2MHz同步脈沖，并傳輸?shù)?4級(jí)二進(jìn)制紋波計(jì) 數(shù)器52。所述計(jì)數(shù)器52具有14個(gè)輸出引腳(output pins)，通常由參考數(shù)字68表示。每 個(gè)引腳輸出同步脈沖，所述同步脈沖的起始頻率由一從2到16386的系數(shù)劃分。采用所述 開(kāi)關(guān)53選擇一從1-14的適當(dāng)?shù)囊_，從而設(shè)置全部電路的同步頻率。在該實(shí)施例中，所述 開(kāi)關(guān)可設(shè)置所述數(shù)據(jù)傳輸?shù)剿鯨PT端口 67的傳輸速度為從122到1，000，000字節(jié)每秒。所述同步脈沖被傳送到所述字節(jié)計(jì)數(shù)器54。在接收每個(gè)同步脈沖后，所述字節(jié)計(jì) 數(shù)器54繼續(xù)對(duì)三個(gè)輸出的每一個(gè)產(chǎn)生一信號(hào)，如圖11中的“字節(jié)”數(shù)字1、2和3所示。每 個(gè)所述信號(hào)傳輸一對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)字節(jié)，且每個(gè)數(shù)據(jù)字節(jié)被傳輸?shù)接?jì)數(shù)電路38和38A。每個(gè)數(shù) 據(jù)信號(hào)也通過(guò)一對(duì)應(yīng)的與門(mén)48A-C被傳輸?shù)酵诫娐?3。字節(jié)計(jì)數(shù)器54的第4輸出的高位(high)重新設(shè)定所述計(jì)數(shù)器，并傳輸?shù)剿鰤K 計(jì)數(shù)器56，所述塊計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)所述傳輸?shù)?字節(jié)代碼的數(shù)量。經(jīng)計(jì)數(shù)所述第34個(gè)3字節(jié) 代碼，結(jié)果等于102數(shù)據(jù)字節(jié)，所述塊計(jì)數(shù)器56對(duì)所述第35個(gè)3字節(jié)代碼產(chǎn)生信號(hào)。該信 號(hào)被傳輸?shù)剿雠c門(mén)48A-C，所述與門(mén)48A-C能將同步電路數(shù)據(jù)傳輸?shù)剿鯨PT輸出端67。 同時(shí)，對(duì)所述第35個(gè)3字節(jié)代碼的信號(hào)阻止(blocks)所述計(jì)數(shù)電路38和38A的輸出。如 圖11所示，響應(yīng)所述第36個(gè)3字節(jié)代碼的所述塊計(jì)數(shù)器56的輸出信號(hào)重新設(shè)置所述計(jì)數(shù) 器，并阻止所述同步塊兩字節(jié)計(jì)數(shù)器46以計(jì)數(shù)105字節(jié)順序(byte sequences)的數(shù)量。在 達(dá)到65536的數(shù)值后，所述同步塊兩字節(jié)計(jì)數(shù)器46復(fù)位。所述觸發(fā)器61由字節(jié)計(jì)數(shù)器54的每個(gè)第一字節(jié)脈沖觸發(fā)。由所述觸發(fā)器61產(chǎn) 生的信號(hào)交替地使三字節(jié)PECL計(jì)數(shù)器39和39A進(jìn)入計(jì)數(shù)或暫停使用狀態(tài)。所述信號(hào)也啟 用或禁用所述計(jì)數(shù)器輸出，并且允許或阻止通過(guò)與門(mén)57A和58B來(lái)傳送所述復(fù)位脈沖到所 述計(jì)數(shù)器。圖13的曲線(xiàn)圖顯示典型的光與圖12所示所述類(lèi)型計(jì)數(shù)器的一個(gè)通道的光子計(jì) 數(shù)特征的比較關(guān)系。再參照?qǐng)D7，一實(shí)施例的一脈沖放大器的輸入和輸出都有描述典型的電壓脈沖。所 述放大的脈沖的寬度大約是5ns，大約是所述輸入脈沖寬度的5倍寬。所述檢測(cè)器的動(dòng)態(tài)范 圍(光子計(jì)數(shù)最大值與暗噪音的比值)為_(kāi)20bit。由于采用數(shù)據(jù)記錄軟件，所述計(jì)數(shù)器可 分辨脈沖持續(xù)時(shí)間小于2ns以及脈沖振幅為-1. 5V的脈沖。由于本實(shí)施例的32通道單光子檢測(cè)器具有靈敏度和線(xiàn)性，因此可記錄高達(dá)每秒 5X IO7計(jì)數(shù)的光子計(jì)數(shù)速率。實(shí)際上，所述檢測(cè)器的線(xiàn)性使得線(xiàn)性光子計(jì)數(shù)具有非常寬的 范圍，例如高達(dá)和超過(guò)每秒2X107光子計(jì)數(shù)。也已觀察到高達(dá)2X IO8的光子計(jì)數(shù)。這些計(jì) 數(shù)范圍將超過(guò)任何已知的可購(gòu)買(mǎi)的單光子檢測(cè)器的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍。通過(guò)將本實(shí)施例所述檢 測(cè)器的光子檢測(cè)效率與現(xiàn)有的單光子檢測(cè)器(例如SPCM-AQR-12-FC型)的光子檢測(cè)效率 比較，結(jié)果表明，在490nm時(shí)本實(shí)施例所述32通道PMT檢測(cè)器的光子檢測(cè)效率約占上述現(xiàn) 有的SPCM的光子檢測(cè)效率的20%，并且在610nm時(shí)降到5%。參照?qǐng)D8和圖12，所述計(jì)數(shù)器31采集的數(shù)據(jù)被傳送到一采用標(biāo)準(zhǔn)IEEE 1248并行
11端口接口 67的計(jì)算機(jī)。通過(guò)采用二進(jìn)制格式以105字節(jié)的幀傳送所述數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)幀包括 用于所述32檢測(cè)通道的獲得的計(jì)數(shù)數(shù)值(每通道3字節(jié))。每個(gè)幀以6字節(jié)首部起始，所 述6字節(jié)首部包括以下字段1字節(jié)計(jì)數(shù)器類(lèi)型、2字節(jié)幀數(shù)和一以毫秒測(cè)量的2字節(jié)計(jì)數(shù) 周期持續(xù)時(shí)間(2-byte counting period length)。所述幀數(shù)包括當(dāng)前幀的數(shù)目。對(duì)于每 個(gè)下列的幀，數(shù)目增加量為1，因此形成伴隨溢出(overflow)的上升的序列。所述幀數(shù)可作 為同步標(biāo)記，并通過(guò)數(shù)據(jù)處理軟件被應(yīng)用來(lái)在連續(xù)數(shù)據(jù)流中查找數(shù)據(jù)幀。幀數(shù)也用于驗(yàn)證 數(shù)據(jù)完整性和用于查找干擾在傳輸線(xiàn)內(nèi)引入的錯(cuò)誤。一專(zhuān)用的軟件包實(shí)現(xiàn)由所述計(jì)數(shù)器傳 送的數(shù)據(jù)的記錄和在線(xiàn)可視化。在處理的熒光光譜中，信號(hào)處理的主要任務(wù)是檢測(cè)各個(gè)熒光染料在由染料混合物 產(chǎn)生的熒光信號(hào)中的分布，所述染料混合物由具有不同的和已知的熒光光譜的η染料組 成。在所述光譜儀對(duì)所述檢測(cè)到的熒光產(chǎn)生線(xiàn)性響應(yīng)的條件下，可通過(guò)分解在所述光譜儀 的N個(gè)獨(dú)立通道內(nèi)測(cè)量到的熒光來(lái)發(fā)現(xiàn)各個(gè)染料在所述混合物中的分布。通過(guò)舉例，如果所述分析的熒光染料的數(shù)目η < Ν(例如在DNA序列分析時(shí) = 4)，那么采用一已知系統(tǒng)矩陣技術(shù)H(Nxn) = (hi; h2...，hn)，其中比=(hn...hNi)T， (l^i^n)是代表在所述分析的染料混合物中的熒光染料的光譜的N組分向量，通過(guò)在對(duì) 各個(gè)熒光染料hi的光譜響應(yīng)前校準(zhǔn)所述系統(tǒng)是可能得到一系統(tǒng)矩陣H。假設(shè)r = Ov . . rN) T是所述染料混合物的測(cè)量得到的熒光光譜，以及S = (S1, S2, ... , sn)T是代表各個(gè)熒光染 料的濃度的組分重量的向量，那么在噪聲ω = {ω”.. ωΝ)τ存在下，所述測(cè)量得到的光譜r 為 方程式(1)的最優(yōu)解s取決于所述噪聲組分Oi的分布性質(zhì)?？商岢鲆缓?jiǎn)化的假 設(shè)，即ω i是獨(dú)立的，并假設(shè)正常隨機(jī)值的分布相同，由Kay在1993年得到一熟知的計(jì)算的 有效的最小方差無(wú)偏的解決方案，(Fundamentals of Statistical Signal Processing. Estimation Theory at p. 97)，其估計(jì)的§如下 在光子計(jì)數(shù)中，各個(gè)速率觀察結(jié)果A具有帶有相等的均值和方差的泊松分布。對(duì) 于更高的光子計(jì)數(shù)速率(超過(guò)每觀察周期50計(jì)數(shù))，通過(guò)重疊‘真實(shí)’ (true)平均速率廠(chǎng)和 高斯噪聲Qi使得觀察到的速率十分接近，同時(shí)取決于平均速率的方差如下 通過(guò)g獲得更精確的解決方案，即所述分量ω i獨(dú)立不恒等地分布正常隨機(jī)變量。 至今已由Kay于1993年在Id導(dǎo)出方程式(1)的如下通解 其中C是分量(Oi的協(xié)方差矩陣。由于(Oi的獨(dú)立性，所述矩陣C對(duì)角線(xiàn)的
其中σ /是變量ω”實(shí)際上，所述平均速率廠(chǎng)未知，而觀察的速率ri用于計(jì)算所 述方差η = η .對(duì)每個(gè)測(cè)量法估計(jì)方差ο Λ關(guān)于ο /和A的函數(shù)對(duì)每個(gè)用于獲得A的預(yù)處理 方法是特定的。例如，如果通過(guò)在采樣周期期間計(jì)數(shù)光子而直接獲得那么σ,2 = /V。如果從 所述計(jì)數(shù)觀察結(jié)果減去背景bi;那么σ,2 二/7 +A1 。如果通過(guò)對(duì)在k采樣期間的計(jì)數(shù)觀察結(jié)果 取平均值得到那么σ,2 = /ν·/λ。方程式(3)的估計(jì)值更精確，但比方程式(2)的估計(jì)值需 要更多計(jì)算資源。上述信號(hào)處理技術(shù)允許在所述串?dāng)_除去的階段(stage)減去背景。這可通過(guò)創(chuàng)建 代表所述背景的其它光譜(矩陣H的列)而獲得。方程式(2)和(3)的估計(jì)值以及新的矩 陣H將從其它光譜分量中分離所述背景。參照?qǐng)D15，圖中的方框圖顯示了用于表征所述單光子檢測(cè)器的測(cè)量裝置 (measurementsetup)。在該裝置中，光源69的光通過(guò)一組中性濾光器71并連接到所述末 端連接一 GRIN透鏡72的纖維上，所述光源69可以是一單色器或一 532nm激光器。GRIM透 鏡的光被聚焦到所述32通道PMT的32光陰極的其中一個(gè)光陰極上。在圖16中描述了采 用圖15所示具有一單色器作為所述光源69的裝置的單光子檢測(cè)器所測(cè)量得到的光子計(jì)數(shù) 和光特性。可以看出，對(duì)所有三種檢測(cè)的波長(zhǎng)，所述檢測(cè)器的輸出保持線(xiàn)性達(dá)到每秒108光 子計(jì)數(shù)，而檢測(cè)器的動(dòng)態(tài)范圍超過(guò)每秒2 X 108光子計(jì)數(shù)。與波長(zhǎng)630nm相比較，波長(zhǎng)488nm & 530nm的絕對(duì)計(jì)數(shù)率的顯著差異有圖解說(shuō)明。所述PMT的量子效率在長(zhǎng)于600nm的波長(zhǎng) 時(shí)出現(xiàn)下降。本實(shí)施例的光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的噪聲由光子計(jì)數(shù)的暫時(shí)分布來(lái)確定。一正確操作的光 子計(jì)數(shù)器采用泊松分布，對(duì)泊松分布估計(jì)的光子計(jì)數(shù)率的方差(例如在積分期間計(jì)數(shù)的光 子的數(shù)目)等于其平均值。這為所述光子檢測(cè)器的信噪比設(shè)定了較低的界限。圖17表示 在四個(gè)不同的照射水平所述光子計(jì)數(shù)在所述光子檢測(cè)組件的輸出的分布的直方圖。對(duì)每個(gè) 照射水平，在25ms區(qū)間期間采集所述光子計(jì)數(shù)，然后采用數(shù)據(jù)記錄軟件記錄大約30min。圖 17顯示對(duì)所有四個(gè)照射水平在平均值和方差之間有良好的匹配。這表明所述檢測(cè)的噪聲僅 是由所述檢測(cè)器檢測(cè)的光子流的隨機(jī)性質(zhì)引起，并且所述檢測(cè)器本身不產(chǎn)生任何額外的噪 聲。在一實(shí)施例中，單光子光譜儀可用于需要一靈敏檢測(cè)和識(shí)別由一些已知應(yīng)該染料 組成的混合物的應(yīng)用中。尤其是，這里所描述的光譜儀可用作為光電傳感器用于檢測(cè)DNA 序列分析，其是在一單個(gè)熔融的石英毛細(xì)管中進(jìn)行電泳并通過(guò)采用由現(xiàn)有的Ar-離子和 Nd-YAG激光激發(fā)熒光來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？刹捎梅謩e針對(duì)Ar-離子和Nd-YAG激光器的50D 522nm 和 538nm 激光流線(xiàn)式過(guò)濾器(522AELP，538AELP，Omega Optical Inc, VT, USA)來(lái)消除激光 波長(zhǎng)。參照?qǐng)D18，圖中顯示為一單道DNA序列測(cè)定儀的一實(shí)施例的照片和原理圖。DNA 樣品在如照片所示的單個(gè)毛細(xì)管分離組件中經(jīng)過(guò)電泳分離。所述組件包括一具有一內(nèi)置 電壓表和安培表的小型高壓電源73(高達(dá)15kV)、一聚合物置換系統(tǒng)74、一溫度控制系統(tǒng) 76(25-70°C 士0. Ol0C )、一用于DNA樣品和電泳緩沖液的導(dǎo)管轉(zhuǎn)換傳送帶77以及一精確的光學(xué)系統(tǒng)78。參照?qǐng)D18的原理圖，當(dāng)所述熒光標(biāo)記的DNA片段經(jīng)過(guò)所述光學(xué)系統(tǒng)78時(shí)，它 們被一纖維化的激光器(例如但不限于一由Uniphase，CA制造的Ar-離子激光器(488和 514nm,20mff)或一由 CrystaLaser，NV 制造的 Nd: YAG 激光器(532nm, 25mff, GCL-025-S))照 射。所述激光誘導(dǎo)的熒光由一具有200mkm芯直徑的纖維81采集，并被傳送到所述光譜分 離組件(圖3)。在一實(shí)施例中，由Omega Optical Inc, VT制造的50D 522nm和538nm激 光流線(xiàn)式過(guò)濾器(522AELP和538AELP)可分別用于消除Ar-離子和Nd-YAG激光器的激光 波長(zhǎng)。用從Applied Biosystems (Foster City, CA)獲得的 BigDye 終止子 vl. 1 序列分 析標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記的DNA樣品在25 μ 1甲酰胺中變性，并在注射前立即用HPLC級(jí)別的水稀釋1到 5倍。DNA在40cm (分離長(zhǎng)度35cm)未涂層的毛細(xì)管中以150V/cm的速率進(jìn)行分離，所述未 涂層的毛細(xì)管具有一 50 μ m內(nèi)徑和一 365 μ m外徑，并充滿(mǎn)50°C的P0P-7分離培養(yǎng)基。在該 實(shí)施例中采用電泳緩沖液。至少有兩種有效方法用于估計(jì)由用于標(biāo)記A、C、G和T終止子的四種染料產(chǎn)生的熒 光強(qiáng)度。一種所述方法是分解根據(jù)上述方程式(3)測(cè)量得到的光譜。至于所述完全的測(cè)量 得到的光譜的分解，所述描述各個(gè)染料的光譜分量Ci在實(shí)驗(yàn)上通過(guò)檢測(cè)由每種染料分別發(fā) 出的熒光以及通過(guò)歸一化光子計(jì)數(shù)率的測(cè)量得到的向量而獲得。檢測(cè)每個(gè)時(shí)幀所述混合物 中的各個(gè)染料s[n]的濃度。得到的染料濃度的順序形成四個(gè)序列分析軌跡，并進(jìn)一步用于 堿基測(cè)定(basecalling)。另一個(gè)方法是采用虛擬濾波器。如果所述組分光譜能很好地分離，可采用虛擬濾 波器的方法。包含具有空間上能很好分離的波長(zhǎng)的光譜的入射光照射具有一選擇的可接受 角度的纖維束的輸入端。由于接受角度有限，特定的纖維采集僅來(lái)自特定波長(zhǎng)的信號(hào)并傳 送信號(hào)到所述光檢測(cè)器的特定通道。在一實(shí)施例中，虛擬濾波器可由選擇的三種PMT通道 構(gòu)成，因此由所述三種PMT通道中的一個(gè)通道捕獲每種染料的熒光的三種不同波長(zhǎng)中的每 一種波長(zhǎng)，從而最大地促進(jìn)在指定的通道中測(cè)量，并使得在其他通道中響應(yīng)最小化。該系統(tǒng) 提供用于檢測(cè)不必要的多色熒光的帶通濾波器。在另一實(shí)施例中，由一群若干(例如三根) 纖維或纖維束同時(shí)捕獲一具有特定波長(zhǎng)的特定染料的空間寬譜。所述安排允許所述系統(tǒng)的 動(dòng)態(tài)范圍有顯著增加，而所述系統(tǒng)的信噪比沒(méi)有下降。在一實(shí)施例中，可得到具有窄的發(fā)射光譜的光譜的線(xiàn)性高動(dòng)態(tài)范圍。可通過(guò)一個(gè) 所述PMT通道捕獲每種染料的熒光的若干波長(zhǎng)的每一種波長(zhǎng)，因此最大地促進(jìn)在指定的通 道中檢測(cè)，并使得在其他通道中響應(yīng)最小化。所述纖維將所述特定波長(zhǎng)傳送到IXN光檢測(cè) 器中對(duì)應(yīng)的檢測(cè)器。所述信號(hào)被從所述對(duì)應(yīng)的檢測(cè)器傳送到一 MXN光檢測(cè)器以采集空間 分離光譜?？刹捎猛渡涔鈱W(xué)來(lái)將Nth波長(zhǎng)投射到所述MXN光檢測(cè)器的第Nth柱。因此，由M 單光子光檢測(cè)器同時(shí)采集特定波長(zhǎng)的信號(hào)。所述安排也為所述系統(tǒng)取得高線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍和 高信噪比。在用于所述實(shí)施例的數(shù)據(jù)處理方法中，所述四個(gè)序列分析軌跡進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)處理，所 述標(biāo)準(zhǔn)處理包括噪聲過(guò)濾或平滑、減去基線(xiàn)、除去串?dāng)_、泳動(dòng)率變動(dòng)校正、峰高和間距均等 化。在對(duì)每個(gè)峰的7-15點(diǎn)重新取樣后，所述軌跡以.SCF格式保存，并由標(biāo)準(zhǔn)堿基測(cè)定PHRED 軟件處理。被返回的處理的結(jié)果是堿基測(cè)定的序列以及它們的位置和質(zhì)量評(píng)分。如上所述，至少有兩種方法用于處理DNA序列分析數(shù)據(jù)。參照?qǐng)D19，圖中顯示一系
14統(tǒng)矩陣曲線(xiàn)圖82和分別用于Ar-離子和Nd-YAG激光器的彩色解卷積矩陣83和84，一簡(jiǎn)化 數(shù)據(jù)處理方法將采用從所述PMT的通道18 (546nm)、通道15 (568nm)、通道11 (589nm)和通 道5(610nm)獲得的信號(hào)。通道18、15、11和5分別對(duì)應(yīng)于G、A、T和C。在圖19的下面的 組中以電子數(shù)據(jù)表格式說(shuō)明用于Ar-離子和Nd-YAG激光器的衍生的色彩解卷積矩陣83和 84。相反地，用于檢測(cè)系統(tǒng)矩陣H的光譜分量h可在實(shí)驗(yàn)上通過(guò)測(cè)量得到的由每種染料分 別發(fā)出的熒光以及通過(guò)歸一化如圖19的上面的組的曲線(xiàn)圖82所示的光子計(jì)數(shù)率的測(cè)量得 到的向量而獲得。上述處理序列分析數(shù)據(jù)的方法得到相似的序列分析軌跡和堿基測(cè)定質(zhì)量。然而， 對(duì)于由小信噪比表征的測(cè)量方法，由于其采用關(guān)于由每種染料發(fā)出的熒光的完整信息而不 是采用僅在所述光譜儀的四種選擇的通道中獲得的熒光的信息，因此完整測(cè)量光譜的分解 得到更好的結(jié)果。采用從所述染料獲得的完整的熒光光譜的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所述檢測(cè)動(dòng)態(tài)范 圍的顯著增加。實(shí)際上，在這里所述的32通道光傳感器中，所述通道具有高達(dá)每秒2 X IO7 光子計(jì)數(shù)的線(xiàn)性響應(yīng)，并且如果所述檢測(cè)的熒光染料具有寬的光譜，對(duì)于該染料的所述檢 測(cè)的線(xiàn)性范圍將與所述傳感器的同時(shí)照射的通道的數(shù)目成比例。圖20顯示用采用Ar-離子和Nd-YAG激光器的這里描述的光譜儀的一個(gè)實(shí)施例獲 得兩個(gè)DNA序列分析軌跡和堿基測(cè)定質(zhì)量評(píng)分。用所述兩個(gè)激光器記錄的序列分析軌跡非 常相似，而所述質(zhì)量評(píng)分幾乎相同。得到的Q20序列閱讀長(zhǎng)度為大約650個(gè)堿基對(duì)，所述閱 讀長(zhǎng)度與由在現(xiàn)有的DNA測(cè)序儀(例如Applied Biosystems Inc制造的ABI-3730型)中 相同毛細(xì)管長(zhǎng)度得到的閱讀長(zhǎng)度非常一致。在一實(shí)施例中，所述單光子光譜儀可識(shí)別和精確地譯解色碼。參照?qǐng)D21，上面的組 顯示檢測(cè)和解碼包含三種具有強(qiáng)烈重疊光譜的QDs的混合物。圖21的中間的組顯示當(dāng)QD2 的混合物含量從0%變化到15%時(shí)，可得到預(yù)混合的和解碼的濃度的幾乎完美的匹配。圖 21的下面的組的曲線(xiàn)顯示由對(duì)每種QDs的混合物進(jìn)行幾千次測(cè)量(每次測(cè)量大約10，000 光子)而得到的解碼統(tǒng)計(jì)結(jié)果以及由單光子光譜進(jìn)行的測(cè)量的計(jì)算機(jī)模擬而得到的解碼 結(jié)果。在一實(shí)施例中，所述單光子光譜儀可檢測(cè)色編碼的微粒。參照?qǐng)D22，圖中顯示一小 珠閱讀器系統(tǒng)，在所述小珠閱讀器系統(tǒng)中各個(gè)小珠懸浮在一保持在一小珠抽出系統(tǒng)86中 的緩沖液中。通過(guò)以高速將所述小珠壓出通過(guò)一毛細(xì)管87來(lái)檢測(cè)所述小珠。一激發(fā)光束 88激發(fā)所述小珠內(nèi)的熒光。通過(guò)一光纖維化的檢測(cè)器89檢測(cè)所述熒光，并且所述熒光被 傳送通過(guò)一合適的光譜儀或光學(xué)反射系統(tǒng)91到達(dá)一單光子檢測(cè)器92。由一計(jì)算機(jī)記錄所 述檢測(cè)的信號(hào)(未顯示)并適當(dāng)?shù)靥幚硭鲇涗浀臄?shù)據(jù)。在一實(shí)施例中，所述抽出系統(tǒng)86 是一可編程的微量泵，且所述毛細(xì)管是一 25 μ m ID毛細(xì)管。所述毛細(xì)管被插入到一光學(xué)頭 (optical head)(未顯示)以確保由激發(fā)光束88均勻照亮所述毛細(xì)管。所述光束88由一 合適的纖維化激光源(未顯示)產(chǎn)生。當(dāng)所述小珠經(jīng)過(guò)所述激光束時(shí)，它們發(fā)出熒光，所 述熒光由纖維化的小型物鏡(micro-objective) 89收集。收集的熒光被傳送到所述光譜儀 91，在那里由單光子檢測(cè)器92檢測(cè)，在本實(shí)施例中所述單光子檢測(cè)器92是一高速多通道檢 測(cè)器。參照?qǐng)D23，可采用圖22的小珠閱讀器來(lái)檢測(cè)隨機(jī)染色的小珠。在一實(shí)施例中，檢 測(cè)用量子點(diǎn)(quantum dots)染色的聚苯乙烯珠。得到的對(duì)100個(gè)所述小珠解碼的結(jié)果在圖23中顯示，其中所述χ軸表示由小珠閱讀器檢測(cè)的順序(order)中的小珠數(shù)量，所述y 軸表示歸一化到1的小珠代碼。前述小珠檢測(cè)系統(tǒng)的主要特征是小珠的數(shù)量，所述小珠的數(shù)量可在每單位時(shí)間 檢測(cè)，并以要求的精度解碼。一般來(lái)說(shuō)，解碼精度由在小珠檢測(cè)時(shí)間期間采集的光子數(shù)量 決定。應(yīng)理解的是對(duì)于購(gòu)買(mǎi)得到的多組量子點(diǎn)，如果從所述小珠采集得到的光子總數(shù)大于 104，可得到高達(dá)99%的解碼精度。檢測(cè)所述小珠的速率取決于所述光子檢測(cè)器的動(dòng)態(tài)范 圍。參照?qǐng)D24的方框圖，在一實(shí)施例中，用一光子檢測(cè)器檢測(cè)得到高達(dá)每秒IO4的小珠的 檢測(cè)率，所述光子檢測(cè)器包括一光譜分離組件93、一 32通道PMT94、一 32通道FPGA96、一高 速USB微控制器97和一計(jì)算機(jī)98。所述系統(tǒng)具有一每通道每秒IO8光子計(jì)數(shù)的線(xiàn)性范圍 和一每秒32MB的數(shù)據(jù)傳送率。圖25顯示在圖24中方框圖顯示的所述系統(tǒng)的32通道脈沖 放大器的一個(gè)通道的電路原理圖。盡管上面描述具有一定程度的特異性或精確度的各種實(shí)施例，或參考各個(gè)實(shí)施例 的一個(gè)或多個(gè)，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離這里要求保護(hù)的本發(fā)明的精神或范圍，可對(duì)公開(kāi) 的實(shí)施例作出各種改變。其目的是在上述說(shuō)明書(shū)中包含的并在附圖中顯示的所有的主題， 將被解釋作為僅對(duì)特定實(shí)施例進(jìn)行舉例說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。在不脫離本發(fā)明的基礎(chǔ)上 作出的細(xì)節(jié)或結(jié)構(gòu)上的改變?nèi)缫韵碌臋?quán)利要求書(shū)所界定。
權(quán)利要求
一種單光子傳感器，包括至少一多通道光傳感器，每個(gè)光傳感器通道具有適于接收不同光譜并適于在響應(yīng)所述接收的光譜的單光子時(shí)產(chǎn)生電流脈沖的光敏像素；一多通道放大器，每個(gè)放大器通道適于從所述多通道光傳感器的所述傳感器通道中的對(duì)應(yīng)的一個(gè)通道接收所述響應(yīng)光譜的電流脈沖并適于放大所述電流脈沖；以及一多通道光子計(jì)數(shù)器，每個(gè)計(jì)數(shù)器通道適于從所述多通道放大器的所述放大器通道中對(duì)應(yīng)的一個(gè)通道接收所述放大的電流脈沖，所述多通道光子計(jì)數(shù)器具有一適于在預(yù)設(shè)的時(shí)間間隔累計(jì)在每個(gè)計(jì)數(shù)器通道內(nèi)所述放大的電流脈沖的積分儀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，所述單光子傳感器包括將多色光傳輸?shù)揭还?譜分離器上的光導(dǎo)纖維。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單光子傳感器，其中，所述至少一個(gè)多通道光傳感器包括一 具有多通道的線(xiàn)性光電倍增管陣列，每一個(gè)所述通道接收來(lái)自所述光譜分離器的不同光譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單光子傳感器，其中，所述線(xiàn)性光電倍增管陣列選自下列組 包括具有多于4個(gè)通道的線(xiàn)性光電倍增管陣列、具有多于8個(gè)通道的線(xiàn)性光電倍增管陣列、 具有多于16個(gè)通道的線(xiàn)性光電倍增管陣列和具有多于32個(gè)通道的線(xiàn)性光電倍增管陣列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單光子傳感器，其中，所述線(xiàn)性光電倍增管陣列包括32個(gè)通道。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單光子傳感器，其中，所述多通道放大器包括32個(gè)脈沖放大 通道，每個(gè)所述脈沖放大通道適于接收來(lái)自所述線(xiàn)性光電倍增管陣列的32個(gè)通道中的對(duì) 應(yīng)的一個(gè)通道的所述電流脈沖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，其中，由所述至少一個(gè)多通道光傳感器的每 個(gè)通道產(chǎn)生的每個(gè)所述電流脈沖具有一小于2納秒的持續(xù)時(shí)間τ響’
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，其中，由所述至少一個(gè)多通道光傳感器的每 個(gè)通道產(chǎn)生的每個(gè)所述電流脈沖具有一小于1納秒的持續(xù)時(shí)間τ響’
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，其中，由所述至少一個(gè)多通道光傳感器的每 個(gè)通道產(chǎn)生的每個(gè)所述電流脈沖具有一小于0.1納秒的持續(xù)時(shí)間τ響’
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，其中，由所述至少一個(gè)多通道光傳感器的每 個(gè)通道產(chǎn)生的每個(gè)所述電流脈沖具有一小于0.01納秒的持續(xù)時(shí)間τ響’
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，其中，所述多通道光子計(jì)數(shù)器的線(xiàn)性光子計(jì) 數(shù)范圍為每秒至少I(mǎi)O7光子計(jì)數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，其中，所述多通道光子計(jì)數(shù)器的線(xiàn)性光子計(jì) 數(shù)范圍為每秒至少I(mǎi)O8光子計(jì)數(shù)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，其中，所述多通道光子計(jì)數(shù)器的線(xiàn)性光子計(jì) 數(shù)范圍R是R ≥ 1/τ響應(yīng) ，其中τ 是所述單光子計(jì)數(shù)器為響應(yīng)一單光子所需要的時(shí)間。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，其中，所述多通道光傳感器包括一硅光電倍 增管，所述多通道光傳感器的每個(gè)通道包括各個(gè)像素的矩陣，所述通道在一普通硅襯底上 并聯(lián)連接在一起。
15.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單光子傳感器，所述單光子傳感器包括一對(duì)所述多通道光傳感器以及一適于接收入射的多色光以及適于產(chǎn)生所述多色光的兩個(gè)分離光束的分光器， 每個(gè)所述光束入射在一對(duì)所述光譜分離器中的一光譜分離器上。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的單光子傳感器，其中，每個(gè)所述一對(duì)多通道光子傳感器的 每個(gè)傳感器通道具有光敏像素，所述光敏像素適于接收來(lái)自所述一對(duì)光譜分離器的每一個(gè) 的不同光譜以及適于響應(yīng)其而產(chǎn)生電流脈沖。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的單光子傳感器，其中，所述分束器包括一二色鏡。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的單光子傳感器，其中，所述分束器包括一半透明鏡。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單光子傳感器，其中，所述多色光包括由一由多種熒光染料 構(gòu)成的混合物產(chǎn)生的熒光光譜。
20.一種單光子傳感器，包括光導(dǎo)纖維，所述光導(dǎo)纖維適于接收入射多色光的單個(gè)波長(zhǎng) 以及適于將所述光的單個(gè)波長(zhǎng)傳送到限定多通道光傳感器的一個(gè)或多個(gè)通道的光敏像素。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的單光子傳感器，其中，所述入射多色光包括由一由多種熒 光染料構(gòu)成的混合物產(chǎn)生的熒光光譜。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的單光子傳感器，其中，所述光導(dǎo)纖維包括限定一接收對(duì)應(yīng) 所述入射熒光光譜的單個(gè)波長(zhǎng)的光的預(yù)設(shè)的角度的輸入端。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的單光子傳感器，其中，每個(gè)所述光導(dǎo)纖維適于接收所述入 射熒光光譜的單個(gè)波長(zhǎng)，所述入射熒光光譜的單個(gè)波長(zhǎng)與由其它所述光導(dǎo)纖維接收的入射 熒光光譜的波長(zhǎng)不同，并且每個(gè)所述光導(dǎo)纖維適于將入射熒光光譜的單個(gè)波長(zhǎng)傳送到所述 多通道光傳感器的一對(duì)應(yīng)通道上。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的單光子傳感器，其中，預(yù)設(shè)的多個(gè)所述光導(dǎo)纖維適于接收 所述入射熒光光譜的單個(gè)波長(zhǎng)，并適于將所述入射熒光光譜的單個(gè)波長(zhǎng)傳送到所述多通道 光傳感器的一對(duì)應(yīng)的多通道上。
25.一種鑒別DNA序列的方法，包括以下步驟用熒光染料標(biāo)記所選的DNA片段；將所述DNA片段輸入到一光導(dǎo)纖維分離毛細(xì)管；用一預(yù)設(shè)波長(zhǎng)的激光照射在所述光導(dǎo)纖維分離毛細(xì)管內(nèi)的所述標(biāo)記的DNA片段以產(chǎn) 生來(lái)自所述DNA片段的熒光光譜；用來(lái)自所述DNA片段的熒光光譜照射光導(dǎo)纖維，所述光導(dǎo)纖維傳送所述熒光光譜到一 光譜分離器，將所述光譜分離器的輸出入射在至少一多通道光傳感器上，每個(gè)具有光敏像 素的光傳感器通道適于接收來(lái)自所述光譜分離器的不同光譜并適于在響應(yīng)所述不同光譜 的每個(gè)不同波長(zhǎng)的單個(gè)光子時(shí)產(chǎn)生電流脈沖。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述激光由選自下列組包括Ar-離子和Nd YAG激光器的激光器產(chǎn)生，所述激光器的波長(zhǎng)在488nm到532nm的范圍內(nèi)。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述預(yù)設(shè)波長(zhǎng)是488nm、514nm和532nm中的一個(gè)。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述光導(dǎo)纖維分離毛細(xì)管具有一大約為200微 米的芯直徑。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，所述方法包括在所述光導(dǎo)纖維分離毛細(xì)管中電泳分 離所述DNA片段的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述至少一個(gè)多通道光傳感器包括一32通道 的線(xiàn)性光電倍增管陣列。
31.一種檢測(cè)顏色編碼的微粒的方法，包括以下步驟 用熒光染料標(biāo)記微粒；在一緩沖液中懸浮所述標(biāo)記的微粒；以一預(yù)設(shè)速度將具有所述標(biāo)記的微粒的緩沖液傳送通過(guò)一光導(dǎo)纖維毛細(xì)管； 用激光照射在所述光導(dǎo)纖維毛細(xì)管中的所述標(biāo)記的微粒以從其中產(chǎn)生熒光光譜； 用來(lái)自所述標(biāo)記的微粒的熒光光譜照射光導(dǎo)纖維，所述光導(dǎo)纖維傳送所述熒光光譜到 一光譜分離器，將所述光譜分離器的輸出入射在至少一多通道光傳感器上，每個(gè)具有光敏 像素的光傳感器通道適于接收來(lái)自所述光譜分離器的不同光譜并適于在響應(yīng)所述不同光 譜的每個(gè)不同波長(zhǎng)的單個(gè)光子時(shí)產(chǎn)生電流脈沖。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，所述方法包括用權(quán)利要求1所述的單光子計(jì)數(shù)器計(jì) 數(shù)所述不同光譜的每個(gè)不同波長(zhǎng)的所述光子的步驟。
全文摘要
一種基于32通道PMT傳感器的纖維化單光子敏感光譜儀是高度敏感的，其具有寬的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍。所述光譜儀能精確地和高速地檢測(cè)、鑒定和分析用多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記的生物樣品，所述熒光標(biāo)記物為例如由多種熒光染料發(fā)出的多色熒光信號(hào)或發(fā)射光的組合物。所述光譜儀的光纖維輸入允許方便的有效連接到任何基于纖維采集所述分析的熒光的檢測(cè)系統(tǒng)。所述光譜儀提供高度精確的DNA序列分析。一32通道PMT單光子檢測(cè)器具有一大于20bits的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍，以及一每秒大約3300幀的幀速率。所述檢測(cè)器的像素的動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到每秒108光子計(jì)數(shù)。
文檔編號(hào)G01J3/28GK101889192SQ200880114477
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月25日
發(fā)明者喬治亞·古德科夫, 伊萬(wàn)·托夫卡奇, 伯利斯·左博維斯奇, 安德烈·特蘇普力克, 德米特羅·古德考夫, 德米特里·蓋弗瑞洛夫, 維拉·左芬科勒 申請(qǐng)人:紐約州立大學(xué)研究基金會(huì)