專(zhuān)利名稱(chēng)：利用切割序列和間隔子的共振能量轉(zhuǎn)移測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是關(guān)于與肉毒桿菌(Botulinum)毒素和破傷風(fēng)毒素相關(guān)的蛋白酶 測(cè)定白勺焚光共才辰能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer)令頁(yè)域。背景肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產(chǎn)生，其是已 知的最強(qiáng)的毒素。此類(lèi)毒素是食物中毒的公認(rèn)來(lái)源，通常導(dǎo)致受害者的嚴(yán)重?fù)p害或甚至死 亡。存在7種結(jié)構(gòu)相關(guān)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素或血清型(BoNT/A-G)，其各自由重鏈(大約 100KD)和輕鏈(大約50KD)組成。重鏈通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用介導(dǎo)毒素進(jìn)入靶細(xì)胞。 一旦內(nèi)化，輕鏈便從內(nèi)體小泡腔轉(zhuǎn)移入細(xì)胞溶質(zhì)，并且充當(dāng)鋅依賴(lài)蛋白酶(zinc-cbpendent protease)來(lái)切割介導(dǎo)小泡-靶膜融合的蛋白(“底物蛋白(substrate proteins)”)。此類(lèi)BoNT底物蛋白包括質(zhì)膜蛋白突觸融合蛋白(syntaxin)、外在膜蛋白SNAP-25 和小泡膜蛋白小突觸囊泡蛋白(Synaptobrevin) (Syb)。此類(lèi)蛋白統(tǒng)稱(chēng)為SNARE(可溶性 N-乙基馬來(lái)亞胺敏感因子附著蛋白受體)蛋白。SNARE蛋白的切割阻止了小泡與質(zhì)膜的 融合，從而消除了神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)肌肉接頭的釋放。在SNARE蛋白當(dāng)中，突觸融合蛋白和 SNAP-25通常存在于靶膜上，從而稱(chēng)為t-SNARE，然而發(fā)現(xiàn)小突觸囊泡蛋白只與突觸內(nèi)的突 觸小泡在一起，從而被稱(chēng)為v-SNARE。這三類(lèi)蛋白一起形成了據(jù)認(rèn)為是介導(dǎo)小泡膜與質(zhì)膜之 間的融合的最小機(jī)器的復(fù)合物。BoNT/A、E和C1在單個(gè)但不同的位點(diǎn)上切割SNAP-25，BoNT/ B、D、F、G切割小突觸泡蛋白(Syb)。除了 SNAP-25外，BoNT/C還切割突觸融合蛋白。由于它們作為食物中毒源以及生物恐怖主義帶來(lái)的威脅，存在對(duì)靈敏且快速地檢 測(cè)BoNT的需要。目前，大多數(shù)檢測(cè)毒素的靈敏方法是在小鼠中進(jìn)行毒性測(cè)定。該方法需要 大量小鼠，非常費(fèi)時(shí)并且不能用于研究毒素催化動(dòng)力學(xué)。已發(fā)展了許多基于使用抗毒素抗 體的放大免疫測(cè)定系統(tǒng)(amplified immunoassay system)，但大部分此類(lèi)系統(tǒng)需要復(fù)雜且 昂貴的放大處理，從而也不能用于研究毒素催化動(dòng)力學(xué)。雖然HPLC和免疫測(cè)定可用于檢測(cè) 已切割的底物分子和測(cè)量此類(lèi)毒素的酶促活性，但此類(lèi)方法通常非常費(fèi)時(shí)且復(fù)雜，它們中 的一些方法需要特殊的抗體，從而使它們不適用于大規(guī)模篩查。因此，存在對(duì)用于檢測(cè)BoNT 的新型和改進(jìn)的方法以及組合物的需要。在FRET測(cè)定中，使用兩種熒光生成氨基酸衍生物在含有毒素切割位點(diǎn)的非常短 的合成肽(20-35個(gè)氨基酸)中取代兩個(gè)天然氨基酸。當(dāng)它們?cè)陔闹斜舜丝拷鼤r(shí)，一個(gè)氨 基酸衍生物的熒光信號(hào)被另一個(gè)氨基酸衍生物猝滅，該機(jī)制稱(chēng)為“F0rster共振能量轉(zhuǎn)移 (Forster resonance energytransfer)，，(FRET)。肽的切割將兩個(gè)氨基酸衍生物分開(kāi)，并 且可檢測(cè)FRET的減少。FRET測(cè)定已被成功地用于檢測(cè)BoNT。(參見(jiàn)例如，屬于Chapman的2003年10 月28日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0191887,2004年12月20日提交的屬于Chapman的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2006/0134722，屬于Steward的美國(guó)專(zhuān)利7208285(2007年4月)和屬于 Fernandez-Salas的美國(guó)專(zhuān)利7183066 (2007年2月)，其各自以它們的全文通過(guò)引用合并 入本文。在合并的參考文獻(xiàn)中的術(shù)語(yǔ)的定義或用途與本文中提供的該術(shù)語(yǔ)的定義不一致或 相反的情況下，使用本文中提供的術(shù)語(yǔ)的定義而不使用參考文獻(xiàn)中該術(shù)語(yǔ)的定義)。雖然已在應(yīng)用FRET測(cè)定來(lái)檢測(cè)BoNT中顯示了一些成功，但靈敏性和特異性不足。 因此需要改進(jìn)的裝置、系統(tǒng)和方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了裝置、系統(tǒng)和方法，其中分子構(gòu)造物(construct)包括供體標(biāo)記、受 體標(biāo)記、位于供體與受體之間的連接體肽、具有切割位點(diǎn)序列的連接體(linker)以及(a) 供體與切割位點(diǎn)序列和(b)受體與切割位點(diǎn)序列的至少一個(gè)之間的間隔子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將供體和受體標(biāo)記定位成提供電子耦合(electronic coupling)，這樣供體標(biāo)記可通過(guò)偶極-偶極耦合(dipole-dipole coupling)機(jī)制將能量 轉(zhuǎn)移至受體標(biāo)記。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，偶極-偶極耦合機(jī)制是.Fiirster共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)。供體和受體標(biāo)記可以是生色團(tuán)或熒光基團(tuán)部分，其中供體標(biāo)記的發(fā)射光譜與受體 標(biāo)記的激發(fā)光譜重疊。優(yōu)選，供體是綠色熒光蛋白或其變體，受體是相應(yīng)的綠色熒光蛋白的 變體。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選供體和受體標(biāo)記(熒光基團(tuán)對(duì))是CFP-YFP。在優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體肽是選自小突觸泡蛋白(VAMP)、突觸融合蛋白和 SNAP-25或其可被肉毒桿菌神經(jīng)毒素識(shí)別和切割的片段(“可切割片段”)的肉毒桿菌神 經(jīng)毒素的底物。這些蛋白統(tǒng)稱(chēng)為SNARE(可溶性η-乙基馬來(lái)亞胺敏感因子附著蛋白受體) 蛋白。連接體可具有任何合適長(zhǎng)度的一級(jí)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度，包括例如，大于或等于5nm、8nm、10nm、 12nm、14nm 和 20nm 的長(zhǎng)度。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，完整構(gòu)造物包含CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP或 CFP- (SGLRSRA)-小突觸泡蛋白-(SNS) -YFP。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體肽包含至少大約14個(gè)氨基酸和選自SEQID NOs :1至 6(下文中論述的)的氨基酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體肽包含至少大約15個(gè)，或至 少大約16個(gè)，或至少大約17個(gè)，或至少大約18個(gè)，或至少大約19個(gè)，或至少大約20個(gè)，或 至少大約21個(gè)，或至少大約22個(gè)，或至少大約23個(gè)，或至少大約24個(gè)，或至少大約25個(gè)， 或至少大約26個(gè)，或至少大約27個(gè)，或至少大約28個(gè)，或至少大約29個(gè)氨基酸殘基，以及 序列選自SEQ ID NOs 1-6 (下文中論述的)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體肽包含至少大約30個(gè)氨基酸殘基和選自SEQ ID NOs 1至6的氨基酸序列。更優(yōu)選，連接體肽包含至少大約35個(gè)氨基酸殘基，或至少大約40個(gè) 氨基酸殘基，或至少大約45個(gè)氨基酸殘基，或至少大約50個(gè)氨基酸殘基。在特別優(yōu)選實(shí)施 方案中，本發(fā)明的構(gòu)造物包含含有大約55個(gè)氨基酸殘基，或至少大約65個(gè)氨基酸殘基的連 接體多肽。本發(fā)明的切割位點(diǎn)序列可有利地包含(a)SNARE蛋白、基序、突變蛋白和(b)具有 至少5個(gè)氨基酸的間隔子，其中間隔子包括選自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中η是1 至3。蛋白質(zhì)的“突變蛋白”在本文中應(yīng)當(dāng)被解釋為具有與相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)至少30%的同一性，包括例如具有與天然蛋白質(zhì)至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或98 %的同一性的組成。同一性的變化可包括任何或許多添 加、缺失和置換。涉及的突變蛋白包括片段、截?cái)嗪腿诤系鞍?。本發(fā)明的間隔子可具有任何合適的氨基酸數(shù)目，但優(yōu)選至少3，5，7，10，12或15個(gè) 氨基酸。間隔子可包括選自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中η是1至3。備選地，間隔 子可包含SNARE基序。有利地，相對(duì)于相應(yīng)的無(wú)間隔子的構(gòu)造物，這樣的間隔子構(gòu)型增加了 供體標(biāo)記與受體標(biāo)記之間的電子耦合。本發(fā)明還提供了編碼上述構(gòu)造物的分離的多核苷酸分子。構(gòu)造物優(yōu)選是包含與啟 動(dòng)子有效(operably)連接的多核苷酸分子的表達(dá)載體。用于本發(fā)明的優(yōu)選啟動(dòng)子是誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了包含上述分離的多核苷酸分子的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì) 胞選自原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞、PC12細(xì)胞或其衍生物、原代培養(yǎng)的chromaphin細(xì)胞、成神 經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(neuroblastoma cell)、人腎上腺素能(human adrenergic) SK-N-SH 細(xì)胞 和NS-26細(xì)胞系。優(yōu)選，細(xì)胞是皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞、海馬神經(jīng)元細(xì)胞、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞 (spinalcord motor neuron cell)或鼠膽喊能 Neuro 2a 細(xì)胞。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在合適的容器中裝有本發(fā)明的構(gòu)造物的試劑
品.ο涉及的提高供體標(biāo)記與受體標(biāo)記之間的能量轉(zhuǎn)移的靈敏性的方法包括(a)提供 包含在物理上通過(guò)連接體偶聯(lián)的供體標(biāo)記和受體標(biāo)記的構(gòu)造物，(a)在連接體內(nèi)包含切割 位點(diǎn)序列；和(b)在連接體內(nèi)在供體與切割位點(diǎn)序列和受體與切割位點(diǎn)序列的至少一個(gè)之 間包含間隔子，由此增加供體與受體之間的電子耦合。本文中涉及的構(gòu)造物可用于完整細(xì) 胞、裂解物或包含活性肽酶的任何材料。然而不希望受任何特定理論或作用機(jī)制的束縛，預(yù)期間隔子通過(guò)增加供體與受體 之間的電子耦合來(lái)提高靈敏性和特異性，這相應(yīng)地通過(guò)(a)減少供體與受體之間的三級(jí)結(jié) 構(gòu)距離，和(b)提供供體與受體之間的電子躍遷(electronic hop)引起。在優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)造物是基于蛋白質(zhì)的構(gòu)造物，連接體是肽序列，切割位點(diǎn)序 列包括SNARE蛋白或其片段或突變蛋白，間隔子包含至少3、5、7、10、12和15個(gè)氨基酸。間 隔子可包括選自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中η是1至3。本文中還公開(kāi)的是用于檢測(cè)肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法，方法包括(a)提供上文中 描述的構(gòu)造物，其中連接體是相應(yīng)于待檢測(cè)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的底物蛋白或其可切割片 段，(b)在肉毒桿菌神經(jīng)毒素在其下可切割蛋白底物或其片段的條件下將構(gòu)造物暴露于懷 疑含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的樣品，和(c)在將構(gòu)造物暴露于樣品之前和之后檢測(cè)和比較 FRET信號(hào)，其中FRET的減小表明樣品中存在肉毒桿菌神經(jīng)毒素。在優(yōu)選實(shí)施方案中，向待 檢測(cè)的樣品中加入額外的Zn2+。本發(fā)明的方法適合于選自BoNT/A、E和C的肉毒桿菌神經(jīng) 毒素的檢測(cè)，相應(yīng)的底物蛋白是SNAP-25或其可切割片段。本發(fā)明的方法還適用于BoNT/B、 D、F或G的檢測(cè)，使用小突觸泡蛋白(Syb)或其可切割片段作為相應(yīng)的底物蛋白。類(lèi)似地， 本發(fā)明的方法適用于使用SNAP-25或其可切割片段作為相應(yīng)的底物蛋白來(lái)檢測(cè)BoNT/C。在優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)于本發(fā)明的方法，通過(guò)選自下列的方法來(lái)檢測(cè)FRET 1)測(cè) 量在受體(A)發(fā)射波長(zhǎng)和供體(D)發(fā)射波長(zhǎng)上發(fā)射的熒光，并且通過(guò)各自發(fā)射振幅的比率測(cè)定能量轉(zhuǎn)移；2)測(cè)量D的熒光壽命；3)測(cè)量D的光漂白速率；4)測(cè)量D或A的各向異性； 和5)測(cè)量斯托克斯位移激發(fā)單體/激基締合物熒光(monomer/excimer fluorescence)。本發(fā)明還提供了用于篩選肉毒桿菌神經(jīng)毒素的抑制劑的方法，包括提供經(jīng)遺傳工 程改造以表達(dá)上述構(gòu)造物的細(xì)胞，其中構(gòu)造物中的連接體是相應(yīng)于肉毒桿菌神經(jīng)毒素的底 物肽；將所述細(xì)胞在候選抑制劑化合物存在的情況下暴露于肉毒桿菌神經(jīng)毒素；然后在暴 露于所述肉毒毒素之前和之后檢測(cè)細(xì)胞的FRET信號(hào)，其中與在候選抑制劑不存在的情況 下暴露于肉毒桿菌神經(jīng)毒素的細(xì)胞相比較，F(xiàn)RET無(wú)明顯減少的觀察表明候選抑制劑能夠抑 制肉毒桿菌神經(jīng)毒素。優(yōu)選，候選化合物在化合物的文庫(kù)當(dāng)中，方法是高通量方法。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測(cè)肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法，方法包括將 一層BoNT靶肽置于金屬表面上，在允許BoNT切割金屬表面上的靶肽的條件下將在其表面 上具有BoNT靶肽的所述金屬表面暴露于懷疑含有相應(yīng)的BoNT的樣品，和通過(guò)等離子體共 振成像測(cè)量作為BoNT切割的結(jié)果而產(chǎn)生的結(jié)合至金屬表面的靶肽的分子量的任何減少。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于檢測(cè)肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法，所述方法包括a) 提供本文中所述的構(gòu)造物，其中連接體是相應(yīng)于待檢測(cè)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的底物蛋白或 其可切割片段，其中將構(gòu)造物錨著至細(xì)胞的質(zhì)膜，這樣連接體蛋白可采用構(gòu)象，通過(guò)該構(gòu)象 在供體與受體熒光基團(tuán)之間可發(fā)生FRET，b)將構(gòu)造物在肉毒桿菌神經(jīng)毒素在其下可切割 蛋白質(zhì)底物或其片段的條件下暴露于懷疑含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的樣品，和c)在將構(gòu)造 物暴露于樣品之前和之后檢測(cè)和比較FRET信號(hào)，其中FRET的減小表明樣品中存在肉毒桿 菌神經(jīng)毒素。本發(fā)明還提供了包含連接肽、第一熒光基團(tuán)部分和第二熒光基團(tuán)部分的分子構(gòu)造 物，其中連接體肽是選自小突觸泡蛋白、突觸融合蛋白和SNAP-25或其能夠被肉毒桿菌神 經(jīng)毒素切割的片段的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的底物，其中第一熒光基團(tuán)部分的發(fā)射光譜可檢測(cè) 地與第二熒光基團(tuán)部分的激發(fā)光譜不同。優(yōu)選，連接體是底物小突觸泡蛋白、突觸融合蛋白 或SNAP-25的全長(zhǎng)蛋白。優(yōu)選，構(gòu)造物被錨著至小泡，其可以在或可以不在細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明 還提供了編碼上述多肽構(gòu)造物的多核苷酸構(gòu)造物。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法，方法包括a)提供上述肽構(gòu) 造物，b)在肉毒桿菌神經(jīng)毒素在其下可切割蛋白質(zhì)構(gòu)造物或其片段的條件下將構(gòu)造物暴露 于懷疑含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的樣品，和c)檢測(cè)第一和第二熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)的空間 分離，其中空間分離的發(fā)生表明樣品中存在肉毒桿菌神經(jīng)毒素。優(yōu)選，小泡存在于活細(xì)胞 內(nèi)，連接體肽是連接至SNAP-25 (198-206) -YFP的CFP-SNAP-25 (1-197)，其中檢測(cè)到CFT熒 光但非YFP熒光，表明肉毒桿菌神經(jīng)毒素在樣品中的存在。根據(jù)下列優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述和其中相同的數(shù)字代表相同的組成部分的附 圖，本發(fā)明主題的不同目的、特征、方面和有利方面將變得更顯然。附圖概述

圖1是用于監(jiān)控肉毒桿菌神經(jīng)毒素的蛋白酶活性的基于CFP-YFP的生物傳感器 的示意圖。圖IA是生物傳感器構(gòu)造物的設(shè)計(jì)。CFP和YFP分別通過(guò)小突觸泡蛋白(氨基 酸33-94，上圖)或SNAP-25(氨基酸141-206，下圖)的片段連接。對(duì)這些片段上的各肉毒 桿菌神經(jīng)毒素的切割位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。圖IB顯示CFP和YFP用作FRET的供體-受體對(duì)，其 中CFP的激發(fā)導(dǎo)致YFP熒光的發(fā)射(上圖)。在用肉毒桿菌神經(jīng)毒素切割小突觸泡蛋白或SNAP-25片段后(下圖)，連接的CFP與YFP之間的能量轉(zhuǎn)移被消除。CFP的最佳激發(fā)波長(zhǎng) 是434nM，發(fā)射峰是470nM (對(duì)于CFP)，和527nM(對(duì)于YFP)。圖2顯示重組生物傳感器蛋白的熒光發(fā)射光譜。圖2A顯示單獨(dú)的重組his6-標(biāo)記 的CFP和YFP(300nM)以及這兩種蛋白質(zhì)的混合物(1 1)的發(fā)射光譜。使用PTIQM-I熒 光計(jì)在 Ifepes 緩沖液(50mM Hepes,2mM DTT 和 10 μ M ZnCl2, ρΗ7. 1)中收集從 450 至 550ηΜ 的熒光信號(hào)。激發(fā)波長(zhǎng)是434nM，CFP的最佳波長(zhǎng)。YFP蛋白通過(guò)在434nM處直接激發(fā)只引 起少量的熒光發(fā)射信號(hào)。圖2B顯示重組his6-標(biāo)記的CFP-SybII-YFP的發(fā)射光譜，如圖框 圖2A中所述收集的。箭頭標(biāo)示通過(guò)FRET產(chǎn)生的YFP發(fā)射峰。圖3描述了肉毒桿菌神經(jīng)毒素對(duì)生物傳感器蛋白的切割可通過(guò)體外實(shí)時(shí)發(fā)射 光譜掃描來(lái)監(jiān)控。A)在 37°C 下用 2mM DTT, 10 μ M ZnCl2 預(yù)還原(pre-reduced) BoNT/ B，進(jìn)行 30 分鐘。向裝有 300nM H印es 緩沖液(50mM Hepes,2mM ΤΤ,ΙΟμΜ ZnCl2)中的 CFP-SybII-YFP蛋白的小杯中加入50ηΜ毒素。如圖2Α中所述在加入毒素之前和之后的 指定的時(shí)間點(diǎn)上記錄發(fā)射光譜(上圖)。在各發(fā)射掃描后從小杯中取出30μ 1樣品，將其 與SDS上樣緩沖液混合。將這些樣品經(jīng)歷SDS-page和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)。使用在融合 蛋白N末端上識(shí)別his6標(biāo)簽的抗his6抗體檢測(cè)CFP-SybII-YFP融合蛋白的切割(下圖)。 CFP-SybII-YFP融合蛋白的切割導(dǎo)致減少的YFP熒光和增加的CFP熒光。通過(guò)發(fā)射光譜掃 描實(shí)時(shí)記錄該變化。B)將CFP-SybII-YFP用于檢測(cè)BoNT/F活性，如圖A中所描述的。C) 將CFP-SNAP-25-YFP用于檢測(cè)BoNT/A的活性(使用IOnM毒素)，如圖A中所描述的。D) 將CFP-SNAP-25-YFP用于檢測(cè)BoNT/E的活性(使用IOnM毒素)，如圖A中所描述的。圖4顯示在微量滴定板熒光分光光度計(jì)中使用生物傳感器蛋白進(jìn)行的肉毒桿 菌神經(jīng)毒素的蛋白酶動(dòng)力學(xué)的監(jiān)控。A)可使用平板讀取器(plate-reader)實(shí)時(shí)記錄 肉毒桿菌神經(jīng)毒素切割生物傳感器蛋白的過(guò)程中熒光的變化。將IOnM BoNT/A與300nM CFP-SNAP-25-YFP混合，使用平板讀取器掃描100 μ 1/孔樣品。激發(fā)為434nm，對(duì)于各數(shù)據(jù) 點(diǎn)，收集470nm(CFP通道)和527nm(YFP或FRET通道)處的發(fā)射值。以每數(shù)據(jù)點(diǎn)30秒的 間隔跟蹤反應(yīng)1個(gè)半小時(shí)。實(shí)時(shí)監(jiān)控YFP熒光的減少和CFP熒光的增加。B)切割的速率 取決于神經(jīng)毒素的濃度。就它們切割相同量的生物傳感器蛋白的能力檢測(cè)不同濃度的肉毒 桿菌神經(jīng)毒素A和E。通過(guò)相同數(shù)據(jù)點(diǎn)上YFP發(fā)射信號(hào)與CFP發(fā)射信號(hào)之間的比率來(lái)測(cè)量 FRET信號(hào)變化(FRET比率)。C)在相同時(shí)間上掃描單獨(dú)的CFP-SNAP-25-YFP蛋白和CFP/ YFP蛋白混合物(1 1)作為內(nèi)部對(duì)照。圖5顯示使用平板讀取器進(jìn)行的生物傳感器測(cè)定的靈敏性。A)將300nM CFP-SNAP-25-YFP與不同濃度BoNT/A或E在96孔板中混合，總體積為100 μ 1/孔。將板 在37°C下溫育4小時(shí)，然后用平板讀取器進(jìn)行掃描(上圖)。將FRET比率對(duì)毒素濃度的對(duì) 數(shù)值作圖。將各曲線(xiàn)的EC5tl值列于下圖上的表中。各數(shù)據(jù)點(diǎn)代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。 B)將300nMCFP-SybII-YFP與不同濃度的BoNT/B或F混合。收集數(shù)據(jù)，并且如圖A中所述 作圖。圖6描述了活細(xì)胞中肉毒桿菌神經(jīng)毒素的活性的監(jiān)控。A)將CFP-SNAP-25-YFP 在野生型PC12細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)記錄FRET比率的變化監(jiān)控BoNT/A (50nM)的進(jìn)入和催化活 性，所述FRET比率的變化由細(xì)胞內(nèi)CFP-SNAP-25-YFP的切割引起。從總共53個(gè)毒素處理 的細(xì)胞和53個(gè)對(duì)照細(xì)胞計(jì)算FRET比率的平均值。使用BoNT/A處理72小時(shí)減少整個(gè)細(xì)胞群體的FRET比率達(dá)到顯著的程度(P < 1. 47E-5)。B)用CFP-SybII-YFP轉(zhuǎn)染表達(dá)syt II 的PC12細(xì)胞，并且用BoNT/B(30nM)處理其。如圖(A)中一樣通過(guò)記錄FRET比率的變化來(lái) 監(jiān)控BoNT/B的進(jìn)入和催化活性；分析73個(gè)毒素處理的細(xì)胞和73個(gè)對(duì)照細(xì)胞。使用BoNT/ B處理72小時(shí)減少整個(gè)細(xì)胞群體的FRET比率達(dá)到顯著的程度(P < 2E-10)。圖7顯示根據(jù)本發(fā)明監(jiān)控活細(xì)胞中BoNT/A的活性。(a).測(cè)量活細(xì)胞中毒素傳感器 的FRET信號(hào)。將CFP-SNAP-25 (141-206)-YFP用于轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。該傳感器在細(xì)胞中顯示 是可溶的。對(duì)于各細(xì)胞，使用完全相同的設(shè)置，利用不同的濾光片(filter)組(CFP、FRET和 YFP)相繼拍攝3個(gè)圖象。對(duì)圖象進(jìn)行彩色編碼以反映以左邊上的查找表中指定的任意單位 表示的熒光強(qiáng)度。如方法中所詳述，通過(guò)從使用FRET濾光片組收集的信號(hào)減去來(lái)自CFP和 YFP 的交叉串?dāng)_(cross-talk)計(jì)算矯正的 FRET 值。(b).將用 CFP-SNAP-25 (141-206)-YFP 轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞用于檢測(cè)BoNT/A的活性。向培養(yǎng)基中加入50nM BoNT/A的全毒素，在96 小時(shí)后分析80個(gè)細(xì)胞。將矯正的FRET信號(hào)根據(jù)CFP熒光信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用指定的 幀長(zhǎng)(bins)以直方圖的形式進(jìn)行作圖。用相同的傳感器轉(zhuǎn)染對(duì)照，但不用毒素處理其，平 行地分析它們。與BoNT/A—起的溫育使FRET比率(矯正的FRET/CFP)在細(xì)胞群體中產(chǎn) 生偏移，表明傳感器蛋白在細(xì)胞中被BoNT/A切割。然而，偏移較小，表明切割在細(xì)胞中無(wú) 效。(c).左圖通過(guò)將CFP與YFP經(jīng)全長(zhǎng)SNAP-25 (氨基酸1-206)連接構(gòu)建有效的毒素傳 感器，然后檢測(cè)其，以檢測(cè)細(xì)胞中BoNT/A的活性。該CFP-SNAP-25 (FL)-YFP融合蛋白主要 在其4個(gè)半胱氨酸上通過(guò)棕櫚?；ㄎ恢良?xì)胞的質(zhì)膜上(左圖，中圖的上圖框)。中圖用 CFP-SNAP-25 (FL) -YFP傳感器轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，將所述細(xì)胞用于檢測(cè)BoNT/A的活性。向培 養(yǎng)基中加入50nM BoNT/A全毒素，在48和96小時(shí)后，如圖(a)中所述分析200個(gè)細(xì)胞的 FRET信號(hào)。用毒素傳感器轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞，但不用毒素處理其，然后平行地分析它們。代表 性細(xì)胞的圖象示于中圖。該傳感器產(chǎn)生顯著的FRET(中圖的上方“矯正的FRET”框)。在 用BoNT/A(96小時(shí)，中圖的下“矯正的FRET”圖框)處理細(xì)胞后，F(xiàn)RET信號(hào)消除。注意在 毒素切割后，切割產(chǎn)物中的一種，用YFP標(biāo)記的SNAP-25的C端，被降解。從而，YFP的熒光 信號(hào)在毒素處理的細(xì)胞中顯著減少(下方“YFP”圖框)。右圖如圖(b)中所述，利用指定 的幀長(zhǎng)以直方圖的形式將FRET比率進(jìn)行作圖。(d).用CFP-SNAP-25 (Cys-Ala)-YFP (具有 Cys85、88、90、92Ala突變的全長(zhǎng)SNAP-25，左圖)轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。該蛋白已擴(kuò)散地分布在 整個(gè)細(xì)胞溶質(zhì)中，并且缺乏對(duì)于CFP-SNAP-25 (FL)-YFP (右圖，“矯正的FRET”框)觀察到的 強(qiáng) FRET 信號(hào)。(e).用 CFP-SNAP-25 (FL) -YFP 和 CFP-SNAP-25 (Cys-Ala) -YFP 轉(zhuǎn)染 PC 12 細(xì) 胞。然后用(+，完整細(xì)胞)或不用(_，完整細(xì)胞)BoNT/A (50nM，72小時(shí))處理細(xì)胞，收獲細(xì) 胞。還將一半來(lái)自未暴露于BoNT/A的樣品的細(xì)胞提取物與(+，體外)或不與(_，體外)還 原的BoNT/A —起體外溫育(200nM，30分鐘，37°C )，用作對(duì)照以顯示切割產(chǎn)物(用箭頭標(biāo)示 兩個(gè)切割產(chǎn)物)。將相同量的各樣品(30yg細(xì)胞裂解物)裝載在SDS-page凝膠上，然后使 用抗GFP抗體使之經(jīng)歷免疫印跡分析。雖然CFP-SNAP-25 (FL) -YFP在完整細(xì)胞中遭到明顯 的切割，但在細(xì)胞中不存在可檢測(cè)的CFP-SNAP-25 (Cys-Ala) -YFP的切割，這表明膜錨著對(duì) 于活細(xì)胞中BoNT/A產(chǎn)生的有效切割是非常重要的。注意在毒素處理的細(xì)胞中只檢測(cè)到一 種切割產(chǎn)物(CFP-SNAP-25 (1-197))，表明其他切割產(chǎn)物(SNAP-25 (198-206)-YFP)在細(xì)胞 中大部分被降解。圖8顯示將CFP-SNAP-25 (141-206) -YFP傳感器錨著至質(zhì)膜產(chǎn)生了在細(xì)胞中被BoNT/A有效切割的傳感器。(a).經(jīng)構(gòu)建將CFP-SNAP-25 (141-206) -YFP靶向質(zhì)膜 的構(gòu)造物的示意圖。將包含棕櫚?；稽c(diǎn)(殘基83-120)的SNAP-25的片段融合至 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP傳感器的N末端，并且該片段將融合蛋白靶向質(zhì)膜。(b).用SN AP-25 (83-120) -CFP-SNAP-25 (141-206) -YFP 轉(zhuǎn)染 PC12 細(xì)胞。向培養(yǎng)基中加入 50nM BoNT/ A全毒素，在96小時(shí)后如圖7a中所述分析80個(gè)細(xì)胞的FRET信號(hào)。平行地分析用毒素傳感 器轉(zhuǎn)染但不用毒素處理的對(duì)照細(xì)胞。代表性細(xì)胞的圖象示于左圖中。該傳感器產(chǎn)生顯著的 FRET (左圖的上方“矯正的FRET”圖框)。在用BoNT/A處理細(xì)胞后(96小時(shí)，左圖的下方“矯 正的FRET”圖框)，F(xiàn)RET信號(hào)減小。右圖如圖7b中所述，利用指定的幀長(zhǎng)以直方圖的形式 將細(xì)胞的FRET比率作圖。(c).用不同的CFP/YFP構(gòu)造物轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，如圖7a中所述測(cè)定 相應(yīng)的FRET比率。CFP和YFP在細(xì)胞中的共表達(dá)在我們的測(cè)定條件下不導(dǎo)致顯著的FRET。 CFP-SNAP-25 (FL) -YFP 展示顯著的 FRET 水平，然而可溶性 CFP-SNAP-25 (Cys-Ala) -YFP 未展 示顯著的FRET水平。圖9顯示BoNT/B對(duì)Syb的有效切割需要Syb定位至小泡。(a).將 CFP-Syb (33-94)-YFP用于轉(zhuǎn)染穩(wěn)定地表達(dá)突觸結(jié)合蛋白II的PC12細(xì)胞系(Dong等人 Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxinB into cells. J. Cell Biol. 162，1293-1303 (2003))。該傳感器在細(xì)胞中表現(xiàn)為可溶的，并且產(chǎn)生強(qiáng)FRET 信號(hào)(上圖)。將用CFP-Syb(33-94)-YFP轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞用于檢測(cè)BoNT/B的活性。向 培養(yǎng)基中加入50nM BoNT/B全毒素，在96小時(shí)后如圖7b中所述分析80個(gè)細(xì)胞。用相同的 傳感器轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞，但不用毒素處理對(duì)照細(xì)胞，平行地分析它們。與BoNT/B —起溫育使 FRET比率在細(xì)胞群體當(dāng)中發(fā)生偏移，這表明傳感器蛋白在細(xì)胞中被BoNT/B切割。然而，偏 移很小，表明切割在細(xì)胞中無(wú)效。(b). YFP-Syb(FL)-CFP傳感器的示意圖。全長(zhǎng)Syb包含 116個(gè)氨基酸，并且通過(guò)單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域定位至小泡。BoNT/B對(duì)Syb的切割從小泡釋放用 YFP標(biāo)記的Syb的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。(c).用YFP-Syb (FL)-CFP轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)突觸結(jié)合蛋白II 的PC12細(xì)胞，然后用BoNT/B(50nM，48小時(shí)，下方的圖框)或不用毒素(對(duì)照，上方圖框)處 理所述細(xì)胞。對(duì)于每一個(gè)細(xì)胞收集CFP和YFP熒光圖象，顯示代表性細(xì)胞。該傳感器被定位 至小泡，并且不存在于活細(xì)胞的細(xì)胞核中，如由CFP和YFP熒光信號(hào)(上方圖框)所證明的。 BoNT/B處理導(dǎo)致YFP信號(hào)的再分布，所述YFP信號(hào)在細(xì)胞溶質(zhì)中變成可溶性的并且進(jìn)入細(xì) 胞核。(d).將Syb的截?cái)嘈问?殘基33-116)用于連接CFP和YFP。該構(gòu)造物包含與可溶 性傳感器CFP-Syb (33-96)-YFP中的Syb片段相同的細(xì)胞溶質(zhì)區(qū)域(殘基33-94，圖(b))， 并且其還可包含Syb的跨膜結(jié)構(gòu)域。用CFP-Syb (33-116) -YFP和CFP-Syb (33-94) -YFP轉(zhuǎn) 染表達(dá)突觸結(jié)合蛋白II的PC 12細(xì)胞。然后用(+，完整細(xì)胞)或不用(_，完整細(xì)胞)BoNT/ B(50nM，48小時(shí))處理細(xì)胞，收獲細(xì)胞。還將一半來(lái)自未暴露于BoNT/B的樣品的細(xì)胞提取 物與(+，體外)或不與(_，體外)還原的BoNT/B (200nM，30分鐘，37°C )在體外一起溫育。 用星號(hào)標(biāo)示2個(gè)切割產(chǎn)物。將相同量的各樣品(30 μ g/細(xì)胞裂解物)裝載至一個(gè)SDS-page 凝膠上并且使用抗GFP抗體使之經(jīng)歷免疫印跡分析。雖然CFP-Syb (33-116) -YFP在完整細(xì) 胞中經(jīng)歷顯著的切割，但不存在可檢測(cè)的CFP-Syb (33-94) -YFP的切割，這表明至小泡的定 位對(duì)于BoNT/B在活細(xì)胞中產(chǎn)生有效切割是非常重要的。圖10是描述具有包括位于供體標(biāo)記和受體標(biāo)記之間的切割位點(diǎn)序列的連接體的 現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)造物的示意圖。
圖Ila是描述本發(fā)明的構(gòu)造物的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，所述構(gòu)造物具有包括切 割位點(diǎn)序列和間隔子(所述間隔子位于切割位點(diǎn)序列與受體標(biāo)記之間)的連接體。圖lib是描述本發(fā)明的構(gòu)造物的備選實(shí)施方案的示意圖，所述構(gòu)造物具有包括切 割位點(diǎn)序列和間隔子(所述間隔子位于供體標(biāo)記和切割位點(diǎn)序列之間)。圖Ilc是描述本發(fā)明的構(gòu)造物的另一個(gè)備選實(shí)施方案的示意圖，所述構(gòu)造物具有 包括切割位點(diǎn)序列和間隔子(所述間隔子位于供體與切割位點(diǎn)序列和切割位點(diǎn)序列與受 體標(biāo)記之間)的連接體。圖12是舉例說(shuō)明使用本發(fā)明的構(gòu)造物提高供體標(biāo)記與受體標(biāo)記之間的能量轉(zhuǎn)移 的靈敏性的方法的步驟的方框圖(block diagram)。圖13是舉例說(shuō)明使用本發(fā)明的構(gòu)造物檢測(cè)肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法的步驟的方 框圖。詳細(xì)描述本發(fā)明提供了基于通過(guò)肽連接體(所述肽連接體是BoNT的底物，并且可被毒素切 割)連接的熒光基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的新型組合物和方法來(lái)檢測(cè)肉毒桿 菌神經(jīng)毒素和監(jiān)控(優(yōu)選實(shí)時(shí))它們的底物切割活性。本發(fā)明的方法和組合物允許在數(shù)小 時(shí)內(nèi)檢測(cè)皮摩爾水平的BoNT，并且可實(shí)時(shí)跟蹤毒素的酶促動(dòng)力學(xué)。通過(guò)使用培養(yǎng)細(xì)胞，還 可將所述方法和組合物用于大規(guī)模篩選細(xì)胞毒素的抑制劑，包括毒素的細(xì)胞進(jìn)入和通過(guò)小 泡膜的轉(zhuǎn)位的抑制劑。本發(fā)明還適合用于在活細(xì)胞和神經(jīng)元中監(jiān)控肉毒桿菌神經(jīng)毒素的活 性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了構(gòu)造物和使用構(gòu)造物的方法，所述構(gòu)造物包 含全長(zhǎng)SNAP-25和Syb蛋白作為連接體，作為可檢測(cè)活細(xì)胞中的毒素活性的熒光生物傳感 器。SNAP-25的切割消除了 CFP/YFP FRET信號(hào)，Syb的切割導(dǎo)致YFP在細(xì)胞中的空間重新 分布。本發(fā)明提供了進(jìn)行基于細(xì)胞的毒素抑制劑的篩選和用于表征細(xì)胞中毒素的活性的方 法。本發(fā)明還公開(kāi)了 SNAP-25和Syb的亞細(xì)胞定位分別影響細(xì)胞中BoNT/A和B產(chǎn)生的有 效切割。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是允許估量一個(gè)分子與另一個(gè)分子(例如，蛋白質(zhì)或 核酸)之間或相同分子上兩個(gè)位點(diǎn)之間的距離的工具。FRET在本領(lǐng)域內(nèi)現(xiàn)是眾所周知 的(關(guān)于綜述，參見(jiàn) Matyus, (1992) J. Photochem. Photobiol. B =Biol.，12 323)。FRET 是其中能量從激發(fā)供體分子轉(zhuǎn)移至受體分子的非輻射過(guò)程。非輻射能量轉(zhuǎn)移是一個(gè)熒 光基團(tuán)的激發(fā)態(tài)的能量在無(wú)實(shí)際光子發(fā)射的情況下被轉(zhuǎn)移至第二熒光基團(tuán)的量子力學(xué) 過(guò)程。量子物理學(xué)原理綜述于 Jovin 和 Jovin，1989，Cell Structure andFunction by Microspectrofluorometry, eds. Ε· Kohen 禾口 J. G. Hirschberg, Academic Press 中。簡(jiǎn)而言 之，熒光基團(tuán)吸收特征波長(zhǎng)上的光能。該波長(zhǎng)也稱(chēng)為激發(fā)波長(zhǎng)。熒光染料吸收的能量隨后 通過(guò)不同途徑釋放，一個(gè)途徑是光子的發(fā)射(從而產(chǎn)生熒光)。被發(fā)射的光的波長(zhǎng)稱(chēng)為發(fā)射 波長(zhǎng)，其是特定熒光基團(tuán)的固有特征。在FRET中，該能量在第二熒光基團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)上釋 放。第一熒光基團(tuán)通常稱(chēng)為供體(D)，并且具有比第二熒光基團(tuán)(稱(chēng)為受體(A))的激發(fā)態(tài) 能量更高的激發(fā)態(tài)。所述過(guò)程的本質(zhì)特征是供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜重疊，并且供體與受體 足夠接近。
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此外，D與A之間的距離必須足夠小以允許熒光基團(tuán)之間的能量的非輻射轉(zhuǎn)移。因 為能量轉(zhuǎn)移的比率與供體與受體之的距離的6次方成反比，因此能量轉(zhuǎn)移效率對(duì)距離變化 極其敏感。據(jù)認(rèn)為能量轉(zhuǎn)移在1至IOnm的距離范圍內(nèi)以可檢測(cè)的效率發(fā)生，但要獲得最佳 結(jié)果通常為4-6nm。在其中非輻射能量轉(zhuǎn)移有效的距離范圍也取決于許多其他因素，包括供 體的熒光量子效率、受體的消光系數(shù)、它們各自的光譜的重疊的程度、介質(zhì)的折射率以及兩 個(gè)熒光基團(tuán)的躍遷矩(transition moment)的相對(duì)定向。本發(fā)明提供了包含通過(guò)連接體肽(“底物肽”)連接的熒光基團(tuán)FRET供體和受體 的構(gòu)造物(“FRET構(gòu)造物”)，所述連接體肽可被相應(yīng)的BoNT切割。在BoNT存在的情況下， 切割連接體肽，從而導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移的減少和增加的由供體熒光基團(tuán)產(chǎn)生的光的發(fā)射。這樣， 可實(shí)時(shí)監(jiān)控和定量毒素的蛋白水解活性。如本文中關(guān)于供體和相應(yīng)的受體熒光部分所使用的，“相應(yīng)”是指具有與供體熒光 部分的激發(fā)光譜重疊的發(fā)射光譜的受體熒光部分。受體熒光部分的發(fā)射光譜的波長(zhǎng)最大值 應(yīng)當(dāng)比供體熒光部分的激發(fā)光譜的波長(zhǎng)最大值大至少lOOnm。因此，可產(chǎn)生有效的非放射能
量轉(zhuǎn)移。如本文中關(guān)于底物肽和BoNT所使用的，“相應(yīng)的”是指能夠作用于連接體肽并且在 特定切割位點(diǎn)進(jìn)行切割的BoNT毒素。通常就(a)高效熒光Forster能量轉(zhuǎn)移；(b)極大的終斯托克斯位移(> IOOnm)； (c)發(fā)射盡可能進(jìn)入可見(jiàn)光譜的紅光部分(> 600nm)的偏移；和(d)發(fā)射至比由供體激發(fā) 波長(zhǎng)上的激發(fā)產(chǎn)生的拉曼水體熒光發(fā)射(Raman water fluorescent emission)更長(zhǎng)的波 長(zhǎng)的偏移選擇熒光供體和相應(yīng)的受體部分。例如，可選擇其激發(fā)最大值接近激光線(xiàn)(例如， 氦-鎘442nm或氬488nm)、具有高消光系數(shù)、高量子產(chǎn)量以及其熒光發(fā)射與相應(yīng)的受體熒光 部分的激發(fā)光譜良好重疊的供體熒光部分?？蛇x擇具有高消光系數(shù)、高量子產(chǎn)量、其激發(fā)與 供體熒光部分的發(fā)射良好重疊以及發(fā)射在可見(jiàn)光譜的紅光部分(> 600nm)中的相應(yīng)的受 體熒光部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多熒光基團(tuán)分子適合用于FRET。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 熒光蛋白用作熒光基團(tuán)?？膳cFRET技術(shù)中不同受體熒光部分一起使用的代表性供體熒光 部分包括熒光素、螢光黃、B-藻紅蛋白、9-吖啶異硫氰酸(acridine isothiocyanate)、螢 光黃VS、4-乙酰胺基-4'-異硫代-氰芪(cyanatOStilbene)-2，2' -二磺酸、7-二乙氨 基-3-(4'-異硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亞胺基Ι-pyrenebutyrate和4-乙 酰氨基-4'-異硫氰酸芪_2，2' -二磺酸衍生物。代表性受體熒光部分，取決于所使用 的供體熒光部分，包括LC-Red 640、LC-Red 705、Cy5、Cy5. 5、麗絲胺堿性蕊香紅B磺酰氯 (Lissamine rhodamine B sulfonyl chloride)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate)、異石智氛酸羅丹明 χ (rhodamine χ isothiocyanate)、赤 蘚紅異硫氰酸酯(erythrosineisothiocyanate)、熒光素、二亞乙基三胺五乙酸酯或 稀土離子(Lanthanideions)(例如，銪或鋱)的其他螯合物。可以例如從Molecular ProbesQunction City, Oreg.)或 Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.)獲得供體禾口受體 熒光部分。表1列出了適合用于本發(fā)明的化學(xué)熒光基團(tuán)的其他實(shí)例以及它們的激發(fā)和發(fā)射 波長(zhǎng)。
GFP是27-30KD的蛋白質(zhì)，可將其與另一種蛋白質(zhì)例如靶蛋白融合，并且可對(duì)融合 蛋白進(jìn)行基因工程以在宿主細(xì)胞例如大腸桿菌(E. coli)的宿主細(xì)胞中表達(dá)。GFP和其不同 的突變體能夠在活細(xì)胞和組織中產(chǎn)生熒光。GFP的突變形式在它們的熒光區(qū)域具有少許氨 基酸差異，這導(dǎo)致偏移的光譜。預(yù)期將來(lái)產(chǎn)生更多的具有不同光譜的GFP的突變。在此類(lèi) GFP變體當(dāng)中，BFP-YFP, BFP-CFP, CFP-YFP, GFP-DsRed通常用作檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互 作用的FRET供體-受體對(duì)。此類(lèi)對(duì)也適合用于檢測(cè)連接所述對(duì)的連接體區(qū)域的蛋白酶切 割。熒光蛋白的使用是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兪沟媚軌蚴褂么蠹s60個(gè)氨基酸殘基的連接 體片段。更長(zhǎng)的片段通常對(duì)毒素的識(shí)別和切割更敏感，從而導(dǎo)致對(duì)檢測(cè)毒素的更高的靈 敏性。如下面實(shí)例中所顯示的，在與CFP-SNAP-YFP —起溫育4小時(shí)后，當(dāng)用廣泛使用的 微量滴定板焚光分光光度計(jì)(microplate spectrofluorometer) (Spectra Max Gemini, MolecularDevice)測(cè)量時(shí)，BoNT/A 和 E 的 EC50 低至 15-20pM(l_2ng/ml)。BoNT/B 和 F 的
CN 101932936 Ai兌明書(shū)10/25 頁(yè)某些天然發(fā)生的氨基酸例如色氨酸是發(fā)熒光的。還可以例如通過(guò)將熒光基團(tuán)連接 至氨基酸(例如將AEDANS連接至Cys)衍生氨基酸來(lái)產(chǎn)生用于FRET的熒光基團(tuán)對(duì)。通常 將AEDANS-Cys對(duì)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和相互作用。也已將一些其他形式熒光基團(tuán)用 于修飾氨基酸和在蛋白質(zhì)片段中產(chǎn)生FRET (例如，2. 4- 二硝基苯基-賴(lài)氨酸與S- (N- [4-甲 基-7- 二甲基氨基-香豆素-3-基]-碳酰胺甲基(carboxamidomethyl))-半胱氨酸_)。在另一個(gè)特別適合用于活細(xì)胞的實(shí)施方案中，將綠色熒光蛋白(GFP)和其不同 的突變體用作熒光基團(tuán)。在它們本身當(dāng)中在激發(fā)和發(fā)射最大波長(zhǎng)上可變化的熒光蛋白的 實(shí)例列于WO 97/28261 (Tsien等人，1997)的表1中，所述申請(qǐng)通過(guò)引用合并入本文。此 類(lèi)實(shí)例(各自后跟以納米表示[激發(fā)最大/發(fā)射最大]波長(zhǎng))包括野生型綠色熒光蛋 白[395 (475)/508]和綠色熒光蛋白變體的克隆的突變體P4[383/447]，P4-3[381/445]、 W7[433(453)/475 (501)]、W2[432(453)/408]、S65T[489/511]、P4-1[504(396)/480]、 S65A[471/504]、S65C[479/507]、S65L[484/510]、Y66F[360/442]、Y66W[458/480]、 I0c[513/527]、WIB [432(453)/476 (503)]、Emerald[487/508]和 Sapphire[395/511]。 還可使用紅色熒光蛋白例如具有558nm的激發(fā)最大波長(zhǎng)和583的發(fā)射最大波長(zhǎng)的 DsRed(Clontech)0該列表未窮舉本領(lǐng)域內(nèi)已知的熒光蛋白；另外的實(shí)例見(jiàn)于Genbank和 SwissPro公共數(shù)據(jù)庫(kù)。表 1EC50是大約200-250pM，可通過(guò)增加溫育時(shí)間來(lái)增強(qiáng)靈敏性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)合適長(zhǎng)度的連接體將兩個(gè)熒光基團(tuán)連接在一 起，這樣可使FRET發(fā)生。連接體是BoNT底物蛋白的片段。當(dāng)暴露于能夠切割連接體片段 的BoNT時(shí)，兩個(gè)熒光基團(tuán)被分開(kāi)，從而消除FRET。本發(fā)明因此提供了用于通過(guò)檢測(cè)FRET的 變化來(lái)檢測(cè)BoNT的方法。來(lái)自許多物種的SNARE蛋白適合用作BoNT毒素的底物蛋白，因 為已知此類(lèi)蛋白質(zhì)在氨基酸水平上是保守的。許多此類(lèi)BoNT底物蛋白是已知的并且可獲 得用于或經(jīng)修飾用作本發(fā)明的合適的連接體肽。一些底物蛋白和它們的GenBank登錄號(hào)列 于表2中。表2 已知各BoNT毒素切割毒素切割位點(diǎn)內(nèi)的兩個(gè)特定氨基酸之間的特定肽鍵。下 面的表3列出了針對(duì)各BoNT毒素的所述氨基酸對(duì)。然而，這些氨基酸序列對(duì)不足以被 毒素識(shí)別和切割。例如，BoNT/A在大鼠SNAP-25序列(GenBank登錄號(hào)NP—112253)的 Q(197)-R(198)而非Q(15)-R(16)上切割SNAP-25。通常，不存在作為識(shí)別位點(diǎn)的保守氨基 酸序列；相反，毒素?fù)?jù)信識(shí)別它們的靶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)而非一級(jí)結(jié)構(gòu)。然而，無(wú)論其物種來(lái) 源，底物蛋白的非常短的片段足以被毒素識(shí)別和切割，只要它們?cè)谏衔乃械亩舅厍懈钗?點(diǎn)上具有下面的表3中的2個(gè)氨基酸殘基。連接體蛋白或肽可以長(zhǎng)至BoNT底物蛋白的全長(zhǎng)。優(yōu)選，連接體是更短的底物蛋白 的片段。全長(zhǎng)底物連接體對(duì)于有效FRET可能太長(zhǎng)，更短的片段比全長(zhǎng)蛋白更有效并且更容 易產(chǎn)生。在另一方面，如上文所指出的，連接體肽應(yīng)當(dāng)長(zhǎng)于某個(gè)最小長(zhǎng)度，因?yàn)槎逃谶@樣的 最小長(zhǎng)度，各自BoNT對(duì)連接體肽的切割會(huì)變得無(wú)效。表3
以syb II和BoNT/B為例，下面的表4舉例說(shuō)明了連接體-肽長(zhǎng)度與毒素的切割 率之間的關(guān)系。全長(zhǎng)大鼠syb II蛋白(GenBank號(hào)NP—036795)具有116個(gè)氨基酸，其中 氨基端上的氨基酸1-94是細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其余的是跨膜結(jié)構(gòu)域。如表1清楚地顯示，在某 個(gè)限度內(nèi)，毒素以更慢的速率(來(lái)自Foran等人，Biochemistry 33 15365，1994的數(shù)據(jù)) 切割更短的片段。如可從表4看到的，為了獲得最佳切割，破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(TeNT)需要比BoNT/ B (55-94)更長(zhǎng)的片段(33-94)。已在幾個(gè)研究(包括幾種基于肽的毒素測(cè)定法)(Schmidt 等人，2003，同上，和 Schmidt 等人，2001, Analytical Biochemistry, 296 :130_137)中使用 了由60-94組成的片段。對(duì)于BoNT/A，需要SNAP-25的141-206片段來(lái)保持大部分毒素敏感性 (Washbourne等人，1997，F(xiàn)EBS Letters, 418 1)。也存在其他報(bào)導(dǎo)更短的肽，SNAP25的氨 基酸187-203，足以被BoNT/A切割(,2001)。對(duì)于BoNT/A最小的位點(diǎn)是=Glu-Ala-Asn-Gl n-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID N0:1)。BoNT/A 切割 Gln-Arg。表4
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通過(guò)在PC12細(xì)胞內(nèi)使用全長(zhǎng)SNAP-25作為CFP與YFP之間的連接體序列，初步結(jié) 果顯示獲得的FRET信號(hào)比使用更短的片段獲得的FRET信號(hào)強(qiáng)，足以使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室顯微 鏡來(lái)檢測(cè)。據(jù)信，可能地由于全長(zhǎng)SNAP-25被靶向質(zhì)膜(BoNT/A輕鏈也可被靶向和錨著在 其上)上的事實(shí)，在PC12細(xì)胞中，BoNT/A對(duì)全長(zhǎng)SNAP-25的切割率比短片段更快，并且在 細(xì)胞之間更一致。對(duì)于BoNT/B，發(fā)現(xiàn)短至殘基60至94的片段與殘基33至94之間的片段一樣有效。 優(yōu)選，將33至94之間的片段用于BoNT/B和TeNT。兩種毒素在Gln與Phe之間進(jìn)行切割， 切割的最小序列據(jù)信為Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser(SEQ ID NO :2)。有跡象顯示 BoNT/B輕鏈可被靶向并且錨著在突觸小泡上，可期望通過(guò)信號(hào)序列將本發(fā)明的FRET構(gòu)造 物靶向突觸小泡以在細(xì)胞內(nèi)獲得增加的切割效率。BoNT/C切割SNAP25和突觸融合蛋白，并且據(jù)信如果底物存在于溶液中，則以非常 低的速率進(jìn)行切割。存在于細(xì)胞膜上的天然SNAP25和突觸融合蛋白被BoNT/C最有效地切 割。對(duì)于 SNAP25 最小的切割序列是Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO 3), 其中切割在Arg-Ala之間發(fā)生；對(duì)于突觸融合蛋白，最小切割序列是Asp-Thr-Lys-Lys-Ala -Val-Lys-Phe (SEQ ID NO :4)，并且切割在 Lys-Ala 上發(fā)生。BoNT/E 需要最小序列Gln_IIe-Asp-Arg-IIe-Met-Glu-Lys (SEQ ID N0:5)，并且 在Arg-Ile之間進(jìn)行切割。BoNT/F W |ij Gln—Lys。 Schmidt 等人(Analytical Biochemistry, 296 130-137(2001))報(bào)導(dǎo)syb II的37-75片段保持大部分毒素敏感度，并且最小序列是Glu -Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu(SEQ ID NO :6)。根據(jù)上文關(guān)于最小切割位點(diǎn)和FRET信號(hào)強(qiáng)度與連接體長(zhǎng)度之間以及切割效率與 連接體長(zhǎng)度之間的關(guān)系的論述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地選擇合適的連接體長(zhǎng)度來(lái)獲得 FRET信號(hào)強(qiáng)度與切割效率之間的最佳平衡。優(yōu)選，取決于特定的底物和毒素組合，連接體長(zhǎng)度是大約8個(gè)氨基酸至大約100個(gè) 氨基酸之間，優(yōu)選10至90個(gè)氨基酸之間，更優(yōu)選20至80個(gè)氨基酸之間，30至70個(gè)氨基酸 之間，40至60個(gè)氨基酸之間的任何長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，可首先純化連接體蛋白或其片段，或首先合成肽，然后將熒光 基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)加至某個(gè)氨基酸。將熒光標(biāo)記附著至連接體多肽或備選地，將熒光蛋白 按讀框與連接體多肽融合，如下面所描述的。上文的論述清楚地表明，雖然短底物片段對(duì) 于毒素檢測(cè)特異性是期望的，但更長(zhǎng)的片段可能對(duì)于提高的信號(hào)強(qiáng)度或切割效率是期望的。很容易地認(rèn)識(shí)到，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)包含1個(gè)以上的一種BoNT的識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，單獨(dú)的位點(diǎn)結(jié)果 將不足以鑒定哪種特定的毒素存在于樣品中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如果使用更長(zhǎng) 的底物片段，特別地全長(zhǎng)底物蛋白，則可以例如通過(guò)定向誘變或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其 他分子工程方法對(duì)底物進(jìn)行工程改造，這樣使其只包含一個(gè)毒素/蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。參見(jiàn) 例如 Zhang 等人，2002，Neuron 34 599-611" Ca2+-dependent synaptotagminbinding to SNAP-25 is essential for Ca2+triggered exocytosis"(顯示在 BoNT/E 切割位點(diǎn)具有 突變(Asp 179至Lys)的SNAP-25抗BoNT/E切割，但當(dāng)就SNARE復(fù)合物形成進(jìn)行檢測(cè)時(shí)表 現(xiàn)正常)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用特異性工程和長(zhǎng)度最優(yōu)化的組合來(lái)獲得最 佳信號(hào)強(qiáng)度、切割效率和毒素/血清型特異性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)是通過(guò)合適的底物肽連接的合適的熒光蛋白。然后 可通過(guò)任一體外(例如，使用無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，或取而代之使用利用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的 方法轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞)表達(dá)重組核酸分子來(lái)產(chǎn)生FRET構(gòu)造物，所述核酸分子包含編 碼這樣的多肽和熒光蛋白標(biāo)記的序列的符合讀框的融合序列。用于產(chǎn)生FRET構(gòu)造物的合 適的細(xì)胞可以是細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞。還可在體內(nèi)例如在轉(zhuǎn)基因植物中或在轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物包括但不限于昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生FRET構(gòu)造物。如果需要，可通過(guò)本領(lǐng) 域內(nèi)熟知的分子方法構(gòu)建和表達(dá)用于本發(fā)明的重組核酸分子，所述重組核酸分子可額外地 包含序列，包括但不限于編碼使得能夠容易純化的標(biāo)記(例如，組氨酸標(biāo)記)、連接體、分泌 信號(hào)、核定位信號(hào)或能夠?qū)?gòu)造物靶向特定細(xì)胞位置的其他基本序列信號(hào)的序列。低至300nM的蛋白質(zhì)足以產(chǎn)生可使用微量滴定板熒光分光光度計(jì)檢測(cè)的充足的 熒光信號(hào)?？蓪?shí)時(shí)跟蹤熒光信號(hào)的變化以反映毒素的蛋白酶酶促活性。實(shí)時(shí)監(jiān)控將信號(hào)變 化測(cè)量為反應(yīng)進(jìn)程，并且允許快速的數(shù)據(jù)收集和產(chǎn)生關(guān)于在不同條件下的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的信 息。可以例如就某些熒光分光光度計(jì)，使用方法例如HPLC測(cè)定使FRET速率的變化與切割 的程度進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以使來(lái)自FRET比率的動(dòng)力學(xué)常數(shù)的單位與底物濃度進(jìn)行關(guān)聯(lián)。圖10是具有連接體130的現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)造物100的示意圖，所述連接體130包含位 于供體標(biāo)記110與受體標(biāo)記120之間的切割位點(diǎn)序列140和切割位點(diǎn)142。該類(lèi)型的現(xiàn)有 技術(shù)構(gòu)造物特別適合用于檢測(cè)BoNT。然而，圖Ila的示例性構(gòu)造物100a令人驚訝地由于在 連接體130a內(nèi)包含間隔子130a而具有增強(qiáng)的對(duì)于檢測(cè)BoNT的靈敏性。圖Ila是描述本發(fā)明的構(gòu)造物100a的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，所述構(gòu)造 物具有包括切割位點(diǎn)序列140、切割位點(diǎn)142和間隔子150a的連接體130a。間 隔子150a位于切割位點(diǎn)序列140與受體標(biāo)記120之間。優(yōu)選，構(gòu)造物100a選自 CFP- (SGLRSRA) -SNAP-25- (SNS) -YFP 和 CFP- (SGLRSRA)-小突觸泡蛋白-(SNS) -YFP。供體標(biāo)記110和受體標(biāo)記120被定位成提供電子耦合，從而使供體標(biāo)記可通過(guò)偶 極-偶極耦合機(jī)制(包括但不限于F0rster共振能量轉(zhuǎn)移(fret))將能量轉(zhuǎn)移至受體標(biāo)記。連接體肽130a是選自小突觸泡蛋白(VAMP)、突觸融合蛋白和SNAP-25或其可被 肉毒桿菌神經(jīng)毒素識(shí)別和切割的片段的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的底物。此類(lèi)蛋白統(tǒng)稱(chēng)為SNARE 蛋白。連接體130a可具有任何合適長(zhǎng)度的一級(jí)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度，包括例如，大于或等于5nm、8nm、 10nm、12nm、14nm 禾口 20nmo間隔子150a可具有任何合適數(shù)目的氨基酸，但優(yōu)選至少3、5、7、10、12或15個(gè)氨 基酸。間隔子150a可包括選自(GGGGS)n和(EAAAK) η的序列，其中η是1_3。備選地，間隔子150a可包括SNARE蛋白、基序或突變蛋白。雖然間隔子150a增加供體標(biāo)記110與受體 標(biāo)記120之間的一級(jí)結(jié)構(gòu)的距離，但相對(duì)于無(wú)間隔子的相應(yīng)構(gòu)造物，間隔子150a有利地增 加供體標(biāo)記110與受體標(biāo)記120之間的電子耦合(FRET效應(yīng))。增強(qiáng)的電子耦合發(fā)生，因?yàn)?間隔子150a減少了供體標(biāo)記110與受體標(biāo)記120之間的三級(jí)結(jié)構(gòu)距離，從而允許增加電子
華禹合。切割位點(diǎn)序列140可包括(a) SNARE蛋白、基序、突變蛋白，和(b)具有至少5個(gè)氨 基酸的間隔子，其中間隔子包含選自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中η為1至3。除連接體130b具有位于供體標(biāo)記110與切割位點(diǎn)序列140之間的間隔子150b夕卜， 圖lib的構(gòu)造物IOOb與圖Ila的構(gòu)造物IOOa相似。除了連接體130b具有(a)位于供體標(biāo)記110與切割位點(diǎn)序列140之間的間隔子 150c和(b)位于切割位點(diǎn)序列140與受體標(biāo)記120之間的間隔子150d外，圖Ilc的構(gòu)造物 IOOc與圖Ila的構(gòu)造物IOOa相似。圖12舉例說(shuō)明了使用圖Ila至Ilc的構(gòu)造物提高供體標(biāo)記與受體標(biāo)記之間的能 量轉(zhuǎn)移的靈敏性的方法200的步驟。步驟210由提供根據(jù)圖Ila至Ilc的構(gòu)造物組成，所 述構(gòu)造物包含通過(guò)連接體物理連接的供體標(biāo)記和受體標(biāo)記。構(gòu)造物是基于蛋白質(zhì)的構(gòu)造 物，連接體是肽序列212。步驟220由在連接體中包括切割位點(diǎn)序列組成。任選地，切割序 列包括SNARE蛋白或其片段或突變蛋白，間隔子包含至少5個(gè)氨基酸222。步驟230由在供 體與切割位點(diǎn)序列和受體與切割位點(diǎn)序列的至少一個(gè)之間的連接體中包括間隔子組成，由 此供體與受體之間的電子耦合通過(guò)(a)減少供體與受體234之間的三級(jí)結(jié)構(gòu)距離和(b)在 供體與受體236之間提供電子躍遷(electronic hop)而得到增強(qiáng)。任選地，間隔子包括選 自(GGGGS)n 禾口 (EAAAK)η 的序列，其中 η 是 1-3232。圖13舉例說(shuō)明用于使用圖Ila至Ilc的構(gòu)造物檢測(cè)肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法300 的步驟。步驟310由提供權(quán)利要求1的構(gòu)造物組成，其中連接體是待檢測(cè)的肉毒桿菌神經(jīng) 毒素的底物蛋白或其可切割片段。步驟320由在肉毒桿菌神經(jīng)毒素在其下可切割底物蛋白 或其片段的條件下將構(gòu)造物暴露于懷疑含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的樣品組成。以及步驟330 由在將構(gòu)造物暴露于樣品之前和之后檢測(cè)和比較FRET信號(hào)組成，其中FRET的減少表明樣 品中存在肉毒桿菌神經(jīng)毒素。本發(fā)明的方法是高度靈敏的，并且作為結(jié)果，可用于直接檢測(cè)環(huán)境樣品中痕量的 ΒοΝΤ，包括肉毒桿菌細(xì)胞中的原毒素。因此，本發(fā)明還提供了用于直接使用環(huán)境樣品進(jìn)行毒 素檢測(cè)和鑒定的方法。本發(fā)明還提供了使用上述體外系統(tǒng)篩選BoNT的抑制劑的方法。由于其高度靈敏 性、快速讀出和易使用性，基于本發(fā)明的體外系統(tǒng)也適合用于篩選毒素的抑制劑。具體地， 在候選抑制物質(zhì)存在的情況下將合適的BoNT底物-FRET構(gòu)造物暴露于相應(yīng)的ΒοΝΤ，監(jiān)控 FRET信號(hào)的變化以確定候選物是否抑制BoNT的活性。本發(fā)明還提供了用于使用基于細(xì)胞的系統(tǒng)檢測(cè)BoNT的方法以檢測(cè)BoNT和進(jìn)一步 用于篩選BoNT的抑制劑。將如上所述的合適的BoNT底物-FRET構(gòu)造物在細(xì)胞中表達(dá)，然 后將細(xì)胞暴露于懷疑含有BoNT的樣品，然后監(jiān)控FRET信號(hào)的變化，作為BoNT的存在/不 存在或濃度的指示。特別地，F(xiàn)RET信號(hào)的減少標(biāo)示著樣品含有相應(yīng)的ΒοΝΤ?；诩?xì)胞的高通量篩選測(cè)定具有不僅顯示出可阻斷毒素的蛋白水解活性的試劑而且還可顯示出可阻斷毒素作用中的其他步驟(例如與其細(xì)胞受體的結(jié)合、輕鏈穿過(guò)內(nèi)體 膜的轉(zhuǎn)位以及轉(zhuǎn)位后輕鏈在細(xì)胞溶質(zhì)中的折疊)的試劑的潛力。本發(fā)明還提供了用于使用上述基于細(xì)胞的系統(tǒng)篩選BoNT的抑制劑的方法。具體 地，將表達(dá)合適的BoNT底物-FRET構(gòu)造物的細(xì)胞在候選抑制劑物質(zhì)存在的情況下暴露于相 應(yīng)的BoNT，監(jiān)控FRET信號(hào)的變化以確定候選物是否抑制BoNT的活性。與只可鑒定毒素-底 物相互作用的直接抑制劑的其他基于體外的篩選方法相比較，本發(fā)明的基于細(xì)胞的篩選方 法還允許篩選其他毒素相關(guān)活性(例如但不限于毒素_膜受體結(jié)合、膜轉(zhuǎn)位和細(xì)胞內(nèi)毒素 運(yùn)動(dòng))的抑制劑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，將編碼BoNT底物多肽和兩個(gè)合適的FRET效應(yīng)熒光肽 (FRET-effecting fluorescent peptide)的重組核酸分子，優(yōu)選表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主 細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的表達(dá)載體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物表達(dá)載體用于本發(fā)明，并且 承認(rèn)存在許多選擇。例如，pcDNA系列的載體，例如pCI和pSi (來(lái)自Promega, Madison, Wis.)、CDM8、pCe04。許多此類(lèi)載體使用病毒啟動(dòng)子。優(yōu)選，使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如來(lái)自 BDBiosciences (San Jose, Calif.)的 tet-off 禾口 tet-on 載體。細(xì)胞系的許多選擇適合作為用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞。優(yōu)選，細(xì)胞是其中各BoNT 展示其毒性活性的類(lèi)型的細(xì)胞。換句話(huà)說(shuō)，細(xì)胞優(yōu)選展示合適的細(xì)胞表面受體，或以其他 方式允許毒素充分有效地轉(zhuǎn)移入細(xì)胞，以及允許毒素切割合適的底物多肽。特定的實(shí)例包 括原代培養(yǎng)的神經(jīng)元(皮質(zhì)神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等)；PC12細(xì)胞或衍生 的PC12細(xì)胞系；原代培養(yǎng)的chromaphin細(xì)胞；幾種培養(yǎng)的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，例如鼠膽 堿能Neuro 2a細(xì)胞系、人腎上腺素能SK-N-SH細(xì)胞系和NS-26細(xì)胞系。參見(jiàn)例如Foster 禾口 Stringer (1999), Genetic Regulatory ElementsIntroduced Into Neural Stem and Progenitor Cell Populations, BrainPathology 9底物-FRET多肽的編碼區(qū)在合適的啟動(dòng)子的控制之下。取決于所使用的宿主類(lèi) 型，許多合適的啟動(dòng)子是已知的并且在本領(lǐng)域可容易地獲得。此類(lèi)啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子?？蛇x擇組成型啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)本發(fā)明的期望的多肽的表達(dá)。這樣的表 達(dá)構(gòu)造物可提供額外的有利方面，因?yàn)槠浔荛_(kāi)了對(duì)在含有誘導(dǎo)底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)表達(dá)宿 主的需要。在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中合適的啟動(dòng)子的實(shí)例可以是LTR、SV40和CMV ；在細(xì)菌系統(tǒng)中 是大腸桿菌(E. coli)lac或trp ；在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中是桿狀病毒多角體啟動(dòng)子(polh)和已知在 真核和原核細(xì)胞或它們的病毒中控制表達(dá)的其他啟動(dòng)子。優(yōu)選用于真菌表達(dá)宿主的強(qiáng)組 成型和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例是可從木聚糖酶(xlnA)，植酸酶(phytase)，ATP-合成酶， 亞基9 (oliC)，磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)，醇脫氫酶(AdhA)，α-淀粉酶(amy)，淀粉葡糖苷酶 (AG-來(lái)自glaA基因)，乙酰胺酶(amdS)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpd)啟動(dòng)子的真菌基因 獲得的啟動(dòng)子。強(qiáng)酵母啟動(dòng)子的實(shí)例是可從醇脫氫酶，乳糖酶，3-磷酸甘油酸酯激酶和磷酸 丙糖異構(gòu)酶的基因獲得的啟動(dòng)子。強(qiáng)細(xì)菌啟動(dòng)子的實(shí)例包括SPO2啟動(dòng)子以及來(lái)自細(xì)胞外 蛋白酶基因的啟動(dòng)子。雜合啟動(dòng)子還可用于提高表達(dá)構(gòu)造物的誘導(dǎo)型調(diào)控。啟動(dòng)子可額外地包括確保或 增加在合適的宿主中的表達(dá)的特性。例如，特性可以是保守區(qū)域例如普里布諾框(Pribnow Box)或TATA框。啟動(dòng)子可以甚至包含影響(例如維持、增加或減少)本發(fā)明的核苷酸序 列的表達(dá)水平的其他序列。例如，合適的其他序列包括Shl-內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。其他序列包括誘導(dǎo)型元件_例如溫度、化學(xué)藥品、光或脅迫誘導(dǎo)型元件。同樣，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄或翻譯的 合適的元件可存在。后一種元件的實(shí)例是TMV 5'信號(hào)序列(參見(jiàn)Sleat，1987，Gene 217 217-225 ；和 Dawson，1993，Plant Mol. Biol. 23 97)。表達(dá)載體還可包含作用于啟動(dòng)子以擴(kuò)增表達(dá)的序列。例如，SV40、CMV和多瘤順式 作用元件(增強(qiáng)子)和選擇標(biāo)記可提供用于選擇的表型性狀(例如二氫葉酸還原酶或新霉 素抗性(對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或氨芐青霉素/四環(huán)素抗性(對(duì)于大腸桿菌))。合適的包含 合適的啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記的載體的選擇完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平之內(nèi)。優(yōu)選，底物-FRET多肽的編碼區(qū)在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下。與組成型啟動(dòng)子相 比較，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是優(yōu)選的，因?yàn)槠湓试S適當(dāng)?shù)乜刂萍?xì)胞中報(bào)告因子的濃度，從而極大地 方便了 FRET信號(hào)的變化的測(cè)量。例如，可使用Tet-on 和 Tet-off 系統(tǒng)(BD Biosciences, San Jose, Calif.)控制 FRET報(bào)告分子。在該啟動(dòng)子的控制下，可以以精確的、可逆的和定量的方式調(diào)控基因表達(dá)。 簡(jiǎn)而言之，對(duì)于Tet-on系統(tǒng)，只有當(dāng)多西環(huán)素存在于培養(yǎng)基中時(shí)，下游基因的轉(zhuǎn)錄才發(fā)生。 在轉(zhuǎn)錄進(jìn)行某個(gè)時(shí)期后，我們可改變培養(yǎng)基以排除多西環(huán)素，從而終止新的FRET報(bào)告蛋白 的合成。因此，不存在來(lái)自新合成的FRET蛋白的背景，我們可以能夠在毒素處理后看到更 快的變化。可使用例如光子計(jì)數(shù)落射熒光顯微鏡系統(tǒng)(photon counting印ifluorescent microscope system)(包含適當(dāng)?shù)亩R和濾光片以用于監(jiān)控特定范圍內(nèi)的熒光發(fā)射)、 光子計(jì)數(shù)光電倍增系統(tǒng)或熒光計(jì)來(lái)進(jìn)行熒光分析?？墒褂脷咫x子激光器、高強(qiáng)度水銀(Hg) 弧光燈、導(dǎo)光纖維光源或經(jīng)適當(dāng)濾過(guò)以在期望的范圍內(nèi)激發(fā)的其他高強(qiáng)度光源進(jìn)行起始能 量轉(zhuǎn)移的激發(fā)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將很顯然的是可通過(guò)整合光電倍增管裝置以增強(qiáng) 檢測(cè)靈敏性來(lái)增強(qiáng)激發(fā)/檢測(cè)裝置。例如，可使用兩光子交叉相關(guān)法(two photon cross correlation method)在單分子尺度上實(shí)現(xiàn)檢測(cè)(參見(jiàn)例如Kohl等人，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. ,99 12161,2002)?？蓽y(cè)量許多熒光輸出的參數(shù)。它們包括1)測(cè)量在受體㈧和供體⑶的發(fā)射波 長(zhǎng)上發(fā)射的熒光和根據(jù)它們的發(fā)射振幅的比率確定能量轉(zhuǎn)移的程度；2)測(cè)量D的熒光壽 命；3)測(cè)量D的光漂白速率；4)測(cè)量D和/或A的各向異性；或5)測(cè)量斯托克斯位移激發(fā) 單體/激基締合物熒光。參見(jiàn)例如Mochizuki等人，(2001) 〃 Spatio-temporal images of grow-factor-inducedactivation of Ras and Rapl. " Nature 411 :1065-1068, Sato 等人 (2002)" Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single livingcells. “ Nat Biotechnol. 20 :287_294。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于使用表面等離子體共振成像(srai)技 術(shù)檢測(cè)BoNT的方法。表面等離子體共振(SPR)是已建立的用于檢測(cè)分子結(jié)合的光學(xué)技術(shù)， 其基于支持結(jié)合的化學(xué)藥品的薄金屬膜(通常金)中表面等離子體的產(chǎn)生。表面等離子體 是限制在金屬膜中的自由電子的集體振動(dòng)。這些電子被來(lái)自高折射率棱鏡的光入射場(chǎng)共 振激發(fā)。在該共振激發(fā)發(fā)生所處的范圍內(nèi)入射角q相對(duì)狹窄，并且以在共振入射角qr上 具有最小值的反射光的強(qiáng)度的減小為特征。反射光的相也幾乎隨該區(qū)域中的q線(xiàn)性變化。 qr的值對(duì)存在于數(shù)納米的金屬膜內(nèi)的介質(zhì)的折射率是敏感的。從而，由于分子與膜的結(jié) 合或由于結(jié)合的分子的分子量的變化而引起的折射率的小變化可被檢測(cè)為該角度的變化。許多用于將生物分子錨著至金屬表面的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已知，用于檢測(cè)這樣的錨著和測(cè) 量SPRi的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6，127，129、美國(guó)專(zhuān)利6，330,062, 和 Lee 等人，2001，Anal. Chem. 73:5527-5531，Brockman 等人，1999，J.Am. Chem. Soc. 121 8044-8051，和 Brockman 等人，2000，Annu. Rev. Phys. Chem. 51 :41_63，其全都以其全文通過(guò) 引用合并入本文。實(shí)際上，可將一層BoNT靶肽沉積在金屬上。將懷疑含有相應(yīng)的BoNT的樣品用于組 合表面(composite surface)，然后進(jìn)行溫育以允許毒素(如果存在)切割結(jié)合的靶肽。切 割將導(dǎo)致結(jié)合至金屬表面的肽的分子量減小，然后該減小可使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備和方法來(lái)檢測(cè)。 結(jié)合層的厚度的減小表示切割已發(fā)生，從而表明樣品包含相應(yīng)于靶肽的毒素。備選地，BoNT蛋白與其相應(yīng)的底物肽(所述肽被錨著至金屬表面)的結(jié)合也可引 起折射率的變化，并且可利用已知的SPRi技術(shù)和儀器來(lái)檢測(cè)。許多方法在本領(lǐng)域內(nèi)已知用于將蛋白質(zhì)或肽分子錨著至或沉積在金屬表面。例 如，可向肽的末端加入額外的Cys殘基，然后將該肽交聯(lián)至金屬表面上。間接地，可以首 先將抗體錨著至金屬表面，然后將毒素底物連接至該抗體。通過(guò)抗體進(jìn)行的間接錨著適合 用于本發(fā)明，只要抗體-底物結(jié)合不阻止毒素識(shí)別和進(jìn)入底物的切割位點(diǎn)即可。此外，可 使用鎳-NTA或谷胱甘肽分別拖下(hold 0n)his6或GST融合蛋白。關(guān)于將肽錨著至金 屬表面的另外的信息可見(jiàn)于 Wegner 等人，(2002)Characterization and Optimization of Peptide Arrays for the Study ofpitope-Antibody Interactions Using Surface Plasmon Resonance Imaging" Analytical Chemistry 74 :5161_5168,其以其全文通過(guò)弓| 用合并入本文?？赏ㄟ^(guò)SPRl容易地檢測(cè)核酸分子中大約10至16個(gè)堿基(相應(yīng)于分子量的3，000 至6，400道爾頓)的變化。這暗示可檢測(cè)肽分子中少至16個(gè)氨基酸殘基的變化。該高靈 敏性允許短肽底物至表面上的錨著，而不使用全長(zhǎng)毒素底物蛋白。短肽片段是優(yōu)選的，因?yàn)?它們更穩(wěn)定，可更便宜地制備并且允許更高的反應(yīng)特異性。
實(shí)施例材料和方法生物傳感器DNA構(gòu)造物的構(gòu)建使用EcoRI和BamHI位點(diǎn)將YFPcDNA(Clontech) 插入pECFP-Cl載體(Clontech)以產(chǎn)生pECFP-YFP載體。使用PCR擴(kuò)增編碼大鼠syb II的氨基酸33至94的cDNA，然后使用位于CFP與YFP基因之間的XhoI和EcoRI位 點(diǎn)將其克隆入pECFP-YFP載體，以產(chǎn)生可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CFP-SybII-YFP (也稱(chēng)為 CFP-Syb (33-94)-YFP)構(gòu)造物。使用相同的方法，但使用SNAP-25的殘基141至206構(gòu)建 構(gòu)造物CFP-SNAP-25-YFP (也稱(chēng)為CFP-SNAP-25 (141-206)-YFP)。也制備具有全長(zhǎng)大鼠 SNAP-25B作為連接體的構(gòu)造物(CFP-SNAP25FL-YFP)。為了使用細(xì)菌大腸桿菌純化重組嵌 合蛋白，我們還使用NheI和BamHI位點(diǎn)將CFP-SybII-YFP基因和CFP-SNAP-25-YFP基因從 pECFP-YFP 載體移入 pTrc-his (Invitrogen)載體。使用PCR，通過(guò)定點(diǎn)誘變實(shí)現(xiàn)SNAP-25的4個(gè)Cys殘基至Ala的突變，然后如上所述 將片段插入CFP與YFP之間。通過(guò)首先將編碼SNAP-25的殘基83至120的cDNA片段插入 pEYFP-Nl (Clontech)的 XhoI/EcoRI 位點(diǎn)，然后使用 EcoRI/BamHI 將 CFP-SNAP-25 (141-206)cDNA亞克隆入下游位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建SNAP-25 (83-120) -CFP-SNAP-25 (141-206) -YFP0通過(guò)首先 將全長(zhǎng)Syb II cDNA在EcoRI和BamHI位點(diǎn)插入pECFP-Cl載體，然后將全長(zhǎng)YFP cDNA在 XhoI和EcoRI位點(diǎn)上插入上游來(lái)構(gòu)建YFP-Syb (FL) -CFP。通過(guò)經(jīng)由EcoRI/BamH位點(diǎn)置換 YFP-Syb (FL) -CFP構(gòu)造物中的全長(zhǎng)Syb來(lái)構(gòu)建YFP-Syb (33-116)-CFP。通過(guò)PCR產(chǎn)生所有 cDNA片段。蛋白質(zhì)純化和熒光光譜的獲取如(Chapman等人，A novel functionfor the second C2 domain of synaptotagmin. Ca. 2+-triggered dimerization. J. Biol. Chem. 271, 5844-5849 (1996))所述純化 His6-標(biāo)記的 CFP-Sybll-YFP 和 CFP-SNAP-25-YFP 蛋白。使用 HEPES緩沖液(50mM HEPES, pH7. 1)透析蛋白質(zhì)過(guò)夜。將300nM蛋白在小杯中置于總體積 500 μ 1 HEPES緩沖液中，所述緩沖液含有2mM DTT和10 μ M ZnCl20使用PTIQM-1熒光計(jì) 收集從450ηΜ至550ηΜ的發(fā)射光譜。激發(fā)波長(zhǎng)是434ηΜ，其為CFP的最佳激發(fā)波長(zhǎng)。肉毒桿菌神經(jīng)毒素的激活和監(jiān)控生物傳感器蛋白的切割將ΒοΝΤ/Α、B、E或F與 2mM DTT和10 μ M ZnCl2于37°C下一起溫育30分鐘以將毒素的輕鏈從重鏈還原。為了進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)，使用PTIQM-I熒光計(jì)，向裝有300nM相應(yīng)的FRET傳感器的小杯中加入IOnM BoNT/A、E 或50nM BoNT/B、F。在加入毒素后的某些時(shí)間間隔(例如0、2、5、10、30、60、90分鐘)上如 上所述收集發(fā)射光譜。在各發(fā)射掃描結(jié)束時(shí)，收集小部分樣品(30 μ 1)，將其與SDS-上樣緩 沖液混合，過(guò)后將其經(jīng)歷SDS-page凝膠。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL) (Pierce)，利用抗_his6 抗體顯現(xiàn)傳感器蛋白和切割產(chǎn)物。為了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用熒光分光光度計(jì)，在96孔板中以每孔100 μ 1的體積制備 300nM FRET傳感器蛋白。向各孔中加入不同濃度的BoNT，然后在434nM處激發(fā)樣品。以30 秒的間隔收集YFP通道(527nM)和CFP通道(470nM)的發(fā)射光譜，進(jìn)行90分鐘。對(duì)于每一 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，通過(guò)YFP通道與CFP通道之間的比率確定FRET比率。在毒素處理后測(cè)量活細(xì)胞中FRET速率的變化，使用電穿孔(Bio-Rad)將DNA構(gòu)造 物pECFP-SNAP25-YFP用于轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞經(jīng)歷24小時(shí)，然后向培養(yǎng)基中 加入50ηΜ ΒοΝΤ/Α。在與毒素一起溫育72小時(shí)后，使用Nikon TE-300顯微鏡收集表達(dá)FRET 傳感器的細(xì)胞的熒光圖象。使用下列濾光片組(Chroma Inc.) :CFP通道CFP激發(fā)濾光片 (436/10nm)、JP4 分光器(beamsplitter)、CFP 發(fā)射濾光片(470/30nm) ；FRET 通道CFP 激 發(fā)濾光片(436/10nm)、JP4分光器、YFP發(fā)射濾光片(535/30nm)收集每一個(gè)孔(CFP通道和 FRET通道)的兩個(gè)圖象。從各圖象減去背景(不包含細(xì)胞的區(qū)域)，然后使用MetaMorph軟 件比較各細(xì)胞的CFP通道和FRET通道的熒光強(qiáng)度。如之前所述，通過(guò)FRET通道與CFP通 道之間的強(qiáng)度比率來(lái)確定FRET速率。對(duì)照細(xì)胞不用毒素處理，但以相同的方式進(jìn)行分析。 為了在活細(xì)胞中檢測(cè)BoNT/B，我們?nèi)缟纤鍪褂孟嗤椒ㄞD(zhuǎn)染表達(dá)syt II的PC12細(xì)胞系?；罴?xì)胞成像和FRET分析通過(guò)電穿孔(Bio-Rad，CA)用圖注中指定的不同cDNA 構(gòu)造物轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。使用具有100倍油浸物鏡的NikonTE-300顯微鏡收集熒光圖 象。使用已建立的方法，利用三濾光片組方法(three-filter set method) (Gordon等 人，Quantitative fluorescenceresonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J. 74, 2702-2713 (1998) ；Sorkin 等人，Interaction of EGF receptorand grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET)microscopy. Curr. Biol. 10，1395—1398 (2000))定量活細(xì)胞中的CFP/YFP FRET。簡(jiǎn)而言之，對(duì)于每一個(gè)細(xì)胞，通過(guò)3個(gè)不同的濾光片組CFP濾光片(激發(fā)， 436/10nm ；發(fā)射，470/30nm) ,FRET 濾光片(激發(fā)，436/10nm ；發(fā)射，535/30nm)和 YFP 濾光片 (激發(fā)，500/20歷，發(fā)射，535/30nm)獲得3張連續(xù)的圖象。使用JP4分光器(Set ID 86000， Chromalnc. VT) 0使用完全相同的設(shè)置(4x4 Binning，200ms暴光時(shí)間)獲得所有圖象。為 了排除可因熒光蛋白的高表達(dá)水平而產(chǎn)生的濃度依賴(lài)性FRET信號(hào)，在我們的實(shí)驗(yàn)中只計(jì) 數(shù)具有低于最大12-比特等級(jí)(scale) (1-2097灰度)的半值的CFP和YFP強(qiáng)度的細(xì)胞 (Miyawaki ^Α Monitoringprotein conformations and interactions by fluorescence resonance energytransfer between mutants of green fluorescent protein. Methods Enzymol. 327,472-500 (2000) ；Erickson 等人，DsRed as a potential FRET partnerwith CFP and GFP. Biophys J 85，599-611 (2003))。在計(jì)算FRET值之前從各原始圖象中減去 背景(來(lái)自不包含細(xì)胞的區(qū)域)。然后獲得和比較各圖象的熒光強(qiáng)度值。首先檢測(cè)單獨(dú)用 CFP或YFP轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞以獲得這些濾光片組的串?dāng)_值(crosstalk value)。FRET濾 光片通道對(duì)于CFP顯示大約56-64%的滲透(bleed-through)，對(duì)于YFP顯示大約24%的 滲透。當(dāng)使用CFP濾光片時(shí)對(duì)于YFP事實(shí)上沒(méi)有串?dāng)_，或使用YFP濾光片時(shí)對(duì)CFP沒(méi)有串 擾，這極大地簡(jiǎn)化了 FRET計(jì)算。對(duì)于表達(dá)毒素傳感器的細(xì)胞，使用下列公式計(jì)算“矯正的 FRET” 矯正的 FRET = FRET-(CFP XO. 60) -(YFP X 0. 24)，其中 FRET、CFP 和 YFP 分別相應(yīng) 于通過(guò)FRET、CFP和YFP濾光片組獲得的圖象的熒光強(qiáng)度。來(lái)自CFP和YFP熒光的滲透的 平均分?jǐn)?shù)分別為0. 6和0. 24，當(dāng)通過(guò)FRET濾光片組獲得圖象時(shí)。因?yàn)镃FP-SNAP25FL-YFP 傳感器的毒素切割導(dǎo)致YFP片段的膜分離，所述YFP片段在細(xì)胞溶質(zhì)中被降解(圖7c， e)，因此將用于我們的數(shù)據(jù)分析的FRET比率計(jì)算為根據(jù)單獨(dú)的CFP熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化的 “矯正的FRET”值(矯正的FRET/CFP)。我們注意到，如果FRET發(fā)生，這些計(jì)算中的CFP 強(qiáng)度由于供體猝滅而被低估。然而，已報(bào)導(dǎo)，由于供體猝滅而產(chǎn)生的CFP熒光的減少只 有大約 5-10% (Gordon 等人，Quantitative fluorescenceresonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J 74,2702-2713 (1998)； Sorkina 等 人，Oligomerization ofdopamine transporters visualized in living cells by fluorescence resonanceenergy transfer microscopy. J. Biol. Chem.278, 28274-28283(2003))。使用 MetaMorph 軟件(UniversalImaging Corp.，PA)進(jìn)行所有成像 和計(jì)算。為了進(jìn)行包括毒素處理的實(shí)驗(yàn)，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入指定的全毒素，進(jìn)行不同的 時(shí)間，然后如上所述分析細(xì)胞。用毒素傳感器轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞，但不用毒素處理對(duì)照細(xì)胞，然 后以相同的方式分析它們。毒素底物切割的免疫印跡分析用如圖注中指定的不同毒素傳感器cDNA構(gòu)造物 轉(zhuǎn)染野生型PC12細(xì)胞或Syt II+PC12細(xì)胞(Dong等人，2003，同上)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)向 培養(yǎng)基中加入BoNT/A或B，將細(xì)胞再溫育另外48小時(shí)。然后收獲細(xì)胞，如之前所述將細(xì) 胞裂解物經(jīng)歷免疫印跡分析。用相同的cDNA構(gòu)造物轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞，除了不用毒素處理之 外，平行地測(cè)定所述細(xì)胞。用毒素體外處理三分一的對(duì)照細(xì)胞裂解物(200nMBoNT/A或B， 在37°C下進(jìn)行30分鐘)，然后將其經(jīng)歷免疫印跡分析。使用抗-SNAP-25抗體26測(cè)定內(nèi)源 SNAP-25和轉(zhuǎn)染的CFP-SNAP-25-YFP傳感器。也使用GFP多克隆抗體(Santa Cruz.，CA)測(cè) 定 CFP-SNAP-25-YFP 和 CFP-SybII-YFP 傳感器蛋白。將抗 _his6 抗體(Qigen Inc.，CA)用于測(cè)定重組傳感器蛋白的切割。棚列1 軒CFP-YFP FRET細(xì)物#龍禾_浦謝申縫麵舶隨性為了使用FRET法監(jiān)控肉毒桿菌神經(jīng)毒素蛋白酶活性，通過(guò)syb II或SNAP-25片 段連接CFP和YFP蛋白(分別表示為CFP-SybII-YFP和CFP-SNAP-25-YFP)(圖1A)。使用 毒素底物的短片段而非全長(zhǎng)蛋白質(zhì)以最優(yōu)化CFP-YFP能量轉(zhuǎn)移效率，所述能量轉(zhuǎn)移效率隨 距離增加而呈指數(shù)下降。然而，當(dāng)靶蛋白片段變得太短時(shí)，BoNT產(chǎn)生的切割效率顯著降低。 因此，使用包含小突觸泡蛋白序列的氨基酸33至96的區(qū)域，因?yàn)橐褕?bào)導(dǎo)其保持與全長(zhǎng)小突 觸泡蛋白相同的由BoNT/B、F和TeNT產(chǎn)生的切割率。類(lèi)似地，選擇SNAP-25的殘基141至 206以確保構(gòu)建物仍然可被BoNT/A和E識(shí)別和切割。FRET測(cè)定描述于圖IB中。當(dāng)在434nM (CFP的最佳激發(fā)波長(zhǎng))上激發(fā)時(shí)， CFP-SybII-YFP和CFP-SNAP-25-YFP嵌合蛋白將因CFP-YFP對(duì)之間的FRET而引發(fā)YFP熒光 發(fā)射。肉毒桿菌神經(jīng)毒素可識(shí)別和切割CFP與YFP之間的短底物片段，在CFP與YFP分離 后，F(xiàn)RET信號(hào)被消除。因?yàn)榭稍诨罴?xì)胞中表達(dá)此類(lèi)嵌合蛋白，因此也將它們稱(chēng)為肉毒桿菌 神經(jīng)毒素的“生物傳感器”。我們首先純化CFP-SybII-YFP和CFP-SNAP-25-YFP的his6_標(biāo)記的重組嵌合蛋白， 然后使用PTIQM-I熒光計(jì)表征它們的發(fā)射光譜。如所預(yù)期的，兩種生物傳感器蛋白，當(dāng)在 434nM處激發(fā)它們的CFP時(shí)，都在525nM處顯示明顯的YFP熒光峰(圖2B，C)。相反地，當(dāng) 在434nM處直接激發(fā)時(shí)，單獨(dú)的YFP只產(chǎn)生少量熒光信號(hào)(圖2A)。單個(gè)的CFP和YFP的 混合物在525nM處不具有峰發(fā)射(圖2A)。這顯示使用生物傳感器蛋白觀察到的YFP熒光 峰由FRET弓丨起。因?yàn)镕RET比率(YFP熒光強(qiáng)度/CFP熒光強(qiáng)度)受許多因素例如緩沖液組 成、Zn.2+濃度和還原劑的濃度(數(shù)據(jù)未顯示)影響，因此此后的實(shí)驗(yàn)都在相同的緩沖條件 (50mM Hepes,2mM ΤΤ,ΙΟμΜ ZnCl2, ρΗ 7. 1)中進(jìn)行。加入 2mM DTT 禾口 10 μ M Zn.2+以最優(yōu) 化肉毒桿菌神經(jīng)毒素的蛋白酶活性。實(shí)施例2 體外監(jiān)控肉毒桿菌神經(jīng)毒素對(duì)生物傳感器蛋白的切割將300nM嵌合蛋白CFP-SybII-YFP與50nM預(yù)還原的BoNT/B全毒素在小杯中混合。 在加入BoNT/B后不同的時(shí)間點(diǎn)(0、2、5、10、30、60分鐘等)上收集發(fā)射光譜。在各掃描結(jié) 束時(shí)，從小杯中取出少量體積的樣品(30 μ 1)，將其與SDS-上樣緩沖液混合。之后將此類(lèi) 樣品經(jīng)歷SDS-page凝膠，使用抗重組嵌合蛋白中的his6標(biāo)記的抗體顯現(xiàn)嵌合蛋白的切割。 如圖3A中所示，生物傳感器蛋白與BoNT/B的溫育導(dǎo)致YFP發(fā)射的減少和CFP發(fā)射的增加。 FRET比率的降低與BoNT/B對(duì)嵌合蛋白的切割的程度一致(圖3A，下圖)。該結(jié)果顯示可通 過(guò)記錄其FRET比率的變化來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控生物傳感器蛋白的切割。進(jìn)行相同的測(cè)定以檢測(cè)BoNT/F對(duì)CFP-SybII-YFP的切割和BoNT/A或E對(duì) CFP-SNAP-25-YFP的切割(圖3B、C、D)。對(duì)于使用BoNT/B的實(shí)驗(yàn)獲得相似的結(jié)果。在所 有情況下，我們使用光學(xué)讀出和免疫印跡分析都觀察到相同的底物切割的動(dòng)力學(xué)。在我們 的測(cè)定中，BoNT/A和E切割它們的嵌合底物比BoNT/B和F切割要快得多。因此，為了記錄 前數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生的變化，只能使用IOnM BoNT/A或E。嵌合蛋白的切割是特異性的，因?yàn)閷?BoNT/B 和 F 與 CFP-SNAP-25-YFP 混合，或?qū)?BoNT/A 和 E 與 CFP-SybII-YFP 混合都未導(dǎo)致 FRET比率或底物切割的任何變化(數(shù)據(jù)未顯示)。^MM 3 用微量滴定板熒光分光光Iti十實(shí)時(shí)監(jiān)控肉毒桿If神經(jīng)毒素的g白 活件上述實(shí)驗(yàn)顯示可通過(guò)監(jiān)控肉毒桿菌神經(jīng)毒素的靶生物傳感器蛋白的發(fā)射光譜的 變化體外檢測(cè)肉毒桿菌神經(jīng)毒素的活性。然后我們確定我們是否能夠使用酶標(biāo)儀實(shí)時(shí)監(jiān)控 生物傳感器蛋白的切割-這將證實(shí)采用該測(cè)定進(jìn)行進(jìn)一步的高通量篩選的可行性。如圖4A 中所示，將300nMCFP-SNAP-25-YFP嵌合蛋白與IOnM BoNT/A在96孔板中混合。在436nm處 激發(fā)CFP，以30秒的間隔在90分鐘內(nèi)記錄CFP通道(470nM)和YFP通道(527nM)的熒光。 BoNT/A的加入導(dǎo)致YFP通道發(fā)射的減少和CFP通道發(fā)射的增加。該結(jié)果使得我們能夠?qū)崟r(shí) 跟蹤多個(gè)樣品中肉毒桿菌神經(jīng)毒素的酶促活性的動(dòng)力學(xué)。例如，如圖4B中所示，將不同濃 度的BoNT/A或E加入至300nM CFP-SNAP-25-YFP,如圖4A中所述同時(shí)監(jiān)控各樣品的FRET 比率。FRET比率的變化與毒素的濃度相關(guān)-更高的毒素濃度導(dǎo)致更快的FRET比率的降低。 FRET比率的該變化是特異性的，因?yàn)閷?duì)于單獨(dú)的CFP-SNAP-25-YFP(圖4C，左圖)或CFP與 YFP的混合物(圖4C，右圖)未檢測(cè)到顯著的變化。雖然在該階段難以使FRET比率的變化與生物傳感器蛋白的實(shí)際切割進(jìn)行關(guān)聯(lián)， 但該方法仍然提供了同時(shí)比較多個(gè)樣品間毒素切割動(dòng)力學(xué)(當(dāng)制備和掃描這些樣品時(shí))的 最容易的方法_其特別適用于高通量篩選毒素的抑制劑，因?yàn)槠淇商峁╆P(guān)于抑制劑影響毒 素的酶促活性的機(jī)制的信息。我們注意到，在這些情況下，各動(dòng)力學(xué)參數(shù)的單位可以是FRET 比率而不是底物濃度。通過(guò)將不同濃度的毒素與固定量的它們的靶生物傳感器一起溫育一定的時(shí)間來(lái) 確定基于該FRET的測(cè)定的靈敏性。使用微量滴定板熒光分光光度計(jì)來(lái)記錄FRET比率，并 將其對(duì)毒素濃度作圖。如圖5A中所示，該方法對(duì)于BoNT/A和E(在4小時(shí)溫育后)具有相 似的靈敏性(對(duì)于BoNT/A的EC50是15pM，對(duì)于BoNT/E的EC50是20pM，上圖)，進(jìn)行16小 時(shí)的溫育稍微增加了檢測(cè)靈敏性(圖5A，下圖)。對(duì)于BoNT/B和F的靈敏性彼此相近，但 在4小時(shí)溫育后比BoNT/A和E低大約10倍(圖5B，上圖，對(duì)于BoNT/B，EC50為242pM，對(duì) 于BoNT/F，EC50為207pM)。溫育期延長(zhǎng)至16小時(shí)分別使檢測(cè)BoNT/B和BoNT/F的活性的 能力增加了 8倍和2倍。實(shí)施例4 監(jiān)控活細(xì)胞中肉毒桿菌神經(jīng)毒素的活性基于CFP-YFP的生物傳感器測(cè)定不僅可用于體外檢測(cè)肉毒桿菌神經(jīng)毒素，而且還 可用于活細(xì)胞中。為了建立該應(yīng)用，用CFP-SNAP-25-YFP轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。PC12細(xì)胞是能 夠吸收BoNT/A和E的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞系。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與BoNT/A (50nM) —起溫育72小 時(shí)，然后使用配備有用于CFP-YFP FRET檢測(cè)的專(zhuān)用濾光片組的落射熒光顯微鏡記錄表達(dá) CFP-SNAP25-YFP的細(xì)胞的FRET比率。簡(jiǎn)而言之，將FRET比率計(jì)算為使用兩個(gè)濾光片組(一 個(gè)用于CFP (激發(fā)437nm/發(fā)射470nm)，另一個(gè)用于FRET (激發(fā)437nm/發(fā)射535nm))收集 的來(lái)自相同細(xì)胞的圖象的熒光強(qiáng)度之間的比率。收集總共53個(gè)細(xì)胞，將其與相同數(shù)目的對(duì) 照細(xì)胞相比較，所述對(duì)照細(xì)胞表達(dá)相同生物傳感器蛋白但不暴露于毒素。如圖6A中所示， 對(duì)于被檢查的細(xì)胞群體，BoNT/A處理72小時(shí)顯著降低FRET比率(p < 1. 47Ε-05)。野生型 PC12細(xì)胞對(duì)BoNT/B和F不敏感。最近建立表達(dá)突觸結(jié)合蛋白ΙΙ(ΒοΝΤ/Β的受體)和CFP-SybII-YFP生物傳感 器的PC12細(xì)胞系。將此類(lèi)細(xì)胞用于檢測(cè)BoNT/B在活細(xì)胞中的作用。如圖6Β中所示， ΒοΝΤ/Β(30ηΜ)處理72小時(shí)顯著降低了細(xì)胞中表達(dá)的生物傳感器蛋白的FRET比率(ρ< 2. 1E-10)。我們注意到，仍然存在大量對(duì)于兩種生物傳感器蛋白未顯示改變FRET比率的 細(xì)胞。存在幾種可能的解釋。第一，毒素/生物傳感器蛋白的比率在此類(lèi)細(xì)胞中可能太低， 從而生物傳感器蛋白的顯著切割可能需要更長(zhǎng)的溫育時(shí)間。第二，此類(lèi)細(xì)胞可能具有高水 平的蛋白質(zhì)合成活性，因此新的生物傳感器蛋白被快速合成來(lái)替代切割產(chǎn)物。然而，這些實(shí) 驗(yàn)證實(shí)了在活細(xì)胞和神經(jīng)元中采用基于該FRET的測(cè)定的可行性。實(shí)施例5 =BoNT的基于細(xì)胞的檢測(cè)為了進(jìn)行基于細(xì)胞的研究，我們首先用CFP-SNAP-25 (141-206)-YFP傳感器 轉(zhuǎn)染PC12(圖7a)。使用已建立的三濾光片組方法，如圖2a中所示，用落射熒光顯微 It ^tH ^ ^ffl Ifi Φ FRET ^ ff (Gordon, ^A, Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements usingfluorescence microscopy. Biophys.J.74, 2702-2713(1998)；禾口 Sorkin 等人，Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized byfluorescence resonance energy transfer(FRET)microscopy. Curr. Biol. 10，1395-1398 (2000)，如上文中在材料和方法部分所描述的。用50nMBoNT/ A處理轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞，進(jìn)行96小時(shí)。分析它們的熒光圖象，將標(biāo)準(zhǔn)化的FRET比率(矯 正的FRET/CFP)作圖于圖7b中。雖然報(bào)導(dǎo)SNAP-25 (141-206)片段在體外具有與全長(zhǎng) SNAP-25 tB^W^S^I1]^ (ffashbourne ^A, Botulinum neurotoxin types A and E require theSNARE motif in SNAP—25 for proteolysis. FEBS Lett. 418,1-5(1997)), 但CFP-SNAP-25 (141-206)-YFP在活細(xì)胞中表現(xiàn)為不敏感的(poor)毒素底物。溫育BoNT/ A(50nM)96小時(shí)在細(xì)胞群體當(dāng)中展示FRET比率的小(但顯著的)偏移，這表明切割在細(xì)胞 中是無(wú)效的，并且該傳感器對(duì)于細(xì)胞中的毒素檢測(cè)不實(shí)用。令人驚訝地，我們發(fā)現(xiàn)使用全長(zhǎng)SNAP-25作為CFP與YFP之間的連接體，盡 管SNAP-25在長(zhǎng)度上為206個(gè)氨基酸殘基，當(dāng)在PC12細(xì)胞中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生顯著水平的 FRET (圖7c和8c)。該FRET信號(hào)依賴(lài)于SNAP-25的膜錨著，因?yàn)閷?dǎo)致蛋白質(zhì)(稱(chēng)為 CFP-SNAP-25 (Cys-Ala) -YFP)的細(xì)胞溶質(zhì)分布的SNAP-25內(nèi)的棕櫚酰化位點(diǎn)的突變(Cys 85、88、90、92Ala)(Lane&Liu, Characterization of the palmitoylation domain of SNAP-25. J. Neurochem. 69，1864-1869(1997) ;Gonzalo 等人，SNAP-25 is targeted to the ρlasmamembrane through a novel membrane-binding domain. J. Biol. Chem. 274, 21313-21318(1999) ；Koticha 等人，Plasma membrane targeting ofSNAP-25increases its local concentration and is necessary for SNAREcomplex formation and regulated exocytosis. J. Cell Sci. 115,3341-3351 (2002) ；GoneIle-Gispert 等 人’ Membrane localization and bioIogicalactivity of SNAP-25 cysteine mutants in insulin-secreting cells. J. Cell Sci. 113 (Pt 18)，3197-3205 (2000))顯著地減少 FRET 信號(hào)(圖7d)。該發(fā)現(xiàn)表明SNAP-25的膜錨著可導(dǎo)致使SNAP-25的N端和C端彼此靠近的構(gòu) 象變化。該傳感器稱(chēng)為CFP-SNAP-25 (FL) -YFP。表達(dá)CFP-SNAP-25 (FL) -YFP的細(xì)胞與50nM BoNT/A的溫育導(dǎo)致在一段時(shí)間內(nèi)FRET比率的漸進(jìn)降低(圖7c，右圖)。傳感器的BoNT/A 切割產(chǎn)生兩個(gè)片段保持在膜上的用CFP標(biāo)記的SNAP-25的N末端片段(圖2c，中圖)和預(yù) 期在毒素切割后重新分配入細(xì)胞溶質(zhì)的用YFP標(biāo)記的SNAP-25的短C末端片段。有趣地， 我們注意到，C末端切割產(chǎn)物SNAP-25 (198-206)-YFP在毒素切割后大量消失(圖2c，中圖 的“YFP”圖框)。該觀察通過(guò)免疫印跡分析得到確認(rèn)(圖7e)，表明該可溶性片的段降解比保留在膜上的其他片段快得多。該預(yù)料之外的結(jié)果提供了通過(guò)只監(jiān)控CFP與YFP熒光之間 的比率來(lái)檢測(cè)活細(xì)胞中毒素的活性的備選方法。最近報(bào)導(dǎo)BoNT/A輕鏈包含膜定位信號(hào)并且在分化的PC12細(xì)胞中靶向質(zhì)膜 (Fernandez-Salas 等人，Plasma membrane localization signals inthe light chain of botulinum neurotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101，3208—3213 (2004)。 因此， 我們調(diào)查SNAP-25的膜錨著對(duì)于BoNT/A產(chǎn)生有效切割是至關(guān)重要的可能性。為了 直接檢測(cè)該想法，將CFP-SNAP-25 (Cys-Ala) -YFP (其分布在細(xì)胞溶質(zhì)中(圖7d))和 CFP-SNAP-25 (FL) -YFP (其被錨著至質(zhì)膜)用于轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，并且就BoNT/A在細(xì) 胞中產(chǎn)生的切割平行地對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。如圖7e中所示，細(xì)胞與BoNT/A —起溫育導(dǎo)致 大量的CFP-SNAP-25 (FL) -YFP傳感器被切割，然而在相同測(cè)定條件下不存在可檢測(cè)的 CFP-SNAP-25 (Cys-Ala) -YFP 的切割。為了進(jìn)一步確認(rèn)該發(fā)現(xiàn)，我們還使用SNAP-25的短片段(殘基83至120，其可將 GFP 革巴向質(zhì)膜)(Gonzalo 等人,SNAP—25 is targeted to theplasma membrane through a novel membrane-binding domain. J. Biol. Chem. 274，21313-21318 (1999))(圖 8a)將含有 SNAP-25 (141-206)的無(wú)效傳感器靶向質(zhì)膜。如所預(yù)期的，CFP-SNAP-25 (141-206) -YFP傳感 器至質(zhì)膜的錨著導(dǎo)致由BoNT/A產(chǎn)生的有效切割(圖8b)。這些發(fā)現(xiàn)顯示SNAP-25的亞細(xì)胞 定位確實(shí)對(duì)于BoNT/A在細(xì)胞中產(chǎn)生有效切割是至關(guān)重要的。接著我們檢測(cè)CFP-Syb (33-94) -YFP傳感器是否可用于測(cè)定BoNT/B在細(xì)胞中的活 性。為了進(jìn)行此類(lèi)研究，我們使用表達(dá)突觸結(jié)合蛋白II的PC12細(xì)胞，所述突觸結(jié)合蛋白II 介導(dǎo)BoNT/B進(jìn)人細(xì)胞(Dong^ASynaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells. J. Cell Biol. 162，1293-1303 (2003))。如圖 9a(上圖)中所示， 轉(zhuǎn)染的CFP-Syb (33-94) -YFP是遍布于細(xì)胞的可溶性蛋白。與CFP-SNAP-25 (141-206) -YFP 的情況相似，BoNT/B (50nM, 96小時(shí))處理只稍微降低了 FRET比率(圖9a，下圖)，這表明 該傳感器的切割在細(xì)胞中也是無(wú)效的。我們對(duì)于BoNT/A傳感器的經(jīng)驗(yàn)促使我們研究Syb的亞細(xì)胞定位對(duì)于BoNT/B產(chǎn) 生的Syb的切割是否是至關(guān)重要的。內(nèi)源Syb在長(zhǎng)度上為116個(gè)氨基酸殘基，并且通過(guò)單 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(殘基95-116，圖9b)存在于分泌小泡上。為了確保恰當(dāng)?shù)男∨荻ㄎ?，我?將全長(zhǎng)Syb用作CFP與YFP之間的連接體。因?yàn)镃FP相對(duì)抗小泡腔中的酸性環(huán)境(Tsien， The greenfluorescent protein. Annu. Rev Biochem 67, 509-544 (1998), Sift^ CFP
至Syb的C端，并且預(yù)測(cè)其存在于小泡內(nèi)部，同時(shí)將YFP融合至Syb的N端，其面向細(xì)胞溶 質(zhì)(圖9b)。該傳感器稱(chēng)為YFP-Syb (FL) -CFP。因?yàn)镕RET不可能在此處的CFP與YFP之間 發(fā)生，因此采用新的方法監(jiān)控BoNT/B產(chǎn)生的切割。YFP-Syb(FL)-CFP傳感器的切割可產(chǎn)生 兩個(gè)片段，包括用YFP標(biāo)記的N末端部分，其可被釋放入細(xì)胞溶質(zhì)中，和用CFP標(biāo)記的短C 末端部分，其被限制在小泡內(nèi)。因此，毒素活性將導(dǎo)致YFP熒光在細(xì)胞內(nèi)的重新分布。已證 明YFP-Syb(FL)-CFP在細(xì)胞中是有效的毒素傳感器。如圖9c中所指出的，使用BoNT/B的 處理導(dǎo)致YFP與小泡分離和其至細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)的重新分布。我們注意到，可溶性YFP片段能 夠進(jìn)入在毒素處理前其中沒(méi)有熒光信號(hào)的細(xì)胞核(圖9c)，從而提供了其中可容易地檢測(cè) 到Y(jié)FP重新分布的區(qū)域。與FRET測(cè)定不同，該檢測(cè)方法不需要CFP與YFP之間的短距離， 從而提供了在活細(xì)胞中監(jiān)控蛋白酶活性的新方法。
為了排除含有Syb (33-94)片段的傳感器的無(wú)效切割是由于缺乏N末端32個(gè) 氨基酸而引起的可能性，構(gòu)建包含缺乏N末端32個(gè)氨基酸殘基的Syb的截?cái)嘈问降膫?感器(稱(chēng)為CFP-Syb (33-116)-YFP)。該傳感器包含與無(wú)效傳感器(殘基33至94)相同 的Syb的細(xì)胞溶質(zhì)結(jié)構(gòu)域和將其錨著至小泡的跨膜結(jié)構(gòu)域(殘基95至116)。當(dāng)平行 測(cè)定時(shí)，在48小時(shí)后，BoNT/B切割顯著量的CFP-Syb (33-116) -YFP，然而不存在可檢測(cè) 的CFP-Syb (33-94)-YFP的切割(圖9d)，這表明小泡定位決定細(xì)胞中的切割效率。該結(jié) 論進(jìn)一步得到最近的報(bào)導(dǎo)帶負(fù)電荷的脂質(zhì)混合物的存在增加了 BoNT/B、TeNT和BoNT/ F 本夕卜貞害Ij Syb 的(Caccin 入，VTVMP/synaptobrevin cleavage by tetanus and botulinum neurotoxins is stronglyenhanced by acidic liposomes. FEBS Lett. 542, 132-136(2003)支持。毒素在細(xì)胞中可能有利于結(jié)合液泡膜，從而增加遇到定位在小泡上 的Syb的機(jī)會(huì)。備選地，跨膜結(jié)構(gòu)域的存在也可能對(duì)于維持Syb的恰當(dāng)構(gòu)象狀態(tài)(所述狀 態(tài)是有效切割所必需的)是至關(guān)重要的。使用全長(zhǎng)SNAP-25和Syb II作為連接體提供了可反映活細(xì)胞中內(nèi)源底物切割的 優(yōu)良的光學(xué)報(bào)告分子。這兩種報(bào)告分子應(yīng)當(dāng)能夠檢測(cè)所有七種肉毒桿菌神經(jīng)毒素和破傷風(fēng) 神經(jīng)毒素(TeNT)?？赏ㄟ^(guò)改變長(zhǎng)度或突變其他毒素切割或識(shí)別位點(diǎn)來(lái)容易地修飾底物連接 體序列，從而獲得對(duì)單個(gè)BoNT或TeNT的特異性檢測(cè)。此類(lèi)毒素生物傳感器應(yīng)當(dāng)使得能夠 進(jìn)行毒素抑制劑的基于細(xì)胞的篩選和細(xì)胞中毒素的底物識(shí)別和切割的研究。上述描述和實(shí)施例只是提出來(lái)舉例說(shuō)明本發(fā)明的而不意欲限定本發(fā)明。因?yàn)榘?本發(fā)明的精神和物質(zhì)的公開(kāi)的實(shí)施方案的變動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可以發(fā)生的，因 此本發(fā)明應(yīng)當(dāng)概括地解釋為包括落在所述權(quán)利要求和其等價(jià)物的范圍內(nèi)的所有變化。所有 上文中引用的和/或下面列出的參考文獻(xiàn)明確地通過(guò)引用合并入本文。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)很顯然的是除了已描述的修飾外的許多修飾是可能的， 而不背離本文中的發(fā)明概念。因此，除了在所述權(quán)利要求的精神內(nèi)，本發(fā)明的主題不受限 制。此外，在解釋說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，應(yīng)當(dāng)以與上下文一致的最廣泛的可能方式解釋所有 術(shù)語(yǔ)。特別地，術(shù)語(yǔ)“包含”和“包括”應(yīng)當(dāng)解釋為是指以非排他的方式存在的元素、組分或 步驟，表明提及及的元素、組成或步驟可與其他未明確提及的元素、組分或步驟一起存在， 或利用或組合。在本說(shuō)明書(shū)的權(quán)利要求提及至少一個(gè)選自A、B、C....和N的東西的情況 下，正文應(yīng)當(dāng)解釋為只需要一個(gè)來(lái)自組的元素，而非A+N或B+N等。
權(quán)利要求
一種構(gòu)造物，其具有定位成提供電子耦合的供體標(biāo)記和受體標(biāo)記，這樣供體可通過(guò)偶極 偶極耦合機(jī)制將能量轉(zhuǎn)移至受體；和置于供體與受體之間的連接體，其具有切割位點(diǎn)序列以及供體與切割位點(diǎn)序列和受體與切割位點(diǎn)序列的至少一個(gè)之間的間隔子。
2.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中供體和受體中的至少一個(gè)是熒光基團(tuán)和生色團(tuán)中的至少一個(gè)。
3.權(quán)利要求ι的構(gòu)造物，其中偶極-偶極耦合機(jī)制是F0rster共振能量轉(zhuǎn)移(fret)。
4.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中連接體具有大于等于5nm的一級(jí)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度。
5.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中連接體具有大于等于8nm的一級(jí)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度。
6.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中連接體具有大于等于12nm的一級(jí)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度。
7.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中連接體包含具有至少3個(gè)氨基酸的間隔子。
8.權(quán)利要求7的構(gòu)造物，其中連接體包含SNARE基序。
9.權(quán)利要求7的構(gòu)造物，其中間隔子具有至少5個(gè)氨基酸。
10.權(quán)利要求7的構(gòu)造物，其中間隔子包含(GGGGS)n，其中η是1至3。
11.權(quán)利要求7的構(gòu)造物，其中間隔子包含(ΕΑΑΑΚ)η，其中η是1至3。
12.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中相對(duì)于相應(yīng)的無(wú)間隔子的構(gòu)造物，間隔子增加電子耦I(lǐng)=I O
13.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中間隔子包含SNARE基序。
14.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中切割位點(diǎn)序列包含SNARE蛋白突變蛋白。
15.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中切割位點(diǎn)序列包括(a)SNARE蛋白、基序、突變蛋白的至少一個(gè)，和(b)具有至少5個(gè)氨基酸的間隔子。
16.權(quán)利要求15的構(gòu)造物，其中間隔子包括選自(GGGGS)n和(EAAAK)η的序列，其中η 是1至3。
17.權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中構(gòu)造物選自CFP-(SGLRSRA) -SNAP-25- (SNS) -YFP和 CFP- (SGLRSRA)-小突觸泡蛋白-(SNS) -YFP。
18.提高供體標(biāo)記與受體標(biāo)記之間的能量轉(zhuǎn)移的靈敏性的方法，其包括 提供包含通過(guò)連接體物理偶聯(lián)的供體標(biāo)記和受體標(biāo)記的構(gòu)造物；在連接體中包含切割位點(diǎn)序列；和在連接體中在供體與切割位點(diǎn)序列和受體與切割位點(diǎn)序列的至少一個(gè)之間包含間隔 子，由此供體與受體之間的電子耦合得到增加。
19.權(quán)利要求18的方法，其中構(gòu)造物是基于蛋白質(zhì)的構(gòu)造物，并且連接體是肽序列。
20.權(quán)利要求18的方法，其中切割位點(diǎn)序列包括SNARE蛋白或其片段或突變蛋白，以及 其中間隔子包含至少5個(gè)氨基酸。
21.權(quán)利要求18的方法，其中間隔子包括選自(GGGGS)n和(EAAAK)η的序列，其中η是 1至3。
22.權(quán)利要求18的方法，其中間隔子通過(guò)減少供體與受體之間的三級(jí)結(jié)構(gòu)的距離來(lái)增 加供體與受體之間的電子耦合。
23.權(quán)利要求18的方法，其中間隔子通過(guò)提供供體與受體之間的電子躍遷來(lái)增加供體 與受體之間的電子耦合。
24.權(quán)利要求18的方法，其中將測(cè)定用于完整細(xì)胞。
25.用于檢測(cè)肉毒桿菌神經(jīng)毒素的方法，所述方法包括，a)提供權(quán)利要求1的構(gòu)造物，其中連接體是待檢測(cè)的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的底物蛋白或 其可切割片段，b)將構(gòu)造物在肉毒桿菌神經(jīng)毒素在其下可切割底物蛋白或其片段的條件下暴露于懷 疑含有肉毒桿菌神經(jīng)毒素的樣品，和c)在將構(gòu)造物暴露于樣品之前和之后檢測(cè)和比較FRET信號(hào)，其中FRET的減少表明樣 品中存在肉毒桿菌神經(jīng)毒素。
全文摘要
分子構(gòu)造物包含供體標(biāo)記、受體標(biāo)記、位于供體與受體之間的連接體肽、具有切割位點(diǎn)序列和(a)供體與切割位點(diǎn)序列和(b)受體與切割位點(diǎn)序列的至少一個(gè)之間的間隔子的連接體。優(yōu)選，構(gòu)造物選自CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP和CFP-(SGLRSRA)-小突觸泡蛋白-(SNS)-YFP。在優(yōu)選實(shí)施方案中，連接體肽是肉毒桿菌神經(jīng)毒素的底物，其選自小突觸泡蛋白(VAMP)、突觸融合蛋白和SNAP-25或其可被肉毒桿菌神經(jīng)毒素識(shí)別和切割的片段。有利地，相對(duì)于無(wú)間隔子的構(gòu)造物，間隔子增加了供體標(biāo)記與受體標(biāo)記之間的電子耦合。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101932936SQ200880115966
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
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