專利名稱：檢測和/或鑒定金黃色葡萄球菌的反應培養(yǎng)基的制作方法
檢測和/或鑒定金黃色葡萄球菌的反應培養(yǎng)基本發(fā)明涉及特異于金黃色葡萄球菌的反應培養(yǎng)基。其還涉及使用這種培養(yǎng)基檢測 和/或鑒定金黃色葡萄球菌的方法。葡萄球菌屬的大多數(shù)物種是人類機會致病菌，其在由于外傷或由于直接植入醫(yī)學 產(chǎn)品所導致的皮膚損傷類事件中呈現(xiàn)很高風險。在葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)毫無疑問是致病性最 強的物種，因為其產(chǎn)生大量胞外酶和毒素。其可以是導致許多各種各樣的病理狀況的原因， 從簡單的甲溝炎到最嚴重的感染諸如敗血病、心內(nèi)膜炎、肺病或者骨關節(jié)感染，對此的預后 不是非常樂觀的。其可常見于必須接受涉及諸如注射器或?qū)Ч艿仍O備的住院治療的患者。 因此對于這個日益增加的牽涉到院內(nèi)疾病的病原菌之存在的檢測具有很大價值。在細菌學中，常規(guī)是將特征在于產(chǎn)生凝固酶的金黃色葡萄球菌物種與稱為“凝固酶陰性”的其它物種對比。區(qū)分金黃色葡萄球菌和非葡萄球金黃色菌的常規(guī)方法是基于對 游離凝固酶和脫氧核糖核酸酶的搜尋，以及基于乳膠上凝集反應的獲取，其目的在于證實 纖維蛋白原親和因子、A蛋白和莢膜抗原的存在。然而，其它的潛在病原性葡萄球菌物種能 表達凝固酶。也有技術可在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)從而可以評估金黃色葡萄球菌的存在，如高鹽 Chapman培養(yǎng)基(含有7. 5% NaCl)，其通常對金黃色葡萄球菌和水解甘露醇的葡萄球菌是 選擇性的，以及Baird Parker培養(yǎng)基(含有亞碲酸鉀和氯化鋰作為選擇劑)，其用于分離及 計數(shù)食品中的凝固酶陽性葡萄球菌并使得證實卵磷脂酶活性成為可能。然而，這些技術缺 乏靈敏性(檢測到少量存在于待測生物學樣品中的所搜尋物種的能力)以及特別是缺乏特 異性(在含有其它物種的待測生物學樣品中檢測所搜尋物種的能力)并且僅可給出推定性 診斷，需要其它確認測試。但是，鑒定金黃色葡萄球菌所必需的額外操作增加了分析時間及 成本。它們需要眾多的試劑及有資格的人員的參與。也可以使用含有酶底物特別是磷酸酶及/或β-葡糖苷酶或者α-葡糖苷酶的底 物的培養(yǎng)基。例如可以提及的是顯色培養(yǎng)基CHROMagar (商標)Staph. Aureus，其使得分離 葡萄球菌及通過顯色底物鑒定金黃色葡萄球菌成為可能，所述底物使金黃色葡萄球菌顯示 淡紫色著色(Gaillot O.et al.，2000. J. Clin. Microbiol. 38，4，1587-1591)。同一屬的其 它物種繼而在理論上可由藍色或無色著色所檢測。該鑒定本質(zhì)上是基于磷酸酶、葡糖 苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及半乳糖苷酶活性，也基于抑制劑去鐵胺的存在，去鐵胺使 得區(qū)分金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)成為可能。然而， 金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的區(qū)分并不完全，因為這兩個物種在CHROMagar (商標)培 養(yǎng)基上產(chǎn)生相同顏色的菌落。這是由于磷酸酶底物缺乏特異性所致，該底物對于金黃色葡 萄球菌和表皮葡萄球菌均是陽性的，以及由于去鐵胺對于表皮葡萄球菌僅僅是部分抑制這 一事實。也可以如專利申請WO 02/079486所述使用α -葡糖苷酶底物。如此，則僅利 用對α-葡糖苷酶活性的檢測即可將金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌 (Staphylococcus saprophyticus)分開，它們是三種臨床分離的主要葡萄球菌物種。然而，雖然具有含吲哚酚核的生色團的α-葡糖苷酶底物非常適合用于固體培養(yǎng)基中，它們在液 體培養(yǎng)基中的應用卻是會產(chǎn)生問題的，因為該著色在液體培養(yǎng)基中并不擴散。令人驚奇地是，本發(fā)明人已證實使用一或多種核糖苷酶(ribosidase)底物可使 快速、簡易地鑒定金黃色葡萄球菌成為可能。特別是，一或多種核糖苷酶底物與代謝調(diào)節(jié)物 和/或另一種代謝指示物的組合使用可使區(qū)分金黃色葡萄球菌和其它葡萄球菌物種成為 可能。在介紹本發(fā)明前，先給出下述定義以使本發(fā)明能夠被更清楚的理解。 它們決不具 限制性的。術語^^^意指包含微生物的代謝表達和/或生長所必需的所有元素的培 養(yǎng)基。該反應培養(yǎng)基可以是固體、半固體或液體。術語“固體培養(yǎng)基”意指，例如一種凝膠培 養(yǎng)基。瓊脂是微生物學中培養(yǎng)微生物的常規(guī)膠凝劑，但也可以使用明膠或瓊脂糖。有些配 制品是可商購的，如例如Columbia瓊脂、Trypticase-soy瓊脂、MacConkey瓊脂、Sabouraud 瓊脂，或者更普遍地，在Handbook of Microbiological Media (CRC Press)中所描述的那 些。所述反應培養(yǎng)基可以包含一種或多種元素組合，如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、 核苷酸、礦物質(zhì)、維生素等。該培養(yǎng)基也可包含著色劑。作為指示，可以提及的用作著色劑 的有Evans藍、中性紅、綿羊血、馬血、遮光劑(opacifiant)如氧化鈦、硝基苯胺、孔雀綠、亮 綠、一種或多種代謝指示物、一種或多種代謝調(diào)節(jié)物等。所述反應培養(yǎng)基可以是揭示性培養(yǎng)基(milieu de r6V6lation)，或者培養(yǎng)性及揭 示性培養(yǎng)基。在第一種情況中，微生物在接種前已被培養(yǎng)，在第二種情況中，檢測和/或鑒 定培養(yǎng)基也構成培養(yǎng)性培養(yǎng)基。本領域技術人員也可以使用雙平板(bi-boite)，使得可以便利地比較兩種包含各 種底物或各種選擇性混合物的培養(yǎng)基，其上沉積了相同的生物學樣品。術語“代謝調(diào)節(jié)物”意指調(diào)節(jié)微生物生長的任何化合物。這種代謝調(diào)節(jié)物可以特別 是糖苷酶(osidase)調(diào)節(jié)物，選擇性化合物，特別如氯化鋰、亞碲酸鉀或者氯化鈉，或者選 擇性化合物的混合物，抗生素，一或多種抗生素和/或一或多種抗真菌劑的混合物，任選包 含一種或多種內(nèi)酰胺，一種或多種氨基葡糖苷，一種或多種糖肽，一種或多種喹諾酮， 一種或多種多肽，兩性霉素，一種或多種吡咯化合物，其使得可以促進金黃色葡萄球菌的檢 測，促進金黃色葡萄球菌細菌生長的抑制劑，特別如氯化鋰(LiCl)，疊氮化鈉(NaN3)，粘菌 素，兩性霉素，氨曲南(AztrSonam)，粘桿菌素(Colimicine)，氯化鈉(NaCl)，去鐵胺，以及 弧菌抑制化合物0/129。優(yōu)選地，依據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基包含用于促進金黃色葡萄球菌生長和/或抑制其它 微生物物種生長的選擇性混合物。這種混合物優(yōu)選包含氯化鋰、弧菌抑制化合物0/129、氨 曲南和兩性霉素。術語“代謝糖苷酶調(diào)節(jié)物”特別是意指在反應培養(yǎng)基中可以誘導或抑制一種或多 種糖苷酶活性表達的化合物。優(yōu)選地，代謝調(diào)節(jié)物的濃度在0. 5mg/l和75g/l之間。術語“代謝指示物”意指能證實微生物的存在的任意化合物。這種代謝指示物可以 特別是底物，如核糖苷酶底物，或者除了 核糖苷酶底物之外的底物，如特別是糖苷酶底物，酯酶底物或者肽酶底物，更特別地是β -葡糖苷酶和/或β -半乳糖苷酶和/或β -葡 糖醛酸糖苷酶和/或磷酸酶底物，由此促進金黃色葡萄球菌的檢測。該培養(yǎng)基也可以包含 一種或多種不同于β-核糖苷酶底物的代謝指示物，如底物的組合。本領域技術人員會根 據(jù)所希望鑒定的微生物而調(diào)整底物濃度。優(yōu)選地，底物濃度在5-1000mg/l之間，優(yōu)選在 50-400mg/l 之間。術語底 意指可以被如β -核糖苷酶的酶水解以便產(chǎn)生能使直接或間接檢測微 生物成為可能的產(chǎn)物的分子。這種底物特別包括特異于待揭示酶活性的第一部分和作為標 記的第二部分，其此后稱作標記部分。這種標記部分可以是生色的、產(chǎn)生熒光的、發(fā)光的，等寸。術語“ β -核糖苷酶底物”特別是意指2-羥苯基-β -D-核糖苷(兒茶酚-β -D-核 糖苷 )；品紅-β-D-核糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；二羥基黃 酮-β -D-核糖苷；Χ-β -D-核糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β -D-核糖苷)；粉 紅-β -D-核糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β -D-核糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-β -D-核糖 苷；5-溴-3-吲哚氧基-β -D-核糖苷；6-氟-3-吲哚氧基-β -D-核糖苷；菌素-β -D-核 糖苷；(P)-硝基苯基-β-D-核糖苷；4-甲基傘形酮基-β-D-核糖苷(4-methyl-umbellif eryl-β -D-riboside)；萘酚-β -D-核糖苷；二氯氨基苯基-β -D-核糖苷。優(yōu)選地，本發(fā)明培養(yǎng)基中β-核糖苷酶底物的濃度在25-1000mg/l之間，更優(yōu)選為 在 50-400mg/l 之間。術語“ β -葡糖苷酶底物”特別是意指2-羥苯基-β -D-葡糖苷(兒茶酚-β -D-葡 糖苷)；品紅-β-D-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷)；二羥基黃 酮-β -D-葡糖苷；Χ-β -D-葡糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β -D-葡糖苷)；粉 紅-β -D-葡糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β -D-葡糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-β -D-葡糖 苷；5-溴-3-吲哚氧基- β -D-葡糖苷；6-氟-3-吲哚氧基- β -D-葡糖苷；茜素- β -D-葡 糖苷；(P) _硝基苯基_ β -D-葡糖苷；4-甲基傘形酮基-β -D-葡糖苷；萘酚苯甲 基-β-D-葡糖苷(Naphtholbenzein-β -D-glucoside)；吲哚氧基-N-甲基-β-D-葡糖 苷；5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-β -D-葡糖苷；8-羥基喹啉-β -D-葡糖苷；萘 酚-β-D-葡糖苷。優(yōu)選地，本發(fā)明培養(yǎng)基中β-葡糖苷酶底物的濃度在25-1000mg/l之間，更優(yōu)選在 50-400mg/l 之間。術語“β-半乳糖苷酶底物”特別是意指2-羥苯基-β-D-半乳糖苷(兒茶 酚-β -D-半乳糖苷)；品紅-β -D-半乳糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β -D-半 乳糖苷)；二羥基黃酮-D-半乳糖苷；Χ-β-D-半乳糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧 基-β-D-半乳糖苷)；粉紅-β-D-半乳糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷)； 6-溴-3-吲哚氧基-β -D-半乳糖苷；5-溴-3-吲哚氧基-β -D-半乳糖苷；6-氟-3-吲哚 氧基-β -D-半乳糖苷；菌素-β -D-半乳糖苷；⑵-硝基苯基-β -D-半乳糖苷；4-甲基傘 形酮基- β -D-半乳糖苷；萘酚苯甲基- β -D-半乳糖苷；Π引哚氧基-N-甲基- β -D-半乳糖 苷；5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基- β -D-半乳糖苷；8-羥基喹啉- β -D-半乳糖苷； 萘酚-β-D-半乳糖苷。優(yōu)選地，本發(fā)明培養(yǎng)基中β-半乳糖苷酶底物的濃度在25-1000mg/l之間，更優(yōu)選在 50-400mg/l 之間。術語金黃餼葡萄球菌意指金黃餼葡萄球菌的仵何菌株,包括抗性菌株如MRSA (甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌)、MSSA、GISA、VISA或VRSA (分別為糖肽中間體、萬古霉素中 間體或者萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌)。術語意指來源于生物學流體樣本的臨床樣品，或者來源于任何類型食 物的食物樣品。此樣品因此可以是液體或者固體，可以提及而無限制意義的有臨床血液、血 漿、尿或者糞便樣品，鼻、喉、皮膚、傷口或者腦脊液樣本，食品樣品，其來自水、來自飲料如 奶或者果汁、來自酸奶、來自肉、來自蛋、來自蔬菜、來自蛋黃醬、來自干酪；來自魚等，來源 于動物飼料的食品樣品，特別如來自動物食物的樣品。在這個方面，本發(fā)明涉及用于鑒別金 黃色葡萄球菌特征的反應培養(yǎng)基，其包含是β“核糖苷酶底物的代謝指示物組合至少一種 其它代謝指示物和/或至少一種代謝調(diào)節(jié)物。本發(fā)明還涉及是β -核糖苷酶底物的代謝指示物組合另一種代謝指示物和/或代 謝調(diào)節(jié)物在鑒定金黃色葡萄球菌中的應用。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案，所述代謝調(diào)節(jié)物選自糖苷酶活性的調(diào)節(jié)物，選擇 性化合物，特別如氯化鋰、亞碲酸鉀或氯化鈉，或者選擇性化合物的混合物，抗生素或者一 或多種抗生素和/或一或多種抗真菌劑的混合物，特別如一種或多種β “內(nèi)酰胺，一種或多 種氨基葡糖苷，一種或多種糖肽，一種或多種喹諾酮，一種或多種多肽，兩性霉素，吡咯化合 物，單獨或者與一種或多種選擇性化合物組合。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案，所述其它代謝指示物是酶底物，優(yōu)選是糖苷酶、酯 酶、肽酶、葡糖苷酶和/或半乳糖苷酶底物。根據(jù)一個更優(yōu)選的實施方案，所述其 它代謝指示物選自β _葡糖苷酶和/或β _半乳糖苷酶底物。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案，所述核糖苷酶底物選自2-羥苯基-β-D-核 糖苷(兒茶酚-β -D-核糖苷)；品紅-β -D-核糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β -D-核 糖苷)；二羥基黃酮_ β -D-核糖苷；X- β -D-核糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β -D-核糖 苷)；粉紅-β-D-核糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-β-D-核糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-β-D-核 糖苷；5_溴-3-吲哚氧基-β -D-核糖苷；6-氟-3-吲哚氧基-β -D-核糖苷；茜素-β -D-核 糖苷；(P)“硝基苯基_ β -D-核糖苷；4-甲基傘形酮基-β -D-核糖苷。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案，所述β -核糖苷酶底物是兒茶酚- β -D-核糖苷。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案，所述核糖苷酶底物是Χ_β-D-核糖苷 (5-溴-4-氯_3_吲哚氧基-β -D-核糖苷)。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案，所述反應培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案，所述反應培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。在這種情況中， 所述β “核糖苷酶底物優(yōu)選為兒茶酚-D-核糖苷，因為其允許在大約18小時內(nèi)檢測/ 鑒定金黃色葡萄球菌。本發(fā)明還涉及一種檢測和/或鑒定金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于其包括下 述步驟或者由下述步驟組成a)提供如上述所定義的反應培養(yǎng)基，b)用待測生物學樣品接種該培養(yǎng)基，C)使之溫育，并
d)鑒定金黃色葡萄球菌的存在。本方法還可以包含確認步驟。此確認步驟可以特別是生物化學、免疫學或者分子
學鑒定。微生物接種可以用本領域技術人員已知的任何接種技術進行。溫育步驟可以在所 希望檢測的酶活性的表達是最佳的溫度下進行，所述溫度可由本領域技術人員根據(jù)待測酶 活性而容易地選擇。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案，在步驟c)中，允許溫育時間在16-48小時之間，優(yōu) 選在18-24小時之間。
步驟d)可以通過視覺檢查、通過比色法或通過熒光測定法進行。對一種或多種抗生素具有獲得性抗性的金黃色葡萄球菌菌株，特別是MRSA (甲氧 西林抗性金黃色葡萄球菌菌株)、GISA (糖肽中間體金黃色葡萄球菌菌株),VISA (萬古霉素 中間體金黃色葡萄球菌菌株)、VRSA (萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌菌株)和其它抗性表型 可以通過加入適當?shù)目股囟鴻z測，所述抗生素特別選自內(nèi)酰胺、頭孢菌素、糖肽、氨 基葡糖苷、喹諾酮、多肽等。下述實施例是作為解釋而給出，其實質(zhì)上不以任何方式進行限制。它們使得能夠 更清楚地理解本發(fā)明。實驗1 用于鑒別金黃餼葡萄球菌特點的β -D-核糖苷酶的底物之評估以下培養(yǎng)基在200ml Columbia瓊脂基礎(Oxoid)中制備，其組合了生色β _D_核
糖苷酶底物。用于該培養(yǎng)基中的各種底物及濃度和附加物如下表1中所述 所用生色β -D-核糖苷酶底物的縮寫和濃度β -D-核糖苷酶底物溶解在DMSO中并加入培養(yǎng)基中以獲得表1所示濃度。191個細菌菌株以0. 5MacFarland的懸液稀釋至1/1000接種到每個培養(yǎng)基上。培 養(yǎng)皿置于37°C溫育，繼而讀數(shù)。培養(yǎng)基分配到Petri培養(yǎng)皿中，然后用大約100000CFU接種，繼而在37°C溫育48 小時。在溫育18、24和48小時后目測所形成的菌落。191個菌株原種包括79個MRSA，48個葡萄球菌種，61個腸球菌種和3個α -溶 血性鏈球菌。
獲得的結果在下表中示出。 MJ,各種β "Ο"核糖苷酶底物的評估所有培養(yǎng)基均能清楚地檢測金黃色葡萄球菌。包含底物兒茶酚-D-核糖苷或者X-β _核糖苷的反應培養(yǎng)基最具特異性且最 靈敏，因為對兒茶酚- β -D-核糖苷僅溫育18小時后以及對于X-β -D-核糖苷溫育24小時 后，它們就可以很好地檢測金黃色葡萄球菌(MRSA和MSSA)，且在凝固酶陰性葡萄球菌中僅 有3%的假陽性。含有DHF-β -D-核糖苷的培養(yǎng)基也是非常靈敏的，但是具有較少的特異性，因為 是β _核糖苷酶陽性的凝固酶陰性葡萄球菌的百分比在24小時時是68%，在48小時時是 91%。實驗2 兒茶酚-β -D-核糖苷在一種液體培養(yǎng)基中的評估以下培養(yǎng)基具有與chromID S. aureus base (bioM6rieux)相同的組成，不含選擇 劑和瓊脂以獲得液體培養(yǎng)基。底物和誘導物在高壓滅菌前用溶解在DMSO中的300ml/g兒 茶酚- β -D-核糖苷和500mg/l的檸檬酸鐵銨取代。培養(yǎng)基繼而被分配在試管中，比例為每 個試管1. 5ml。對于這種培養(yǎng)基，用在37°C準備了 24小時的預培養(yǎng)物接種。制備0. 5McF的生理 鹽水懸液，繼而用10 μ 1細菌懸液接種每個試管。在37°C溫育24和48小時后讀數(shù)。總共11個葡萄球菌菌株被測試5個金黃色葡萄球菌和6個葡萄球菌屬其它物種 (凝固酶陰性)。所得結果記錄在下表3中。 兒茶酚- β -D-核糖苷在液體培養(yǎng)基中的評估在固體培養(yǎng)中獲得的并顯示兒茶酚- β -D-核糖苷對金黃色葡萄球菌的高特異性 的結果也在液體培養(yǎng)基中獲得確認在18小時起觀察到金黃色葡萄球菌100%著色，而葡 萄球菌屬其它物種無一被檢測到。實驗3 對于用底物兒茶酚_ β -D-核糖苷和X- β -D-核糖苷對廣泛的葡萄球菌屬 菌種獲得的結果的確認為了確認包含底物兒茶酚-β -D-核糖苷或者底物X-β -D-核糖苷的反應培養(yǎng)基 的相關性，還進行了下述實驗兒茶酚-β-D-核糖苷使用補加了 300mg/l兒茶酚-β -D-核糖苷、然后高壓滅菌 且含有500mg/l檸檬酸鐵銨的GTS培養(yǎng)基(bi0M6rieux)，此培養(yǎng)基被分配于直徑55mm的 Petri培養(yǎng)皿中。X-β-D-核糖苷使用修改的Chapman培養(yǎng)基，其不含NaCl、高壓滅菌并補加 60mg/l的X- β -D-核糖苷，此培養(yǎng)基被分配于直徑55mm的Petri培養(yǎng)皿中。對于這兩種培養(yǎng)基，用37°C準備了 24h的預培養(yǎng)物接種。制備0. 5McF的在生理鹽 水中的懸液，然后用10μ 1的已校準接種環(huán)將每個菌株接種到培養(yǎng)皿上。在37°C溫育24和48小時后讀數(shù)。總共90個葡萄球菌被測試34個金黃色葡萄球菌，包括25個MRSA，及46個葡 萄球菌其它物種(包括施氏葡萄球菌(S. schleiferi)；頭狀葡萄球菌(S. capitis)；豬葡 萄球菌(S. hyicus)；中間葡萄球菌(S. intermedius)；溶血葡萄球菌(S. haemolyticus)； 耳葡萄球菌(S. auricularis)；人葡萄球菌(S. hominis)；沃氏葡萄球菌(S. warneri)；產(chǎn) 色葡萄球菌(S. chromogenes)；科氏葡萄球菌(S. cohnii)；表皮葡萄球菌；松鼠葡萄球菌 (S. sciuri)；木糖葡萄球菌(S. xylosus)；腐生葡萄球菌)。獲得的結果記錄在表4中。 ΜΛ 底物兒茶酚_ β -D-核糖苷和X- β -D-核糖苷對廣泛葡萄球菌菌株的評估這個測試的結果顯示出這兩個底物從18小時開始對金黃色葡萄球菌的良好特異性。具體來說，在葡萄球菌屬的13個其它物種中，僅4個非常次要的物種顯出著色。 這些是物種腐生葡萄球菌，木糖葡萄球菌，科氏葡萄球菌和松鼠葡萄球菌，其全部4個 一起僅代表了 4. 4%的臨床標本中所發(fā)現(xiàn)的葡萄球菌菌株，相比于金黃色葡萄球菌所占 的 23.3% (Kawamura et al. ,1998, Distribution of Staphylococcus species among human clinical specimens andemended description of Staphylococcus caprae. J. Clin Microbial. 36 :2038_2042)。實駘4 通過直接檢測凝膠培養(yǎng)基中β -D-核糖苷酶活性及另一糖苷酶活性來區(qū) 分金黃色葡萄球菌與同一屬的其它物種以下培養(yǎng)基在高壓滅菌的修改的Chapman培養(yǎng)基中制備，不含NaCl，并組合了 β -核糖苷酶生色底物以及一種或兩種其它代謝指示物的組合，即除了檢測β “核糖苷酶 活性之外的一種或兩種生色底物。這些底物組合在下表中給出 核糖苷酶生色底物和特異于其它酶活性的生色底物的各種組合的縮寫所述各種底物溶解在DMSO中并加入培養(yǎng)基中。對于含有底物藍色-β _半乳糖苷的培養(yǎng)基，加入溶解在滲透水中的IPTG以獲得 lmg/1的濃度。所述培養(yǎng)基被分配于直徑55mm的Petri培養(yǎng)皿中，并用在37°C準備了 24h的預培 養(yǎng)物接種。制備0. 5McF的在生理鹽水中的懸液，然后用10 μ 1已校準的接種環(huán)將每個菌株 接種到培養(yǎng)皿上。在37°C溫育18、24和48小時后讀數(shù)?？偣?8個葡萄球菌菌株被測試5個MRSA和3個金黃色葡萄球菌，4個腐生葡萄 球菌，4個科氏葡萄球菌，4個木糖葡萄球菌，4個松鼠葡萄球菌，2個表皮葡萄球菌以及2個 溶血葡萄球菌。在下表中，C代表溫育后菌落著色，I代表這種著色的強度以及IT定義溫育時間。 著色強度是任意標度并可以由如下方式定義
·符號“-”相應于活性缺失· 0. 1相應于存在痕量著色· 0. 5相應于存在非常淺的著色· 1相應于存在弱強度的清晰著色 · 1. 5相應于存在介于著色1和2之間的中間態(tài)著色· 2相應于存在中等強度的清晰著色· 2. 5相應于存在介于著色2和3之間的中間態(tài)著色· 3相應于存在強著色· 3. 5相應于存在介于著色3和4之間的中間態(tài)著色· 4相應于存在非常強的著色測試結果見如下 B:底物各種組合的評估上述結果顯示溫育18小時起可以用底物組合來區(qū)分金黃色葡萄球菌與表達β -D-核糖苷酶的其它葡萄球菌物種。在48小時時僅1個腐生葡萄球菌菌株產(chǎn)生問題，但是在溫育24小時時無混淆，因 為金黃色葡萄球菌已經(jīng)有很好的著色強度。實驗5 在選擇性培養(yǎng)基上通過其β -核糖苷酶活性檢測MRSA使用修改的Chapman培養(yǎng)基并將其分配到直徑55mm的Petri培養(yǎng)皿中，所述修改 的Cha pman培養(yǎng)基不含NaCl、已經(jīng)高壓滅菌并補加了 100mg/l的X-β -D-核糖苷并且是選 擇性的，即包含代謝抑制調(diào)節(jié)物(LiCl，弧菌抑制化合物0/129、氨曲南和兩性霉素)用于抑 制MSSA和大多數(shù)其它葡萄球菌物種。底物在加入到培養(yǎng)基中之前溶解于DMSO中。用在37°C準備了 24小時的預培養(yǎng)物進行接種。制備0. 5McF的在生理鹽水中的懸 液，然后用10μ 1的已校準的接種環(huán)將每個菌株接種到培養(yǎng)皿上。在37°C溫育24和48小時后讀數(shù)。總共15個葡萄球菌菌株被測試5個MRSA和2個MSSA，4個表皮葡萄球菌，1個科 氏葡萄球菌，4個松鼠葡萄球菌和2個腐生葡萄球菌。結果記錄在下表7中。 在選擇性培養(yǎng)基上通過其β -核糖苷酶活性檢測MRSA上述結果顯示，在選擇性培養(yǎng)基上，抑制MSSA和大多數(shù)其它葡萄球菌物種，可以 區(qū)分MRSA，其具有青綠色著色。在這個培養(yǎng)基上生長的其它物種在這些培養(yǎng)條件下不顯示 任何著色。
權利要求
鑒別金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的反應培養(yǎng)基，其包含是β-核糖苷酶(beta ribosidase)底物的代謝指示物與至少一種其它代謝指示物和/或至少一種代謝調(diào)節(jié)物的組合。
2.權利要求1的反應培養(yǎng)基，其中所述代謝調(diào)節(jié)物選自糖苷酶(osidase)調(diào)節(jié)物、選擇 性化合物或者選擇性化合物的混合物、抗生素或者一或多種抗生素和/或一或多種抗真菌 劑的混合物。
3.權利要求1或2的反應培養(yǎng)基，其中所述其它代謝指示物是酶底物，優(yōu)選糖苷酶、酯 酶、肽酶、0 -葡糖苷酶和/或0 _半乳糖苷酶底物。
4.權利要求3的反應培養(yǎng)基，其中所述酶底物選自0-葡糖苷酶和/或0 -半乳糖苷 酶底物。
5.權利要求1-4任一項的反應培養(yǎng)基，其中所述核糖苷酶底物是呋喃核糖苷 _ (beta ribofuranosidase)帛―。
6.權利要求1-5任一項的反應培養(yǎng)基，其中所述核糖苷酶底物是選自如下 的底物2_羥苯基-0-D-呋喃核糖苷(兒茶酚-3-D-核糖苷)；品紅-3-D-核糖苷 (5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-0 -D-核糖苷)；二羥基黃酮-0 -D-核糖苷；X-0 -D-核糖 苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-3-D-核糖苷)；粉紅-3-D-核糖苷(6-氯-3-吲哚氧 基-D-核糖苷)；6-溴-3-吲哚氧基-D-核糖苷；5-溴-3-吲哚氧基-D-核糖 苷；6-氟-3-吲哚氧基-3 -D-核糖苷；菌素-3 -D-核糖苷；⑵-硝基苯基-3 -D-核糖苷； 4-甲基傘形酮基_ 0 -D-核糖苷；萘酚-0 -D-核糖苷；二氯氨基苯基-0 -D-核糖苷。
7.權利要求6的反應培養(yǎng)基，其中所述0-呋喃核糖苷酶底物是2-羥苯基-D-呋 喃核糖苷。
8.權利要求6的反應培養(yǎng)基，其中所述0-核糖苷酶底物是5-溴-4-氯-3-吲哚氧 基-3-D-核糖苷。
9.是核糖苷酶底物的代謝指示物與至少一種其它代謝指示物和/或至少一種代謝 調(diào)節(jié)物的組合用于鑒別金黃色葡萄球菌特征的應用。
10.權利要求9的應用，其中所述核糖苷酶底物是呋喃核糖苷酶底物。
11.權利要求9或10的應用，其中所述核糖苷酶底物是選自如下的底物2_羥苯 基-0 -D-呋喃核糖苷(兒茶酚-0 -D-核糖苷)；品紅-0 -D-核糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚 氧基-0 -D-核糖苷)；二羥基黃酮-0 -D-核糖苷；X- 0 -D-核糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧 基-3 -D-核糖苷)；粉紅-3 -D-核糖苷(6-氯-3-吲哚氧基-3 -D-核糖苷)；6-溴-3-吲 哚氧基_ 0 -D-核糖苷；5-溴-3-吲哚氧基-0 -D-核糖苷；6-氟-3-吲哚氧基-0 -D-核糖 苷；菌素-0 -D-核糖苷；⑵-硝基苯基-3 -D-核糖苷；4-甲基傘形酮基_ 3 -D-核糖苷； 萘酚_ 3 -D-核糖苷；二氯氨基苯基_ 3 -D-核糖苷。
12.權利要求11的應用，其中所述底物是5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-D-核糖苷。
13.權利要求11的應用，其中所述底物是2-羥苯基-3-D-呋喃核糖苷。
14.一種檢測和/或鑒定金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于其包括下述步驟a)提供權利要求1-8任一項的反應培養(yǎng)基，b)用待測生物學樣品接種該培養(yǎng)基，c)允許溫育，以及d)鑒別金黃色葡萄球菌的存在。
15.權利要求14的方法，其特征在于其還包括確認步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒別金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的反應培養(yǎng)基，其包含是β-核糖苷酶底物的代謝指示物與至少一種其它代謝指示物和/或至少一種代謝調(diào)節(jié)物的組合。本發(fā)明還涉及檢測和/或鑒定金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于其包括下述步驟a)提供一種反應培養(yǎng)基，其包含是β-核糖苷酶底物的代謝指示物與至少一種其它代謝指示物和/或至少一種代謝調(diào)節(jié)物的組合，b)用待測生物學樣品接種該培養(yǎng)基，c)允許溫育，以及d)鑒別金黃色葡萄球菌的存在。
文檔編號G01N33/569GK101874118SQ200880117604
公開日2010年10月27日 申請日期2008年11月25日 優(yōu)先權日2007年11月26日
發(fā)明者D·哈利米, J·佩里, S·歐倫加 申請人:生物梅里埃公司